Summary
Este protocolo permite una comparación directa entre la resistencia planctónica y la de biopelícula para una cepa bacteriana que puede formar una biopelícula in vitro utilizando una placa de microtíter de 96 pozos. Las bacterias planctónicas o de biopelículas están expuestas a diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección. La viabilidad se ensa prueba por el crecimiento en placas de agar.
Abstract
Este protocolo permite una comparación directa entre la resistencia planctónica y la de biopelícula para una cepa bacteriana que puede formar una biopelícula in vitro. Las bacterias se inoculan en los pozos de una placa de microtíter de 96 pozos. En el caso del ensayo planctónico, se añaden diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección a las suspensiones bacterianas. En el ensayo de biopelícula, una vez inoculadas, las bacterias se dejan formar una biopelícula durante un período de tiempo determinado. Las células no unidas se eliminan de los pocillos, se reponen los medios y se añaden diluciones en serie del agente antimicrobiano de elección. Después de la exposición al agente antimicrobiano, las células planctónicas se ensayan para el crecimiento. Para el ensayo de biopelícula, el medio se actualiza con medios frescos que carecen del agente antimicrobiano y las células de la biopelícula se dejan recuperar. La viabilidad de las células de biopelículas se ensaya después del período de recuperación. El MBC-P para el agente antimicrobiano se define como la concentración más baja de droga que mata las células en el cultivo planctónico. En contraste, el MBC-B para una cepa se determina exponiendo biopelículas preformadas a concentraciones crecientes de agente antimicrobiano durante 24 horas. El MBC-B se define como la concentración más baja de agente antimicrobiano que mata las células en el biofilm.
Introduction
Los ensayos de resistencia a los antibióticos se desarrollaron inicialmente para probar la resistencia de los cultivos planctónicos (de natación libre) de bacterias. Dado que muchas infecciones bacterianas involucran biopelículas (células adheridas a la superficie), estábamos interesados en desarrollar un método para ensayar la resistencia a los antibióticos específicos de la biopelícula. Sin embargo, la mayoría de los ensayos de resistencia a los antibióticos son poco adecuados para medir la resistencia de las biopelículas. Por ejemplo, la determinación de la concentración inhibitoria mínima (MIC) es el patrón oro para determinar la resistencia a los antibióticos de los cultivos bacterianos planctónicos 1. Este ensayo implica mezclar un cultivo planctónico diluido con una serie de dilución de antibióticos. La concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento visible de las células planctónicas es el MIC. Dado que este ensayo se basa en la inhibición del crecimiento, por definición, no puede funcionar con cultivos de biopelículas, lo que requiere examinar la sensibilidad a los antibióticos de las células en una biopelícula precrecida. En lugar de medir la inhibición del crecimiento, el ensayo MBC-B descrito aquí determina la concentración de antibiótico que mata las células que ya existen en una biopelícula. Por lo tanto, este ensayo tiene como objetivo imitar los tratamientos antibióticos de las infecciones por biopelículas establecidas, y proporcionar una visión más relevante de la resistencia bacteriana a los antibióticos in vivo.
Dado que las biopelículas son generalmente más resistentes a los antibióticos que los cultivos planctónicos 2-4, fue necesario idear un método que relacione directamente la resistencia a los antibióticos de una biopelícula con la de un cultivo planctónico. Por lo tanto, otro objetivo de este método es poder comparar directamente el nivel de resistencia a los antibióticos entre las células planctónicas y de biopelículas. Los ensayos MBC-P y MBC-B descritos aquí hacen esto posible porque las células se cultivan en condiciones similares. Hemos utilizado este método para estudiar varios genes que son importantes para la resistencia a antibióticos específicos de biopelículas 5-8.
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Protocol
1. MBC-B
-
Cultivo de un biofilm (adaptado de O'Toole9).
- Cultivar un cultivo de tipo salvaje cepa de interés y cepa mutante durante 16 horas en un medio rico a 37 °C.
- Diluir los cultivos saturados durante la noche 1:100 en un medio fresco para ensayos de resistencia a los antibióticos. Un medio estándar para P. aeruginosa es el medio mínimo M63 suplementado con sulfato de magnesio y arginina (ver Tabla 1). Este medio estimula la formación de un biofilm más robusto.
