Summary
Ce document montre une méthodologie originale sur la base de l'actionnement à distance de particules magnétiques ensemencées dans un biofilm bactérien et le développement des pinces magnétiques dédiés pour mesurer in situ les propriétés mécaniques locales du matériau vivant complexe construit par des micro-organismes au niveau des interfaces.
Abstract
L'adhérence bactérienne et à la croissance sur les interfaces conduisent à la formation de structures en trois dimensions hétérogènes dits biofilms. Les cellules qui demeurent sur ces structures sont maintenues ensemble par des interactions physiques induites par un réseau de substances polymères extracellulaires. Biofilms bactériens impact sur de nombreuses activités humaines et la compréhension de leurs propriétés est cruciale pour une meilleure maîtrise de leur développement - la maintenance ou l'élimination - en fonction de leur résultat négatif ou positif. Cet article décrit une nouvelle méthodologie visant à mesurer in situ les propriétés physiques locales du biofilm qui avait été, jusqu'à présent, examiné que dans une perspective de matériau macroscopique et homogène. L'expérience décrite ici consiste à introduire des particules magnétiques dans un biofilm de plus en plus aux semences sondes locales qui peuvent être actionnés à distance sans perturber les propriétés structurales du biofilm. Pinces magnétiques dédiés ont été développé pour exercer une force définie sur chaque particule noyée dans le biofilm. La configuration est monté sur la scène d'un microscope pour permettre l'enregistrement d'images de time-lapse de la période de particules de traction. Les trajectoires des particules sont ensuite extraites à partir de la séquence de traction et les paramètres viscoélastiques locaux sont obtenus à partir de chaque courbe de déplacement des particules, assurant ainsi la distribution de 3D-spatiale des paramètres. Gagner un aperçu du profil mécanique du biofilm est essentiel du point de vue d'un ingénieur des fins de contrôle du biofilm mais aussi d'un point de vue fondamental de clarifier la relation entre les propriétés architecturales et la biologie particulière de ces structures.
Introduction
Biofilms bactériens sont des communautés de bactéries associées à des surfaces biologiques ou artificiels 1-3. Ils forment par un mécanisme d'adhérence croissance, associée à la production de matrice extracellulaire riche en polysaccharides qui protège et stabilise l'édifice 4,5. Ces biofilms sont pas simplement passifs assemblages de cellules collées aux surfaces, mais les systèmes biologiques complexes dynamiques organisés et. Lorsque les bactéries planctoniques à passer de biofilm mode de vie, les changements dans l'expression des gènes et la physiologie des cellules sont observées ainsi qu'une augmentation de la résistance aux antimicrobiens et accueillent les défenses immunitaires étant à l'origine de nombreuses infections persistantes et chroniques 6. Cependant, le développement contrôlé de ces structures vivantes offrent également des possibilités pour des applications industrielles et environnementales, telles que la bioremédiation des sites de déchets dangereux, bio-filtration de l'eau industrielle ou de la formation de bio-barrières pour protéger les sols et les eaux souterraines de contamination.
Bien que les caractéristiques moléculaires spécifiques de la manière de biofilm de vie sont de plus en plus décrits, les mécanismes d'entraînement le développement communautaire et la persistance restent floues. En utilisant les dernières avancées sur les mesures micrométriques utilisant électrochimique de balayage ou la microscopie à fluorescence, ces organisations vivantes ont été montré pour présenter considérable structurel, chimique et biologique hétérogénéité 7. Pourtant, jusqu'à présent, la mécanique du biofilm ont été principalement examinés macroscopiquement. Par exemple, l'observation des banderoles de biofilm déformation due aux variations de taux d'écoulement de fluide 8,9, compression uniaxiale de pièces mécaniques de biofilm milieu d'agar ou cultivé sur le couvercle glisse 10,11, cisaillement du biofilm collecté de l'environnement, puis transféré à un parallèle rhéomètre à plaques 12,13, la spectroscopie de force atomique en utilisant une bille de verre et revêtu d'un biofilm bactérien fixé à un cantilever AFM 14 ou un micr dédiéocantilever méthode de mesure de la résistance à la traction de fragments de biofilm détachées 15,16 ont été mis en œuvre au cours des dix dernières années, fournissant des informations utiles sur la nature viscoélastique du matériau 17. Cependant, il semble probable que des informations sur des propriétés mécaniques du biofilm in situ est perdue lorsque le matériau est retiré de son environnement d'origine, ce qui est souvent le cas dans ces approches. En outre, le traitement du biofilm en tant que matériau homogène manque les informations sur l'éventuelle hétérogénéité des propriétés physiques au sein de la communauté. Par conséquent, la portée exacte de la mécanique de la structure de la formation de biofilm et des caractéristiques biologiques telles que les motifs d'expression du gène ou de gradients chimiques peuvent difficilement être reconnus. Pour progresser vers une description microscopique des propriétés physiques du biofilm, de nouveaux outils dédiés sont nécessaires.
