Summary
Dieses Papier zeigt eine einzigartige Methodik auf der Fernbetätigung in einem bakteriellen Biofilm und die Entwicklung von speziellen magnetischen Pinzette, um in-situ-Messung der lokalen mechanischen Eigenschaften des Komplexes lebendiges Material durch Mikroorganismen an Grenzflächen gebaut ausgesät magnetischen Partikeln.
Abstract
Bakterielle Adhäsion und das Wachstum von Schnittstellen führen zur Bildung von dreidimensionalen heterogenen Strukturen sogenannten Biofilmen. Die Zellen Wohnung in diesen Strukturen werden durch physikalische Wechselwirkungen von einem Netzwerk von extrazellulären polymeren Substanzen vermittelte zusammengehalten. Bakterielle Biofilme Einflüsse auf viele Aktivitäten des Menschen und das Verständnis ihrer Eigenschaften ist entscheidend für eine bessere Kontrolle über ihre Entwicklung - Wartung oder Tilgung - in Abhängigkeit von ihrer negativen oder wirtschaftlichen Ergebnis. Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren mit dem Ziel, in situ Messung der lokalen physikalischen Eigenschaften des Biofilms war, bis jetzt untersuchten nur aus einem homogenen Material und makroskopischen Perspektive. Das hier beschriebene Experiment beinhaltet die Einführung magnetischen Teilchen in einen wachsenden Biofilm zu lokalen Sonden, die aus der Ferne, ohne die strukturellen Eigenschaften des Biofilms zu stören betätigbaren Samen. Dedicated magnetischen Pinzette waren Entwickelt, um eine definierte Kraft auf jedes Teilchen im Biofilm eingebettet auszuüben. Das Setup ist auf der Bühne eines Mikroskops montiert, um die Aufnahme von Zeitraffer-Aufnahmen der Partikel-Ziehen Zeitraum zu ermöglichen. Die Trajektorien werden dann von der Ziehsequenz extrahiert und die lokalen viskoelastischen Parameter von jedem Teilchen-Kurve abgeleitet, wodurch die 3D-räumliche Verteilung der Parameter. Einblicke in den Biofilm mechanischen Profil ist wichtig, aus der Sicht eines Ingenieurs für Biofilm-Kontrolle, sondern auch aus fundamentaler Sicht, um die Beziehung zwischen den architektonischen Eigenschaften und der spezifischen Biologie dieser Strukturen zu klären.
Introduction
Bakterielle Biofilme sind Gemeinschaften von Bakterien, die mit biologischen oder künstlichen Oberflächen 1-3 verbunden. Sie sind durch eine Haftwachstumsmechanismus gekoppelt mit der Herstellung von Polysaccharid-reichen extrazellulären Matrix, schützt und stabilisiert das Gebäude 4,5. Diese Biofilme sind nicht nur passive Assemblagen von Zellen an Oberflächen stecken, aber organisiert und dynamische, komplexe biologische Systeme. Wenn Bakterien wechseln von planktonischen, um die Biofilm Lebensstil, sind Veränderungen in der Genexpression und Zellphysiologie und beobachtet, wie erhöhte Resistenz gegen antimikrobielle Mittel und Gastgeber Immunabwehr als der Ursprung von vielen persistenten und chronischen Infektionen 6. Allerdings ist die kontrollierte Entwicklung dieser lebenden Strukturen bieten auch Chancen für Industrie-und Umweltanwendungen, wie Sanierung von Altlasten, Bio-Filtration von Brauchwasser oder die Bildung von Bio-Barrieren für Boden und Grundwasser aus Contamin schützenation.