- Añadir 100 μl de dilución por pozo en una antena parabólica de microtiter de 96 pozos (ver Tabla 1). Dado que estos ensayos se realizan normalmente por triplicado para cada cepa, debe haber 24 pozos de cada cepa.
- Incubar la placa de microter durante 24 horas a 37 °C.
-
Exponer la biopelícula preformada a un gradiente de concentración de antibióticos
- Prepare una serie de dilución de 10x de antibióticos para 7 pozos. Ejemplo: para el antibiótico tobramicina, las concentraciones finales en los pozos son 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 y 0,006 mg/ml 5-8. A partir de un stock de 25 mg/ml, prepare 10x diluciones de 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 y 0,06 mg/ml. Dejar en el hielo.
- Retire el sobrenadante gastado (que contiene células planctónicas) utilizando una pipeta multicanal (véase la Tabla 1).
- Agregue 90 μl M63 (Mg/Arg) a todos los pozos.
- Añadir 10 μl de cada 10x concentración de antibióticos para lograr las concentraciones finales deseadas. Añadir 10 μl de agua (sin control antibiótico) al pozo final para cada réplica y cepa.
- Incubar la placa de microter durante 24 horas a 37 °C.
-
Refrescar los medios y permitir el desprendimiento de células vivas.
- Retire el sobrenadante gastado (que contiene células planctónicas) utilizando una pipeta multicanal.
- Agregue 115 μl M63 (Mg/Arg) a todos los pozos.
- Incubar la placa de microter durante 24 horas a 37 °C.
-
Ensayo para células vivas.
- Etiquete dos placas de agar LB por placa de microtíter de 96 pozos.
- Esterilice el dispositivo multipróngo (ver Tabla 1)sumergiendo las puntas en etanol al 100% y pasando las puntas a través de la llama abierta de un quemador Bunsen. repetir. Deja que las puntas se enfríen ligeramente. Usando el dispositivo multiprong, transfiera ~3 μl (cantidad que normalmente se retiene en las puntas de las puntas) de cultivo planctónico desde cada pozo de la placa de microter a la superficie de una placa de agar LB.
- Incubar las placas de agar LB durante 16 horas a 37 °C.
- Determinar la concentración bactericida mínima del antibiótico identificando, a ojo, el corte para el crecimiento bacteriano (Figura 1).
2. MBC-P
-
Preparación de cepas bacterianas
- Cultivar un cultivo de tipo salvaje cepa de interés y cepa mutante durante 16 horas en un medio rico a 37 °C.
- Diluir los cultivos saturados durante la noche 1:100 en un medio fresco para ensayos de resistencia a los antibióticos. Un medio estándar para P. aeruginosa es el medio mínimo M63 suplementado con sulfato de magnesio y arginina (ver Tabla 1).
- Añadir 90 μl de dilución por pozo en una antena parabólica de 96 kódteres (ver Tabla 1). Dado que estos ensayos se realizan normalmente por triplicado para cada cepa, debe haber 24 pozos de cada cepa.
-
Exposición de las células planctónicas a un gradiente de concentración de antibióticos
- Preparar 10x series de dilución de antibióticos para 7 pozos. Ejemplo: para el antibiótico tobramicina, las concentraciones finales en los pozos son 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 y 0,0005 mg/ml. A partir de un stock de 25 mg/ml, preparar diluciones de 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 y 0,005 mg/ml. Dejar en el hielo.
- Añadir 10 μl de cada 10x concentración de antibióticos para lograr las concentraciones finales deseadas. Añadir 10 μl de agua (sin control antibiótico) al pozo final para cada réplica y cepa.
- Incubar la placa de microter durante 24 horas a 37 °C.
-
Ensayo para células vivas.
- Etiquete dos placas de agar LB por placa de microtíter de 96 pozos.
- Esterilice el dispositivo multipróngo (ver Tabla 1)sumergiendo las puntas en etanol al 100% y pasando las puntas a través de la llama abierta de un quemador Bunsen. repetir. Deja que las puntas se enfríen ligeramente. Usando el dispositivo multiprong, transfiera ~3 μl (cantidad que normalmente se retiene en las puntas de las puntas) de cultivo planctónico desde cada pozo de la placa de microter a la superficie de una placa de agar LB.