Cet article détaille une approche originale conçue pour atteindrela mesure des paramètres mécaniques locales in situ, sans perturber le biofilm et permet le dessin de la répartition spatiale des propriétés du matériau à micro-échelle, puis l'hétérogénéité mécanique. Le principe de l'essai repose sur le dopage d'un film biologique en croissance avec des microparticules magnétiques suivie de leur chargement à distance en utilisant des pinces magnétiques dans le biofilm mature. déplacement des particules sous l'application de la force magnétique contrôlé imagé au microscope permet la dérivation de paramètre viscoélastique local, chaque particule de rapports de son propre environnement local. A partir de ces données, le profil 3D mécanique du biofilm peut être tirée, révélant état dépendances spatiales et environnementales. L'ensemble de l'expérience sera montrée ici sur un E. biofilm coli faite par une souche génétiquement modifiée portant un plasmide F-comme déréprimée. Les résultats détaillés dans un document récent 18 offrent une vision unique de l'intérieur de la mécanique du biofilm intactes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culture de bactéries et de préparation de Suspension
- Choisissez une colonie fraîchement cultivés à partir d'une plaque de gélose Lysogénie Broth (LB), inoculer dans 5 ml de milieu LB liquide contenant 100 μ g / ml d'ampicilline et 7,5 μ g / ml tétracycline et incuber pendant 5 à 6 heures à 37 ° C sur une plate-forme en secouant.
- Ensuite, ajouter 100 μ l de la culture bactérienne dans 5 ml de milieu minimum (M63B1) supplémenté avec 0,4% de glucose et les mêmes concentrations en antibiotique. Incuber cette nuit de culture fraîchement diluée à 37 ° C sur une table d'agitation.
- Après 16 heures d'incubation, ajouter 100 ul de la culture de la nuit à 5 ml M63B1, 0,4% de glucose. Garder le tube à 37 ° C à la plate-forme en secouant jusqu'à 0,5 OD est atteint. La suspension est alors prêt pour l'injection dans le canal d'essai pour la formation de biofilm.
2. Préparation de particules magnétiques
- Prenez 10 particules magnétiques ul -2,8 μ m de diamètre - dans le stock et les laver 3x dans 190 pi de milieu minimum à l'aide d'un porte-échantillon magnétique.
- Ajuster la concentration en particules de 5 x 10 6 / ml de perles. Typiquement, 50 pi de la solution de talon lavé est mélangé avec un autre 950 μ l de M63B1 avec 0,4% de glucose.
3. Préparation Manche et biofilm croissance
- Montage de la Manche
- Coupez deux carrés (800 μ m de longueur de côté) des capillaires en verre borosilicate 10 cm de long à obtenir deux 8 cm de long morceaux.
- Coller les deux éléments capillaires sur deux lames de verre coupées en deux - première - 2 cm de distance avec une cm-faux à chaque extrémité comme dans la figure 1 à l'aide d'une colle à base de cyanoacrylate à action rapide (appelé super-colle).
- Autoclave toute l'installation et le tube nécessaire requis pour obtenir une connexion de canal.