Während spezifische Biofilm Lebens molekularen Eigenschaften werden zunehmend beschrieben, sind die Mechanismen, die die Entwicklung der Gemeinschaft und Ausdauer unklar. Mit den jüngsten Fortschritten auf mikro-elektrochemischen Messungen unter Verwendung von Scanning-oder Fluoreszenzmikroskopie sind diese lebenden Organisationen wurde gezeigt, weisen erhebliche strukturelle, chemische und biologische Heterogenität 7. Doch bis jetzt Biofilmmechanik wurden hauptsächlich makroskopisch untersucht. Zum Beispiel Beobachtung von Biofilm Schlangen Verformung aufgrund von Variationen in Fluidströmungsraten 8,9, uniaxiale Kompression der Biofilm Stücke heben von Agar-Medium gezüchtet oder auf der Hülle gleitet, 10,11, Scherung von Biofilm aus der Umgebung aufgefangen und dann in einen parallel übertragen Platte-Rheometer 12,13, Atomkraftspektroskopie mit einer Glasperle und beschichtet mit einer bakteriellen Biofilm zu einer AFM-Cantilever 14 oder einem dedizierten MICR befestigtocantilever Verfahren zur Messung der Zugfestigkeit von Biofilm abgelöst 15,16 Fragmente wurden in den letzten zehn Jahren umgesetzt worden, die nützliche Informationen über die viskoelastischen Eigenschaften des Materials 17. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass die Informationen über in situ Biofilm mechanischen Eigenschaften gehen verloren, wenn das Material aus seiner nativen Umgebung, die häufig in diesen Ansätzen der Fall war entfernt. Darüber hinaus ist die Behandlung des Biofilms als homogenes Material fehlt die Information über die mögliche Heterogenität der physikalischen Eigenschaften innerhalb der Gemeinschaft. Daher können die genauen Auswirkungen der Strukturmechanik in der Biofilmbildung und biologische Eigenschaften wie Genexpression Strukturierung oder chemischen Gradienten kaum erkannt werden. Um zu einer Mikro Beschreibung der physikalischen Eigenschaften Biofilm fortschreiten, werden neue dedizierte Werkzeuge erforderlich.
Dieses Papier Details einen originellen Ansatz entwickelt, um zu erreichenMessung der lokalen mechanischen Parameter in situ, ohne den Biofilm zu stören und damit Zeichnung der räumlichen Verteilung der Mikromaterialeigenschaften und dann die mechanische Heterogenität. Das Prinzip des Experiments beruht auf der Dotierung des wachsenden Biofilm mit magnetischen Mikropartikeln, gefolgt von deren Fernladen mit magnetischen Pinzette in der reifen Biofilm. Partikelverschiebung unter kontrollierten Magnetkraft-Anwendung unter dem Mikroskop abgebildet ermöglicht lokalen viskoelastischen Parameter Ableitung, jedes Teilchen seine eigene lokale Berichterstattung Umwelt. Aus diesen Daten kann die mechanische 3D-Profil des Biofilms gezogen werden, offenbart räumlichen und ökologischen Zustand Abhängigkeiten. Das ganze Experiment wird hier auf einem E. gezeigt werden, coli Biofilm von einer gentechnisch veränderten Stamm, der eine dereprimierten F-Plasmid wie gemacht. Die Ergebnisse in einer aktuellen Papier 18 beschrieben eine einzigartige Sicht des Inneren des intakten Biofilm Mechanik.
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Protocol
1. Bakterien, Kultur und Hänge Vorbereitung
- Wählen Sie einen frisch gewachsenen Kolonie von einer Lysogenität Broth (LB)-Agar-Platte, impfen sie in 5 ml flüssigem LB-Medium mit 100 μ g / ml Ampicillin und 7,5 μ g / ml Tetracyclin und Inkubation es für 5 bis 6 Stunden bei 37 ° C auf eine schwankende Plattform.
- Dann wird mit 100 μ l der Bakterienkultur in 5 ml Minimalmedium (M63B1) mit 0,4% Glucose und die gleichen Konzentrationen an Antibiotikum ergänzt. Inkubation dieses frisch verdünnten Kultur über Nacht bei 37 ° C auf einem Schüttler.
- Nach 16 h Inkubation mit 100 ul der Übernachtkultur zu 5 ml M63B1, 0,4% Glucose. Halten der Röhre bei 37 ° C zu der Schüttlerplattform, bis eine OD von 0,5 erreicht ist. Anschließend wird die Suspension zur Injektion in die Kanalexperiment für die Biofilmbildung bereit.
