Summary
Detta protokoll möjliggör en direkt jämförelse mellan planktonisk och biofilmsbeständighet för en bakteriestam som kan bilda en biofilm in vitro med en 96-brunns mikrotiterplatta. Planktoniska bakterier eller biofilmsbakterier utsätts för seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet. Livskraft analyseras genom tillväxt på agarplattor.
Abstract
Detta protokoll möjliggör en direkt jämförelse mellan planktonisk och biofilmsresistens för en bakteriestam som kan bilda en biofilm in vitro. Bakterier vaccinerar sig i brunnarna på en 96-brunns mikrotiterplatta. När det gäller planktonisk analys tillsätts seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet till bakteriella suspensioner. I biofilmstestet, när de väl har vaccinelats, lämnas bakterierna att bilda en biofilm under en viss tidsperiod. Obundna celler avlägsnas från brunnarna, mediet fylls på och seriella utspädningar av det antimikrobiella medlet läggs till. Efter exponering för det antimikrobiella medlet analyseras planktoniska celler för tillväxt. För biofilmsanalysen uppdateras mediet med färska medier som saknar det antimikrobiella medlet och biofilmscellerna lämnas att återhämta sig. Biofilmcellens livskraft analyseras efter återhämtningsperioden. MBC-P för det antimikrobiella medlet definieras som den lägsta koncentrationen av läkemedel som dödar cellerna i planktoniska kulturen. Däremot bestäms MBC-B för en stam genom att exponera förformade biofilmer för ökande koncentrationer av antimikrobiellt medel i 24 timmar. MBC-B definieras som den lägsta koncentrationen av antimikrobiellt medel som dödar cellerna i biofilmen.
Introduction
Antibiotikaresistens analyser utvecklades ursprungligen för att analysera resistens av planktoniska (fri simning) kulturer av bakterier. Eftersom många bakteriella infektioner involverar biofilmer (ytanslutna celler) var vi intresserade av att utveckla en metod för att analysera biofilmsspecifik antibiotikaresistens. De flesta antibiotikaresistensanalyser är dock dåligt lämpade för att mäta biofilmsresistens. Att till exempel bestämma den minimala hämmande koncentrationen (MIC) är guldstandarden för bestämning av antibiotikaresistens hos planktoniska bakteriekulturer 1. Denna analys innebär att blanda en utspädd planktonisk kultur med en utspädningsserie av antibiotika. Koncentrationen av antibiotika som hämmar den synliga tillväxten av planktoniska celler är MIC. Eftersom denna analys förlitar sig på hämning av tillväxt, kan den per definition inte fungera med biofilmkulturer, vilket kräver att man undersöker cellernas antibiotikakänslighet i en pregrown biofilm. I stället för att mäta tillväxthämning bestämmer MBC-B-analysen som beskrivs här koncentrationen av antibiotika som dödar celler som redan finns i en biofilm. Således syftar denna analys till att efterlikna antibiotikabehandlingar av etablerade biofilminfektioner och ge en mer relevant bild av bakteriell antibiotikaresistens in vivo.
Eftersom biofilmer i allmänhet är mer antibiotikaresistenta än planktoniska kulturer 2-4 , var det nödvändigt att utforma en metod som direkt relaterar antibiotikaresistensen hos en biofilm till en planktonisk kultur. Ett annat mål med denna metod är således att direkt kunna jämföra nivån av antibiotikaresistens mellan planktoniska och biofilmsceller. MBC-P och MBC-B analyser som beskrivs här gör detta möjligt eftersom celler odlas under liknande förhållanden. Vi har använt denna metod för att studera flera gener som är viktiga för biofilmsspecifik antibiotikaresistens 5-8 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MBC-B
-
Odla en biofilm (anpassad från O'Toole9).
- Odla en kultur av den vilda typen av intresse och mutantstam i 16 timmar i ett rikt medium vid 37 °C.
- Späd ut de mättade nattkulturerna 1:100 till färskt medium för antibiotikaresistensanalyser. Ett standardmedium för P. aeruginosa är M63 minimalt medium kompletterat med magnesiumsulfat och arginin (se tabell 1). Detta medium stimulerar bildandet av en mer robust biofilm.
- Tillsätt 100 μl av utspädningen per brunn i en 96-brunns mikrotiterform (se tabell 1). Eftersom dessa analyser vanligtvis utförs i triplicate för varje stam, bör det finnas 24 brunnar av varje stam.