- Rassemblez tous les matériaux stériles sousune hotte à flux laminaire: i) le canal monté et piège 1, ii) les tubes et connecteurs, iii) les deux pièges à bulles - le filtre à bulles couramment utilisé pour sécuriser goutte-à-alimentation (le piège des enfants 1) et le piège à bulles fait maison comme un long tube de 4 cm de diamètre plus grand (piège 2), iv) des pinces, v) 30 ml seringues remplies de M63B1, 0,4% de glucose, et vi) le flacon à déchets.
- Connectez l'ensemble de l'installation avec connecteurs Luer Lock ou des carrefours dans l'ordre suivant: 50 ml M63B1 contrôlée par la pompe seringue, filtre à bulle pédiatrique, maison piège à bulles, capillaire (figure 1, partie B), et le tube de la bouteille de déchets seringue. Ensuite, remplissez le programme d'installation avec M63B1 stérile, 0,4% de glucose, tourner sur la pompe à seringue à un débit d'environ 10 ml / h, plus élevé que les taux expérimentales. Suivre attentivement et d'éliminer toutes les bulles dans le circuit.
- Débit moyen à travers le système pendant 10-15 min; simultanément mélanger 1 ml de la suspension de bactéries à DO 0,5 de la section1.3 avec 1 ml de la solution de billes lavé préparé dans la section 2.2.
- Attacher (mais ne pas fermer) pinces à la tubulure à deux positions: avant et après les capillaires. Mettez le flux hors tension.
- Introduire le mélange bactérien-perle dans le capillaire après le fait maison piège à bulles à l'aide d'une seringue de 1 ml, en prenant soin de tenir le tube se termine pour empêcher l'entrée d'air. Ré-attacher le tube et puis fermez les pinces.
- Répétez la même procédure pour le deuxième capillaire et de vérifier tous les tubes pour les bulles.
- Transférer le dispositif de microscope et la laisser reposer pendant 15 à 20 min pour permettre aux bactéries de se déposer et fixer sur la surface du capillaire. Installer le tube capillaire sur la platine du microscope avec le conteneur de déchets à un niveau légèrement supérieur. Placez la pompe de seringue sur le comptoir à côté du microscope. Élever le piège à bulles avant le capillaire légèrement plus élevé que le plan de capillaires pour capturer des bulles.
- Biofilm Growth
- Ajuster le débit de la pompe à seringue et démarrer l'écoulement, le biofilm va maintenant développer sur la surface du capillaire pendant la période nécessaire - en général de 24 ou 48 heures dans ces expériences.
- Focus sur le plan inférieur capillaire et commencer l'enregistrement time-lapse des exemples d'images - habituellement une fréquence d'acquisition de 2 images / min rendra compte de manière adéquate la croissance du biofilm. Ce moniteurs vidéo biofilm post-contrôle de la croissance (voir extraits en vidéos 1, 2 et 3).
4. Pinces magnétiques installation
- Visser les pinces magnétiques sur micromanipulateurs XYZ à commande manuelle et visser les micromanipulateurs sur la platine du microscope pour ajuster la position de la pince par rapport au capillaire. Placer la pince que sur la figure 2, pour assurer le gradient de champ magnétique approprié est généré dans la zone d'observation.
- Connectez les pinces to le générateur de fonction par l'intermédiaire de l'amplificateur de puissance pour générer une période de 40 secondes de temps en 24 sec de signal zéro et 16 sec de 4 A à courant continu avec un déclencheur envoyé au brillant obturateur de lumière de champ après 20 sec pour la synchronisation du signal fournissant une séquence de événements qu'à la figure 3.
Remarque: Ces deux opérations peuvent être réalisées à tout moment entre l'installation capillaire et la mesure début. Voir expérimenter croquis aperçu dans la figure 4.
5. Acquisition courbe de fluage
- Utiliser la commande de déplacement xy de la platine du microscope à amener le bord du pôle magnétique gauche et le bord gauche de la capillarité dans le même champ d'observation. Prendre l'origine du référentiel analyse à l'intersection de x et y des axes définis par le bord du capillaire et le bord de la pièce polaire, respectivement (voir Figure 2).