2. Magnetic Particle Vorbereitung
- Nehmen Sie sich 10 ul magnetischen Partikeln -2,8 μ m Durchmesser - aus dem Bestand und waschen Sie sie 3x in 190 ul Minimalmedium mit Hilfe eines magnetischen Probe-Rack.
- Einstellen der Partikelkonzentration auf 5 × 10 6 Perlen / ml. Typischerweise 50 ul der gewaschenen Perle Lösung wird mit einer weiteren 950 μ l M63B1 mit 0,4% Glucose gemischt.
3. Kanal Vorbereitung und Biofilmwachstum
- Kanal-Montage
- Schneiden Sie zwei Quadratmeter (800 μ m Seitenlänge) Borosilikatglas Kapillaren 10 cm lang, zwei 8 cm lange Stücke zu erhalten.
- Kleben Sie die beiden Kapillare Stücke auf zwei Glasplättchen - mit 1 cm Überhang an beiden Enden, wie in Abbildung 1 2 cm Abstand mit einem schnell wirkenden Sekundenkleber (so genannte Super-Kleber) - halbiert zuerst.
- Autoklavieren die gesamte Einrichtung und die notwendigen Rohre für weitere Kanalverbindung erforderlich.
- Sammeln Sie alle sterilen Materialien untereine laminare Strömung Haube: i) die montiert Kanal und Falle 1, ii) die Schläuche und Anschlüsse, iii) die beiden Blasenfallen - die Blase Filter häufig verwendet, um Kindertropf Fütterung (Trap 1) und die hausgemachten Blasenfalle sichern ein 4 cm langes Rohr mit einem größeren Durchmesser (Falle 2), iv) Klemmen, v) 30 ml Spritzen mit M63B1, 0,4% Glucose, und vi) der Abfallflasche gefüllt.
- Schließen Sie das ganze Setup mit Luer-Lock-connecters oder Verbindungen in der folgenden Reihenfolge: 50 ml Spritze M63B1 von der Spritzenpumpe, Pädiatrie, Filterblase, hausgemachte Blasenfalle, Kapillar (Abbildung 1, Feld B), und das Rohr auf die Abfallflasche gesteuert. Dann füllen die Einrichtung mit sterilem M63B1, 0,4% Glucose, wodurch der Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 ml / h höher als die Versuchsraten. Sorgfältig zu verfolgen und zu beseitigen alle Luftblasen in der Schaltung.
- Durchfluss des Mediums durch das System für 10-15 min; gleichzeitig mischen Sie 1 ml der Bakteriensuspension bei OD 0,5 aus Abschnitt1.3 mit 1 ml der in Abschnitt 2.2 vorbereitet Bead-Lösung gewaschen.
- Befestigen (aber nicht schließen) Schellen auf den Schlauch an zwei Stellen: vor und nach den Kapillaren. Schalten Sie den Strom ab.
- Führen Sie die Bakterien-Bead-Mischung in die Kapillare nach dem hausgemachten Blasenfalle mit einer 1-ml-Spritze, die Pflege zu halten, bis die Rohrenden, um Lufteintritt zu verhindern. Befestigen Sie die Schläuche und schließen Sie die Klemmen.
- Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Kapillare und lassen Sie sich die Rohre für Blasen.
- Übertragen Sie das Gerät an das Mikroskop und lassen Sie es für 15-20 Minuten stehen, um die Bakterien zu ermöglichen, sich niederzulassen und heften sich an die Oberfläche der Kapillare. Installieren Sie die Kapillare auf den Mikroskoptisch mit dem Abfallbehälter auf einem etwas höheren Niveau. Legen Sie die Spritzenpumpe auf der Theke neben dem Mikroskop. Elevate die Blasenfalle vor der Kapillare etwas höher als der Kapillar-Ebene, um Luftblasen zu erfassen.