- Incubar las placas de agar LB durante 16 horas a 37 °C.
- Determinar la concentración bactericida mínima del antibiótico mediante la identificación, a simple vista, del corte para el crecimiento bacteriano (Figura 2).
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Representative Results
Se realizaron ensayos MBC-P y MBC-B, comparando la sensibilidad del tipo salvaje PA14 con PA14 ∆ndvB. La tobramicina se utilizó como antibiótico. Se presentan los resultados correspondientes a los pasos 1.4.4 (Figura 1) y 2.3.4 (Figura 2). PA14 y ∆ndvB fueron inoculados en los ensayos MBC-P y MBC-B por triplicado. Después de completar los pasos 1.0-1.4 del protocolo MBC-B y los pasos 2.0-2.3 del protocolo MBC-P, las células viables fueron plateadas sobre una placa de agar LB. Las concentraciones de tobramicina(μg/ml) están indicadas a la izquierda de las células. El MBC-B para PA14 es de 100 μg/ml y el MBC-B para ∆ndvB es de 12,5 μg/ml. El MBC-P para PA14 y el mutante∆ ndvB es de 8 μg/ml.
Figura 1. Resultados representativos de un ensayo mbc-b con pa14 tipo salvaje vs PA14 ∆ndvB y tobramicina. Los valores se refieren a la concentración final de tobramicina (μg/ml).
Figura 2. Resultados representativos de un ensayo mbc-p con pa14 tipo salvaje vs PA14 ∆ndvB y tobramicina. Los valores se refieren a la concentración final de tobramicina(μg/ml).
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Discussion
La resistencia a los antibióticos en las células planctónicas se define como un aumento en la concentración inhibitoria mínima (MIC) de un antibiótico debido a un cambio permanente en las células(por ejemplo, una mutación). Los mecanismos de resistencia o tolerancia específicos de la biopelícula que se han identificado hasta la fecha son el resultado de la expresión de genes de tipo salvaje dentro de las biopelículas. Por lo tanto, la definición clásica de resistencia no se aplica a las biopelículas. Sin embargo, se ha presentado otro conjunto de definiciones: los mecanismos de resistencia impiden que el antibiótico acceda a su objetivo, mientras que los mecanismos de tolerancia cierran los objetivos de los antibióticos10. Los mecanismos de resistencia a antibióticos específicos de biopelículas abarcan ambas definiciones. El término "resistencia" se ha utilizado en todo este protocolo, pero se deben llevar a cabo más experimentos para determinar si un gen está contribuyendo a la resistencia o la tolerancia.
Los ensayos MBC-P y MBC-B pueden adaptarse para cualquier cepa bacteriana formadora de biopelículas y cualquier agente antimicrobiano bactericida. Los dos criterios importantes para adaptar este ensayo a otras bacterias y otros agentes antimicrobianos son la determinación de las condiciones que conducen a la formación de biopelículas y la determinación del rango adecuado de concentraciones para el agente antimicrobiano utilizando la cepa de tipo salvaje de interés. Las condiciones adecuadas de formación de biopelículas se pueden determinar utilizando un protocolo de formación de biopelículas JoVE publicado por George O'Toole9. Con el fin de determinar un rango de concentración apropiado para el ensayo MBC-B, una buena regla general es utilizar 25 x MIC (concentración inhibitoria mínima11)como la concentración media del rango y ajustar en consecuencia. Para el ensayo MBC-P, utilice 1/10 de los valores identificados para el ensayo MBC-B. El objetivo es definir un rango de concentraciones que permita una clara diferencia entre el MBC-B de la cepa de tipo salvaje y una cepa mutante sensible. Por lo tanto, el extremo superior de la gama debe estar cerca del MBC-B de la cepa de tipo salvaje. Repetimos este experimento al menos tres veces, dando un mínimo de 9 puntos de datos por cepa.
El paso más crítico de estos ensayos es evitar la contaminación. Para evitar la contaminación entre cepas, se debe dejar una columna vacía entre cepas. Otro paso crítico es dar tiempo suficiente para que las puntas metálicas del dispositivo multiprón se enfríen lo suficiente. Esto se puede probar llamando las puntas, sincronizando el período de enfriamiento y tocando rápidamente las puntas con las manos.