- Ajustez la position verticale du capillaire à l'aide mise au point fine control bouton de la position du microscope. Plan généralement le premier examen est situé entre 4 à 7 μ m au-dessus du fond du capillaire. Vidéo 1 correspond au champ xy qui a son coin supérieur gauche à l'origine du référentiel spatial.
- Déclencher la séquence de 40 secondes d'événements décrits dans la section 4.2 et la figure 3 par la mise en marche du générateur de courant et dans le même temps, déclencher manuellement la séquence de la vidéo 1 d'acquisition d'image.
- Déplacez le capillaire au champ droit voisin par un μ m traduction 250 de la platine du microscope à gauche et à fonctionner comme dans la section 5.3 pour générer la vidéo 2 de la tranche 2 et ainsi de suite pour obtenir les vidéos nécessaires. En général 3 à 4 domaines de 250 x 250 μ m 2 sont collectées le long de l'axe x avant de changer le plan et en répétant les mêmes opérations pour le nouveau plan.
6. Calibration de travail
- Préparer une solution de glycérol en mélangeant 39,8 g de glycérol avec 190 μ l d'eau bi-distillée et 10 pi de particules magnétiques à une 2 x 10 9 particules / ml et remplir un canal expérimental avec ce mélange et le placer sur la platine du microscope comme décrit pour l'échantillon de biofilm.
- Après l'installation des pinces magnétiques comme indiqué dans l'article 4, appliquer la force magnétique, comme indiqué à la section 5.4 et faire des images en accéléré pour extraire la vitesse de chaque particule unique (v) et sa position dans le capillaire pour obtenir le fichier de calibration. Ce fichier doit contenir la force appliquée en fonction de sa position dans la zone d'analyse du capillaire conformément à la loi de Stokes, F = 6πRηv (R: rayon de la particule).
7. Analyse
- Utilisez un logiciel "particules traqueur" pour obtenir des fichiers de texte avec les positions de particules dans chaque trame pour toutes les piles d'images acquises, comme indiqué dans l'article 5. Using la fréquence d'acquisition d'image de la pile, de calculer le déplacement des particules en fonction du temps (par exemple de la figure 5 et vidéo 4).
- Utilisation du fichier d'étalonnage de la force, de convertir les courbes de déplacement à courbes de compliance (conformité totale de la matière - J (t) - en fonction du temps) selon la formule de la conformité:
qui donne la relation entre la contrainte et la contrainte du matériau appliqué pour une particule de sonde de rayon R incorporé dans un milieu visco-élastique incompressible, homogène tel que précédemment établi par Schnurr et ses collaborateurs 19. - Régler les courbes de compliance de fluage au modèle de Burgers général pour les matériaux viscoélastiques et d'en tirer les paramètres viscoélastiques, J 0, J 1, η 0, η 1 pour chaque particule (
Remarque: Cette analyse phénoménologique a déjà été utilisée pour une large gamme de matériaux, y compris les matériaux biologiques tels que les biofilms à interpréter les données de rhéologie macroscopiques 20-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Une analyse typique fournira la distribution spatiale des paramètres viscoélastiques à l'échelle du micron sur un biofilm vivant sans déranger son agencement d'origine. Des résultats typiques sont présentés dans la figure 7, où les valeurs de J 0 - la compliance élastique - sont donnés en fonction de l'axe z le long de la profondeur et de l'axe y le long d'une dimension latérale du biofilm. Chaque point correspond à un bourrelet dont l'analyse de la courbe de fluage a fourni une valeur J 0. Les données ont révélé que la conformité locale varie le long de la profondeur du biofilm sur près de trois ordres de grandeur, mais aussi que l'hétérogénéité latérale forte a eu lieu à toutes les hauteurs de biofilm.
Les données ont également accès à la distribution des valeurs de conformité qui présentaient ici une forme généralisée et asymétrique (figure 8), la fourniture de fortes indications que les propriétés mécaniques du biofilm ont été soutenus parhautement réticulé gels de polymère. En effet, le comportement analogue a déjà été démontrée sur des gels d'actine et concentrés hautement réticulés 23.