- Biofilm Growth
- Die Durchflussmenge an der Spritzenpumpe und starten Sie den Fluss, wird der Biofilm jetzt auf der Kapillare Oberfläche entwickeln während der vorgeschriebenen Frist - in der Regel 24 oder 48 Stunden in diesen Experimenten.
- Konzentrieren Sie sich auf die Kapillare unteren Ebene und starten Sie die Zeitraffer-Aufnahme der Musterbilder - in der Regel eine Aufnahmefrequenz von 2 Bildern / min angemessen berichten über die Biofilmwachstum. Dieses Video Monitore Biofilmwachstum post-Kontrolle (siehe Auszüge in Videos 1, 2 und 3).
4. Magnetische Pinzette Installations
- Schrauben Sie die magnetischen Pinzette auf manuell gesteuerten XYZ Mikromanipulatoren und schrauben Sie die Mikromanipulatoren auf dem Mikroskoptisch, um die Position der Pinzette relativ zur Kapillare anzupassen. Platzieren der Pinzette wie in Fig. 2 zu gewährleisten, die entsprechende magnetische Feldgradient in der Beobachtungszone erzeugt.
- Verbinden Sie die Pinzette to der Funktionsgenerator über den Leistungsverstärker, um eine 40 Sek. Zeitdauer von 24 sec Nullsignal und 16 Sekunden von 4 A Gleichstrom mit einer Trigger auf der Hellfeldlichtverschluss nach 20 sec für die Signalsynchronisation geschickt, um eine Folge aus erzeugen Ereignisse wie in 3.
Anmerkung: Diese beiden Vorgänge können zu jeder Zeit zwischen Kapillare Installation und Messbeginn erreicht werden. Siehe experimentieren Überblick Skizze in Abbildung 4.
5. Creep Curve Acquisition
- Verwenden der XY Bewegungssteuerung des Mikroskoptisches, um den Rand der linken magnetischen Pol und dem linken Rand der Kapillare in der gleichen Beobachtungsfeld zu bringen. Dem Ursprung des Bezugs Analyse am Schnittpunkt der x-und y-Achsen, die durch den Rand der Kapillare definiert ist und der Rand des Polschuhs bzw. (siehe Fig. 2).
- Stellen Sie die vertikale Position der Kapillare mit Feinfokus control Knopf des Mikroskops Position. Typischerweise wird die erste untersuchte Ebene zwischen 4 bis 7 μ m über dem Boden der Kapillare befindet. Video 1 entspricht dem XY-Feld, dessen obere linke Ecke an dem Ursprung des räumlichen Bezugs hat.
- Auslöser der Sequenz von 40 sec in Abschnitt 4.2 und Figur 3 durch Einschalten der Stromgenerator und zugleich beschriebenen Ereignisse manuell die Bildaufnahmesequenz von Video 1 auszulösen.
- Bewegen Sie die Kapillare an den Nachbarn rechten Feld von einem 250 μ m Übersetzung des Mikroskoptisches nach links und arbeiten wie in Abschnitt 5.3 auf Video 2 von 2 Slice erzeugen und so weiter, um die erforderlichen Videos zu erhalten. Typischerweise 3 bis 4 Felder von 250 x 250 μ m 2 sind entlang der x-Achse vor dem Wechsel der Ebene und Wiederholen der gleichen Vorgänge für die neue Ebene gesammelt.
6. Kraftkalibrierung
- Bereiten Sie eine Glycerin-Lösung durch Mischen von 39,8 g Glycerin mit 190 μ l bi-destilliertem Wasser und 10 ul von magnetischen Teilchen in einem 2 x 10 9 Partikel / ml und füllen ein Versuchskanal mit dieser Mischung und legen Sie es auf den Mikroskoptisch wie für die Biofilmprobe beschrieben.
- Nach der Installation der magnetischen Pinzette, wie in Abschnitt 4 angegeben, gelten die Magnetkraft, wie in Abschnitt 5.4 angegeben, und machen Zeitraffer-Aufnahmen, jede einzelne Partikelgeschwindigkeit (v) und seine Position in der Kapillare zu extrahieren, um die Kalibrierungsdatei abzuleiten. Diese Datei sollte die aufgebrachte Kraft als Funktion der seine Position in der Zone der Analyse der Kapillare nach Stokes-Gesetz enthalten, F = 6πRηv (R: Radius der Teilchen).