Si el desprendimiento de las células de la biopelícula después de la exposición a antibióticos es un problema, el método MBC-B se puede modificar para incluir un paso de sonicación. Omita el paso 1.3.3 (incubación las 24 horas después de la adición de medios frescos). En su lugar, cubra los pozos de la placa de microter de 96 pozos después de agregar 115 μl de medios frescos (paso 1.3.2) con un sello de placa adhesiva estéril y una placa de sonicación para desalojar las células de biopelícula de las paredes de los pozos. Utilice un sonicador de baño de agua. Las condiciones específicas (tiempo, intensidad) para la eliminación eficiente de las células de biopelícula del plástico deben determinarse de antemano.
Una variación de la MBC-B se utilizó para examinar una biblioteca de 4.000 mutantes de inserción de transposones de P. aeruginosa para mutantes de resistencia a antibióticos específicos de biopelículas. Se eligió una concentración de tobramicina (50 μg/ml) que no mataría a las células de biopelículas de tipo salvaje, sino que permitiría la identificación de mutantes que eran 3 veces más sensibles que la biopelícula de tipo salvaje. En lugar de inocular columnas de pozos con una cepa específica de bacterias, cada pozo fue inoculado con un mutante diferente. Los mutantes fueron dejados para formar un biofilm, expuestos a 50 μg/ml de tobramicina, dejados para recuperarse de la exposición a la tobramicina y después ensayados para la viabilidad. Los mutantes que no sobrevivieron a 50 μexposición a la tobramicina g/ml se volvieron a examinar en las mismas condiciones de cribado. Los protocolos MBC-P y MBC-B se utilizaron para confirmar los fenotipos sensibles a la tobramicina de los mutantes.
Existen otros métodos para ensayar la resistencia a los antibióticos en biopelículas, es decir, biopelículas de colonias y biopelículas cultivadas en biorreactores12,13. Estos métodos son considerablemente más laboriosos y limitados en el número de cepas que se pueden ensayar fácilmente. Por lo tanto, una ventaja que tiene el MBC-B sobre estos otros métodos es que es de alto rendimiento, lo que permite al investigador realizar pruebas de debas o ensayar varias cepas, así como varias concentraciones diferentes de antibióticos a la vez.
| Nombre del reactivo | compañía | N° de catálogo | Comentarios (opcional) |
| 1x M63 | Preparar como culata 5x M63 disolviendo 15 g KH2PO4,35 g K2HPO4 y 10 g (NH4)2SO4 en 1 L de agua. Este stock no necesita ser autoclavado y se puede almacenar a temperatura ambiente. Diluir 5x stock 1:5, autoclave, enfriar, a continuación, añadir los componentes deseados. | ||
| KH2PO4 | pescador | P285-500 | |
| K2HPO4 | pescador | P288-500 | |
| (NH4) 2. TAN4 | sigma | A5132 | |
| Sulfato de magnesio | pescador | M63-500 | Añadir a 1 mM la concentración final. Preparar como una culata de 1 M en agua y autoclave. |
| Tobramicina | sigma | Preparar 50 mg/ml en stock. Alícuota y conservar a -20 °C. | |
| arginina | sigma | A5131 | Añadir al 0,4% la concentración final. Preparar como un 20% de stock en agua y filtrar esterilizar. Esta fuente alternativa de carbono/energía puede reemplazar a la glucosa y a los ácidos casamino |
| Placas de microter de 96 pozos | Corning | 3595 | Estéril, de fondo plano, baja evaporación |
| Tranferpette (pipeta multicanal) | BrandTech | 2703610 | 8 canales, 20-200 μl |
| Dispositivo multipróng | Dan-Kar | MC48 | 48 puntas caben en 1/2 de una placa de microtíter de 96 pozos |
Tabla 1.
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Disclosures
La autora declara que no tiene intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
El autor desea agradecer a Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz y Clayton Hall por la ayuda editorial con este manuscrito. Este ensayo se desarrolló inicialmente en el laboratorio de George O'Toole, de la Escuela de Medicina Geisel en Dartmouth. La investigación en el laboratorio del Dr. Mah está respaldada por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y Cystic Fibrosis Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
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- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
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