En outre, ces mesures in situ de propriétés locales de biofilm effectuées dans différentes conditions environnementales telles que le taux de faible débit permettent de démontrer l'effet d'une telle variation sur l'organisation interne du biofilm. Sur la figure 9, les valeurs de compliance d'un biofilm augmenté à 0,1 ml / h présentaient un profil mécanique reste très hétérogène, mais pas plus grande rigidité de la couche de biofilm plus profond par rapport au biofilm augmenté à 1 ml / h. Ces résultats ont démontré l'impact significatif des conditions externes sur l'organisation d'un biofilm.
Figure 2. Positionnement des pinces magnétiques par rapport à la capillarité sur la platine du microscope et la définition du référentiel spatial. La vue de dessus indique la position de la zone de mesure dans le capillaire.
Figure 3. Synchronisation des signaux sur la période de 40 secondes de temps.
857/50857fig4.jpg "/>
Figure 4. Expérience croquis aperçu.
Figure 5. Extraits d'analyse de la trajectoire des particules. Panneau A montre à gauche l'image d'une particule typique à sa position initiale, juste avant application de la force magnétique (temps de 23,79 secondes de la période de 40 sec) et sur la droite de la position de la particule à temps de 30 secondes avec l'affichage de la trajectoire trouvé avec suivi de particules ImageJ Groupe B montre le tracé de la courbe de déplacement dérivé de ces données.; Ici, nous montrons un extrait de trajectoire à partir de 23,79 sec temps jusqu'à l'instant t = 31.29 sec de la période de 40 secondes.
Figure 6. Viscoélastique paramètre dérivation sur la base du modèle phénoménologique de Burger. (A) Burgers modèle mécanique consistant en une combinaison de ressort élastique de Hooke (J 0) et amortisseur de Newton (η 0) en série avec un élément Maxwell (de printemps ( J 1) et amortisseur (η 1) en parallèle). (B) Creep trace expérimentale en bleu avec la courbe (en vert) ajusté à l'équation de Burgers.
Figure 7. Répartition spatiale de la conformité élastique dans un biofilm augmenté de 24 h à 37 ° C sous 1 ml nutriments h / flux. valeurs de conformité rapportés par chaque particule sont représentés ici comme une projection sur un (YZ) en utilisant un frais à chaud couleur personnalisé carte. Les valeurs de conformité signalés par des particules situées dans la couche inférieure du biofilm sont tous inférieurs à 0,2 m 2 / N alors que les particules se trouvent dans les valeurs 15 μ m de rapport de la couche supérieure au-dessus de 1 m 2 / N.
Figure 8. Des distributions normalisées des paramètres viscoélastiques obtenues en biofilm (A) et en glycérol (B), un liquide visqueux homogène. Biofilm exposé distribution asymétrique et large (asymétrie de 3,6 et 2,4 variance normalisée) indiquant matériau hétérogénéité. En revanche, symétrique et distribution étroite caractérisant un milieu homogène a été obtenue dans le glycérol (asymétrie de 0,23 et 0,03 variance normalisée).
Figure 9. Répartition spatiale de la conformité élastique dans un biofilm augmenté de 24 h à 37 ° C sous un flux inférieur de 0,1 ml / h nutriments flux. Valeurs de conformité sont représentés en fonction de la profondeur du biofilm. couleurs de symboles donnent les plages de conformité.
Figure 10. Magnétique pôle plan. Les dimensions sont données en cm.
Figure 11 câblage. Des pinces magnétiques. Panneau de A - est utilisé pour enrouler étroitement les 2120 tours de fil de cuivre et de construire la bobine magnétique (panneau B) avant d'insérer le pôle d'alliage magnétique doux en son centre. Le courant continu est fourni dans la bobine définissant polarité magnétique comme indiqué dans le panneau C. Voir aussi expérimenter croquis aperçu dans la figure 4.