- Inkubera mikrotiterplattan i 24 timmar vid 37 °C.
-
Exponera den förformade biofilmen för en koncentrationsgradient av antibiotikum
- Förbered en 10x utspädningsserie av antibiotika för 7 brunnar. Exempel: För antibiotikumet tobramycin är de slutliga koncentrationerna i brunnarna 0, 4, 0, 2, 0, 1, 0, 05, 0, 025, 0, 0, 0, 0, 0, 006 mg/ml 5-8 . Från ett lager av 25 mg/ml bered 10x utspädningar på 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 och 0,06 mg/ml. Gå på is.
- Ta bort den förbrukade övernaturliga (innehållande planktoniska celler) med en flerkanalspipett (se tabell 1).
- Tillsätt 90 μl M63 (Mg/Arg) till alla brunnar.
- Tillsätt 10 μl av varje 10x antibiotikakoncentration för att uppnå önskade slutliga koncentrationer. Tillsätt 10 μl vatten (ingen antibiotikakontroll) till den slutliga brunnen för varje replikat och stam.
- Inkubera mikrotiterplattan i 24 timmar vid 37 °C.
-
Uppdatera mediet och möjliggöra avskildhet av levande celler.
- Ta bort det förbrukade övernaturliga (som innehåller planktoniska celler) med en flerkanalspipett.
- Tillsätt 115 μl M63 (Mg/Arg) till alla brunnar.
- Inkubera mikrotiterplattan i 24 timmar vid 37 °C.
-
Analys för levande celler.
- Märk två LB-agarplattor per 96-brunns microtiterplatta.
- Sterilisera multiprongapparaten (se tabell 1)genom att doppa spetsarna i 100% etanol och passera spetsarna över den öppna lågan på en Bunsenbrännare. upprepa. Låt spetsarna svalna något. Använd multiprong-enheten, överför ~ 3 μl (mängd som vanligtvis behålls på spetsarna på spetsarna av spetsarna) av planktonisk kultur från varje brunn på mikrotiterplattan till ytan av en LB-agarplatta.
- Inkubera LB-agarplattorna i 16 timmar vid 37 °C.
- Bestäm minimal bakteriedödande koncentration av antibiotikumet genom att med ögat identifiera avskärningen för bakterietillväxt (figur 1).
2. MBC-P
-
Förbereda bakteriestammar
- Odla en kultur av den vilda typen av intresse och mutantstam i 16 timmar i ett rikt medium vid 37 °C.
- Späd ut de mättade nattkulturerna 1:100 till färskt medium för antibiotikaresistensanalyser. Ett standardmedium för P. aeruginosa är M63 minimalt medium kompletterat med magnesiumsulfat och arginin (se tabell 1).
- Tillsätt 90 μl av utspädningen per brunn i en 96-brunns mikrotiterform (se tabell 1). Eftersom dessa analyser vanligtvis utförs i triplicate för varje stam, bör det finnas 24 brunnar av varje stam.
-
Utsätta planktoniska celler för en koncentrationsgradient av antibiotikum
- Förbered 10x utspädningsserie av antibiotika för 7 brunnar. Exempel: För antibiotikan tobramycin är de slutliga koncentrationerna i brunnarna 0,032, 0,016, 0,008, 0,004, 0,002, 0,001 och 0,0005 mg/ml. Från ett lager på 25 mg/ml bered utspädningar på 0,32, 0,16, 0,08, 0,04, 0,02, 0,01 och 0,005 mg/ml. Gå på is.
- Tillsätt 10 μl av varje 10x antibiotikakoncentration för att uppnå önskade slutliga koncentrationer. Tillsätt 10 μl vatten (ingen antibiotikakontroll) till den slutliga brunnen för varje replikat och stam.
- Inkubera mikrotiterplattan i 24 timmar vid 37 °C.
-
Analys för levande celler.
- Märk två LB-agarplattor per 96-brunns microtiterplatta.
- Sterilisera multiprongapparaten (se tabell 1)genom att doppa spetsarna i 100% etanol och passera spetsarna över den öppna lågan på en Bunsenbrännare. upprepa. Låt spetsarna svalna något. Använd multiprong-enheten, överför ~ 3 μl (mängd som vanligtvis behålls på spetsarna på spetsarna av spetsarna) av planktonisk kultur från varje brunn på mikrotiterplattan till ytan av en LB-agarplatta.