7. Analyse
- Verwenden Sie ein "Teilchen-Tracker"-Software, um Text-Dateien mit der Partikelpositionen in jedem Rahmen für all die Stapel von Bildern erworben, wie in Abschnitt 5 angedeutet erhalten. Arbeg die Bildstapel Erfassungsfrequenz, die Berechnung der Partikelverschiebung als Funktion der Zeit (z. B. Fig. 5 und Video 4).
- Mit der Kraft Kalibrierungsdatei, wandeln die Verschiebungskurven, um die Einhaltung Kurven (Gesamt Konformität des Materials - J (t) - in Abhängigkeit von der Zeit) nach der Einhaltung Formel:
die das Verhältnis zwischen Materialdehnung ergibt und angelegten Spannung für eine Sonde Teilchen mit dem Radius R in einem nicht komprimierbaren, homogenen viskoelastische Medium eingebettet ist, wie zuvor von Schnurr et al 19 hergestellt. - Stellen Sie die Zeitstandkurven der allgemeinen Burgers-Modell für viskoelastische Materialien und leiten die viskoelastischen Parameter, J 0, J 1, η 0, η 1 für jedes Teilchen (
Anmerkung: Diese phänomenologische Analyse vorher für eine Vielzahl von Materialien, einschließlich biologischer Materialien wie Biofilme zu makroskopischen Rheologie interpretieren 20-22 eingesetzt.
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Representative Results
Eine typische Analyse der räumlichen Verteilung der viskoelastischen Parameter im Mikrometerbereich auf einem Biofilm lebenden bereitzustellen, ohne seine ursprüngliche Anordnung stören. Die elastische Nachgiebigkeit - - in Abhängigkeit von der z-Achse entlang der Tiefe und der y-Achse entlang einer lateralen Abmessung des Biofilms gegeben Typische Ergebnisse sind in Figur 7, wo die Werte von J 0 gezeigt. Jeder Punkt entspricht einer Perle, die Kriech-Kurvenanalyse hat eine J 0-Wert zur Verfügung gestellt. Die Daten zeigten, dass die lokalen Compliance entlang der Tiefe des Biofilms über fast drei Größenordnungen, sondern auch, dass starke laterale Heterogenität variiert fand bei allen Biofilm Höhen.
Die Daten gaben auch den Zugriff auf die Verteilung der Compliance-Werte, die hier weit verbreitet und eine asymmetrische Form (Abbildung 8) ausgestellt und bietet starke Hinweise darauf, dass die mechanischen Eigenschaften des Biofilms wurden unterstützt vonhochvernetzten Polymergelen. Tatsächlich hat ein analoges Verhalten vorher für konzentrierte und hochvernetzte Gele Actin 23 gezeigt.
Darüber hinaus sind diese in-situ-Messungen von Biofilm lokalen Eigenschaften unter verschiedenen Umweltbedingungen wie niedrige Strömungsrate durchgeführt zu ermöglichen, die Wirkung einer solchen Veränderung auf dem Biofilm interne Organisation zu demonstrieren. In Fig. 9 sind die Nachgiebigkeitswerte eines Biofilms mit 0,1 ml / h gewachsen zeigten eine sehr heterogene noch mechanisches Profil, aber keine höhere Steifigkeit des tieferen Biofilmschicht im Vergleich zu den Biofilm bei 1 ml / h aufgewachsen. Diese Ergebnisse zeigen die erheblichen Auswirkungen der äußeren Bedingungen auf dem Biofilm Organisation.
2. Positionierung des Magnet Pinzette in bezug auf die Kapillare auf dem Mikroskoptisch und Definition des räumlichen Bezugs. Die Draufsicht zeigt die Position der Messzone in der Kapillare.
3. Synchronisation der Signale über 40 sec Zeit.
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Abbildung 4. Experiment Überblick Skizze.