Vidéo 1: Ce film montre la phase initiale du biofilm juste après l'injection de la cellule de mélange de particules dans le capillaire. Fréquence d'acquisition est de 1 image / sec et le film est joué à 10 images / sec. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Vidéo 2: Ce film montre le biofilm après une croissance de 4 h. Les particules sont progressivement détachées de la surface devant être distribué dans la b le volume iofilm, flèches bleues marquent les événements de détachement. Fréquence d'acquisition est de 2 image / min et le film est joué à 15 images / sec. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Vidéo 3: biofilm après une croissance de 20 h. Le film est prise dans un plan médian situé à 20 um sur le fond capillaire. Les images ont été acquises à 2 images / min fréquence et le film est joué à 15 images / sec. S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Vidéo 4: suivi de particules typique avec ImageJ. Le film montre un extrait de la séquence entière à partir de temps de 23 secondes et se terminant à l'instant 30 sec. Trajectoire jaune montre le déplacement de particules lors de l'actionnement magnétique. Fréquence d'acquisition est de 30 images / sec et le film est joué à 30 images / sec.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cette particule magnétique ensemencement et en tirant expérience in situ a permis la cartographie 3D des paramètres viscoélastiques d'un biofilm de plus en plus dans son état d'origine en. Cette approche a révélé l'hétérogénéité de la mécanique E. coli biofilm cultivé ici et a donné des indices pour pointer les composants du biofilm soutenant les propriétés physiques du biofilm, ce qui suggère fortement une implication fondamentale de la matrice extracellulaire et plus précisément son degré de réticulation.
La reconnaissance des propriétés mécaniques des motifs en biofilm bactérien est essentiel pour la construction d'une représentation complète de ces matériaux complexes. Ces résultats ouvrent la voie à clarifier les relations causales entre les modèles mécaniques et hétérogénéités biologiques tels que microniches d'expression des gènes, ce qui devrait aider à clarifier les forces motrices qui sous-tendent le développement de biofilm.
Jusqu'à présent, la question de la mecha de biofilmpropriétés niques avaient été adressées principalement d'un point de vue macroscopique et souvent en grattant biofilm de son site initial 8,9,12,13, ce qui représente un risque important de perte d'information. Notre méthode non invasive entraîne la première caractérisation in situ du profilé mécanique 3D de biofilm dans son environnement d'origine en.
L'approche présente encore une limitation réside dans les caractéristiques de l'actionnement à distance de sondes magnétiques colloïdales. En effet, il affiche une gamme de forces intrinsèque accessibles proposés par la distance polaire de particules, les propriétés des matériaux polaires et la performance de la bobine. La configuration actuelle de l'installation a permis le palpage des valeurs de rigidité jusqu'à 200 Pa, ce qui était suffisant pour que les films biologiques examinés ici. Néanmoins, outre le génie de notre set-up - impliquant, par exemple, le refroidissement électro - devrait permettre déplacement des limites de la force et de temps par un facteur de 2 à 3.
We travaille actuellement sur les rapports entre les propriétés physiques et dynamiques dans un biofilm étudier la relation qui lie les paramètres viscoélastiques locales signalées par le déplacement passif de la sonde sur une échelle de temps plus grand. En outre, nous étudions l'impact de divers produits chimiques ciblant les différentes composantes du biofilm sur son profil mécanique.
Cette nouvelle approche révèle les détails de la mécanique interne de biofilms bactériens et contribue à une meilleure compréhension de ces structures vivantes, cruciale du point de vue d'un ingénieur des fins de contrôle du biofilm mais aussi d'un point de vue fondamental de clarifier la relation entre les propriétés architecturales et le spécifique biologie de ces structures.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Ce travail a été supporté en partie par des subventions de l'Agence Nationale pour la Recherche, programme PIRIbio Dynabiofilm et de programme des risques interdisciplinaire CNRS. Nous remercions Philippe Thomen pour sa lecture critique du manuscrit et Christophe Beloin pour fournir l'E. coli, souche utilisée dans ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
- Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
- Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
- Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
- Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
- Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
- Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
- Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
- Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
- Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
- Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
- Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
- Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
- Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
- Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).