- Inkubera LB-agarplattorna i 16 timmar vid 37 °C.
- Bestäm den minimala bakteriedödande koncentrationen av antibiotikumet genom att med ögat identifiera avskärningen för bakterietillväxt (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MBC-P- och MBC-B-analyser utfördes och jämförde känsligheten hos PA14 vildtyp med PA14 ∆ndvB. Tobramycin användes som antibiotika. Resultat motsvarande steg 1.4.4(figur 1)och steg 2.3.4(figur 2)presenteras. PA14 och ∆ndvB inokulerades i MBC-P och MBC-B analyser i tre exemplar. Efter att ha slutfört steg 1.0-1.4 i MBC-B-protokollet och steg 2.0-2.3 i MBC-P-protokollet, pläterades de livskraftiga cellerna på en LB agar-platta. Koncentrationer av tobramycin( μg/ml) anges till vänster om cellerna. MBC-B för PA14 är 100 μg/ml och MBC-B för ∆ndvB är 12,5 μg/ml. MBC-P för både PA14 och ∆ndvB mutant är 8 μg/ml.
Figur 1. Representativa resultat från en MBC-B-analys med PA14 vildtyp jämfört med PA14 ∆ndvB och tobramycin. Värdena avser den slutliga koncentrationen av tobramycin (μg/ml).
Figur 2. Representativa resultat från en MBC-P-analys med PA14 vildtyp jämfört med PA14 ∆ndvB och tobramycin. Värdena avser den slutliga koncentrationen av tobramycin(μg/ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Antibiotikaresistens i planktoniska celler definieras som en ökning av den minsta hämmande koncentrationen (MIC) av ett antibiotikum på grund av en permanent förändring i cellerna(t.ex. en mutation). De mekanismer för biofilmsspecifik resistens eller tolerans som hittills har identifierats är resultatet av uttrycket av vilda gener inom biofilmer. Således gäller den klassiska definitionen av resistens inte biofilmer. En annan uppsättning definitioner har dock presenterats: resistensmekanismer hindrar antibiotikan från att komma åt sitt mål, medan toleransmekanismer stänger ner målen för antibiotika10. Biofilmsspecifika mekanismer för antibiotikaresistens omfattar båda dessa definitioner. Termen "resistens" har använts i hela detta protokoll, men ytterligare experiment måste utföras för att avgöra om en gen bidrar till resistens eller tolerans.
MBC-P- och MBC- B-analyserna kan anpassas för alla biofilmbildande bakteriestammar och alla bakteriedödande antimikrobiella medel. De två viktiga kriterierna för att anpassa denna analys till andra bakterier och andra antimikrobiella medel är att fastställa förhållanden som leder till biofilmsbildning och bestämma lämpligt koncentrationsområde för det antimikrobiella med hjälp av den vilda typ stam av intresse. Korrekta biofilmsbildningsförhållanden kan bestämmas med hjälp av ett JoVE biofilmsbildningsprotokoll publicerat av George O'Toole9. För att bestämma ett lämpligt koncentrationsområde för MBC-B-analysen är en bra tumregel att använda 25 x MIC (minimal hämmande koncentration11) som mellankoncentration i intervallet och justera därefter. För MBC-P-analysen, använd 1/10 av de värden som identifierats för MBC-B-analysen. Målet är att definiera en rad koncentrationer som möjliggör en tydlig skillnad mellan MBC-B av den vilda stammen och en känslig mutantstam. Således bör den övre änden av intervallet vara nära MBC-B av den vilda typen av stam. Vi upprepar detta experiment minst tre gånger, vilket ger minst 9 datapunkter per stam.
Det mest kritiska steget i dessa analyser är att undvika kontaminering. För att förhindra kontaminering mellan stammar bör en tom kolumn lämnas mellan stammarna. Ett annat kritiskt steg är att ge tillräckligt med tid för metall spetsarna på multiprong-enheten att svalna tillräckligt. Detta kan testas genom att flamma spetsarna, tajma kylningsperioden och snabbt röra spetsarna med händerna.