Abbildung 5. Auszüge aus Teilchenbahn Analyse. Abbildung A zeigt auf der linken Seite das Bild eines typischen Partikel in seiner Anfangsposition kurz vor Magnetkraft-Anwendung (Zeit 23.79 Sek. 40 Sek. der Periode) und rechts die Position des Teilchens Zeit 30 Sek. zusammen mit der Anzeige der Flugbahn gefunden mit ImageJ Partikel Tracker Tafel B zeigt die Handlung des Verschiebungskurve aus diesen Daten abgeleitet. Hier zeigen wir eine Bahn-Extrakt ab 23.79 sec Zeit bis zum Zeitpunkt t = 31,29 sec der 40 Sekunden Zeit.
Abbildung 6. Viskoelastische Parameter Ableitung auf der Grundlage der phänomenologischen Modell der Burger. (A) Burger mechanisches Modell, bestehend aus einer Kombination von elastischen Hookeschen Feder (J 0) und Newtonschen Dämpfer in Serie mit einer Maxwell-Element (Feder ((η 0) J 1) und Dämpfer (η 1) parallel). (B) Creep experimentellen Spuren in blau zusammen mit der Kurve (in grün) mit dem Burgers-Gleichung angepasst.
Figur 7. Räumliche Verteilung der elastischen Nachgiebigkeit in einem Biofilm gezüchtet 24 h bei 37 ° C unter 1 ml / h Nährstoffe fließen. Compliance-Werte von jedem Teilchen berichtet werden hier als Projektion auf eine (yz)-Ebene mit einem kühlen, um benutzerdefinierte Farbkarte erwärmen vertreten. Compliance-Werte von Teilchen in der unteren Schicht des Biofilms angeordnet berichtet alle niedriger als 0,2 m 2 / N, während Teilchen in den oberen 15 μ m Schicht Bericht Werte über 1 m 2 / N. gefunden
Figur 8. Normalized Verteilungen der in Biofilm (A) und Glycerin (B) erhaltenen viskoelastischen Parameter eine homogene viskose Flüssigkeit. Biofilm zeigten asymmetrisch und Verbreitung (Schiefe von 3,6 und normierte Varianz 2.4) anzeigt Material Heterogenität. Im Gegensatz dazu wurde symmetrischen und enge Verteilung Charakterisierung eines homogenen Mediums in Glycerin (Schiefe von 0,23 und der normierten Varianz 0,03) erhalten.
Figur 9. Räumliche Verteilung der elastischen Nachgiebigkeit in einem Biofilm gezüchtet 24 h bei 37 ° C unter einem niedrigeren Fluss von 0,1 ml / h Nährstofffluss. Compliance-Werte werden nach der Biofilm Tiefe dargestellt. Symbol Farben geben die Compliance-Bereiche.
Abbildung 10. Magnetische Pole Blaupause. Die Maße sind in cm angegeben.
Abbildung 11. Magnetische Pinzette Verdrahtung. Panel A - wird verwendet, um fest wickeln die 2120 Windungen Kupferdraht und bauen die Magnetspule (Feld B) vor dem Einsetzen der weichmagnetischen Legierung Pol in der Mitte. Gleichstrom in der Spule geliefert Definition magnetische Polarität wie in Abbildung C gezeigt. Siehe auch experimentieren Überblick Skizze in Abbildung 4.
Video 1: Der Film zeigt die Anfangsstufe der Biofilm nur nach Injektion der Zellen-Partikel-Gemisches in der Kapillare. Erwerb Frequenz beträgt 1 Bild / s und der Film mit 10 Bildern / sec gespielt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.
Video 2: Dieser Film zeigt die Biofilm nach 4 h Wachstum. Teilchen von der Oberfläche in den in die b verteilt Reihen iofilm Volumen, blaue Pfeile markieren Ablösung Veranstaltungen. Erwerb Frequenz 2 image / min und der Film mit 15 Frames / sec gespielt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.