Om detachment av cellerna från biofilmen efter exponering för antibiotika är ett problem, MBC-B metoden kan ändras för att inkludera en ultraljudsbehandling steg. Hoppa över steg 1.3.3 (24 timmars inkubation efter tillsats av färska medier). Täck istället brunnarna på 96-brunns microtiterplattan efter att ha tillstärt 115 μl färska medier (steg 1.3.2) med steril självhäftande platttätning och soniska platta för att lossa biofilmsceller från brunnens väggar. Använd en vattenbads ultraljudspump. Särskilda villkor (tid, intensitet) för effektiv avlägsnande av biofilmsceller från plasten måste bestämmas i förväg.
En variant av MBC-B användes för att screena ett bibliotek med 4 000 transposon-infogningsmutanter av P. aeruginosa för biofilmsspecifika antibiotiska resistensmutanter. En koncentration av tobramycin (50 μg/ml) valdes som inte skulle döda biofilmsceller av vildtyp, men som skulle göra det möjligt att identifiera mutanter som var 3 gånger känsligare än biofilmen av vildtyp. I stället för att vaccinera kolonner av brunnar med en specifik bakteriestam vaccinerades varje brunn med en annan mutant. Mutanterna lämnades att bilda en biofilm, exponerad för 50 μg/ml tobramycin, lämnades att återhämta sig från tobramycin exponering och sedan analyseras för livskraft. Mutanter som inte överlevde 50 μg/ml tobramycinexponering testades på nytt under samma screeningförhållanden. MBC-P och MBC-B protokoll användes för att bekräfta tobramycin-känsliga fenotyper av mutanter.
Det finns andra metoder för att analysera antibiotikaresistens i biofilmer, det vill säga kolonibiofilmer och biofilmer odlade i bioreaktorer12,13. Dessa metoder är betydligt mer mödosamma och begränsade i antalet stammar som lätt kan analyseras. Således är en fördel som MBC-B har jämfört med dessa andra metoder att det är hög genomströmning, vilket gör det möjligt för forskaren att utföra skärmar eller analysera flera stammar, liksom flera olika antibiotikakoncentrationer på en gång.
| Reagensets namn | företag | Katalognummer | Kommentarer (valfritt) |
| 1x M63 | Förbered som ett 5x M63-lager genom att lösa upp 15 g KH2PO4,35 g K2HPO4 och 10 g (NH4)2SO4 i 1 L vatten. Detta lager behöver inte autoklaveras och kan förvaras i rumstemperatur. Späd 5x lager 1:5, autoklav, svalna och lägg sedan till önskade komponenter. | ||
| KH2PO4 | fiskare | P285-500 | |
| K2HPO4 | fiskare | P288-500 | |
| (NH4) 2 (på 2) SÅ4 | sigma | A5132 (på 5132) | |
| Magnesiumsulfat | fiskare | M63-500 | Tillsätt till 1 mM slutlig koncentration. Förbered som ett 1 M lager i vatten och autoklav. |
| Tobramycin (tobramycin) | sigma | Förbered 50 mg/ml buljong. Aliquot och förvara på -20 °C. | |
| arginin | sigma | A5131 (på 5131) | Tillsätt 0,4% slutlig koncentration. Förbered som en 20% lager i vatten och filtrera sterilisera. Denna alternativa kol-/energikälla kan ersätta glukos- och casaminosyror |
| 96-brunns mikrotiterplattor | Corning | 3595 | Steril, platt botten, låg avdunstning |
| Tranferpette (flerkanalspipett) | MärkeTech | 2703610 | 8-kanalig, 20-200 μl |
| Multiprong-enhet | Dan-Kar (olika år) | MC48 (olika) | 48 spetsar passar in i 1/2 av en 96-brunns mikrotiterplatta |
Tabell 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren förklarar att hon inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författaren vill tacka Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz och Clayton Hall för redaktionell hjälp med detta manuskript. Denna analys utvecklades ursprungligen i labbet av George O'Toole, Geisel School of Medicine vid Dartmouth. Forskning i Dr. Mahs labb stöds av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada och Cystic Fibrosis Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
| KH2PO4 |
Fisher | P285-500 |
|
| K2HPO4 |
Fisher | P288-500 |
|
| (NH4)2SO4 |
Sigma | A5132 |
|
| Magnesium sulfate |
Fisher | M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Tobramycin |
Sigma | Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at -20°C. |
|
| Arginine |
Sigma | A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| 96-well microtiter plates |
Corning | 3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
| Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech | 2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
| Multiprong device |
Dan-Kar | MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard-eighth edition. , Ninth Edition, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2009).
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O'Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O'Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement. 31, Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, J. Wiley & Sons. Hoboken, NJ. 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