Video 3: Biofilm nach 20 h Wachstum. Der Film wird in einer mittleren Ebene 20 um über dem Boden angeordnet Kapillare entnommen. Die Bilder wurden bei 2 Bildern / min Frequenz erworben und der Film mit 15 Frames / sec gespielt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.
Video 4: Typische Partikelverfolgung mit ImageJ. Der Film zeigt einen Auszug aus der gesamten Sequenz ab dem Zeitpunkt 23 sec und endet zur Zeit 30 sek. Gelb und Weise zeigt Teilchenverschiebung auf Magnetbetätigung. Erwerb Frequenz 30 Bilder / s und der Film mit 30 Frames / sec gespielt.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um dieses Video zu sehen.
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Discussion
Diese Magnetpartikel Säen und Ziehen Experiment in situ 3D-Mapping der viskoelastischen Parameter eines wachsenden Biofilm in seinen ursprünglichen Zustand aktiviert. Dieser Ansatz zeigte die mechanische Heterogenität der E. coli Biofilm hier aufgewachsen und gab Hinweise darauf hinweisen, die Biofilm-Komponenten unterstützen die Biofilm-physikalischen Eigenschaften, was stark darauf hindeutet eine fundamentale Implikation der extrazellulären Matrix und genauer den Grad der Vernetzung.
Die Anerkennung der mechanischen Eigenschaften Muster in bakteriellen Biofilm ist entscheidend für den Aufbau einer umfassenden Darstellung dieser komplexen Materialien. Diese Ergebnisse eröffnen die Möglichkeit, die kausalen Zusammenhänge verknüpfen mechanische und biologische Muster Heterogenitäten wie Genexpression microniches, die helfen sollen, die Klärung der zugrunde liegenden Triebkräfte Biofilmentwicklung zu klären.
Bis jetzt ist die Frage des Biofilms mechanischen Eigenschaften hatte vor allem aus einer makroskopischen Sicht durch Schaben Biofilm aus seiner Anfangs Website 8,9,12,13, die eine wichtige Gefahr eines Datenverlusts stellt angesprochen und oft. Unsere nicht-invasives Verfahren bringt den ersten in-situ-Charakterisierung der Biofilm mechanische 3D-Profil in seiner ursprünglichen Umgebung.
Der Ansatz hat noch eine Einschränkung mit Wohnsitz in den Eigenschaften der magnetischen Fernbetätigung von kolloidalen Sonden. Tatsächlich zeigt es eine Reihe von Eigen zugänglich Kräfte von der Pole-Teilchen-Abstand-, Mast-und Materialeigenschaften Spulenleistung gegeben. Die aktuelle Konfiguration der Set-up konnte die Sondierung der Steifigkeitswerte von bis zu 200 Pa, die für die hier untersuchten Biofilme ausreichend war. Dennoch weiteren Engineering von unserem Set-up - mit zum Beispiel Elektrokühlung - sollte Verschiebung der Kraft-und Zeitgrenzen um den Faktor 2 bis 3 zu ermöglichen.
We arbeiten derzeit an über die physikalischen und dynamischen Eigenschaften in einem Biofilm die Untersuchung der Beziehung verbindet lokale viskoelastischen Parameter durch die passive Verschiebung der Sonde in einem größeren Zeitskala angegeben. Außerdem prüfen wir die Auswirkungen verschiedener Chemikalien an die verschiedenen Komponenten des Biofilms auf seine mechanischen Profil.
Dieser neue Ansatz zeigt die Details der bakteriellen Biofilm internen Mechanik und trägt zu einem besseren Verständnis dieser lebendigen Strukturen, entscheidend aus der Sicht eines Ingenieurs für Biofilm-Kontrolle, sondern auch aus fundamentaler Sicht, um die Beziehung zwischen den architektonischen Eigenschaften und der spezifischen klären Biologie dieser Strukturen.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse von der Agence Nationale pour la Recherche, PIRIbio Programm Dynabiofilm und vom CNRS Interdisziplinäre Risiko Programm unterstützt. Wir danken Philippe Thomen für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Christophe Beloin für die Bereitstellung der E. coli-Stamm in dieser Arbeit verwendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
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