Summary
यह पत्र एक जीवाणु biofilm और बगल में इंटरफेस पर सूक्ष्म जीवों द्वारा निर्मित परिसर में रहने वाले माल की स्थानीय यांत्रिक गुणों को मापने के लिए समर्पित चुंबकीय चिमटी के विकास में वरीयता प्राप्त चुंबकीय कणों के दूरस्थ actuation पर आधारित एक मूल कार्यप्रणाली को दर्शाता है.
Abstract
इंटरफेस पर बैक्टीरियल आसंजन और विकास तीन आयामी विषम संरचनाओं तथाकथित biofilms के गठन के लिए नेतृत्व. इन संरचनाओं में रहने वाली कोशिकाओं कोशिकी polymeric पदार्थों के एक नेटवर्क के द्वारा मध्यस्थता शारीरिक संबंधों से एक साथ आयोजित की जाती हैं. बैक्टीरिया biofilms कई मानव गतिविधियों को प्रभावित और उनके गुणों की समझ उनके विकास का एक बेहतर नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है - रखरखाव या उन्मूलन - उनके प्रतिकूल या लाभदायक परिणाम के आधार पर. इस पत्र अब तक, केवल एक macroscopic और सजातीय सामग्री के नजरिए से जांच की, सीटू में किया गया था कि biofilm की स्थानीय भौतिक गुणों को मापने के लिए लक्ष्य एक उपन्यास पद्धति का वर्णन करता है. यहाँ वर्णित प्रयोग दूर से biofilm की संरचनात्मक गुणों के बिना परेशान प्रेरित किया जा सकता है कि स्थानीय जांच बीज के लिए एक से बढ़ biofilm में चुंबकीय कणों को शुरू करना शामिल है. समर्पित चुंबकीय चिमटी एच.डी. थेbiofilm में एम्बेडेड प्रत्येक कण पर एक परिभाषित बल डालती loped. सेटअप कण खींच अवधि के समय चूक छवियों की रिकॉर्डिंग सक्षम करने के लिए एक खुर्दबीन के मंच पर मुहिम शुरू की है. कण trajectories तो खींच अनुक्रम से निकाले जाते हैं और स्थानीय viscoelastic मापदंडों जिससे मापदंडों की 3 डी स्थानिक वितरण प्रदान करने, प्रत्येक कण विस्थापन की अवस्था से निकाली गई है. Biofilm यांत्रिक प्रोफाइल में अंतर्दृष्टि रहा वास्तु गुण और इन संरचनाओं के विशिष्ट जीव विज्ञान के बीच संबंधों को स्पष्ट करने के लिए biofilm नियंत्रण प्रयोजनों के लिए देखने के एक इंजीनियर के बिंदु से, लेकिन यह भी एक मौलिक दृष्टिकोण से आवश्यक है.
Introduction
बैक्टीरिया biofilms जैविक या कृत्रिम सतहों 1-3 से जुड़े बैक्टीरिया के समुदाय हैं. वे भवन 4,5 रक्षा करता है और स्थिर है कि polysaccharide युक्त बाह्य मैट्रिक्स के उत्पादन के साथ मिलकर एक आसंजन विकास तंत्र द्वारा के रूप में. इन biofilms सतहों के लिए अटक कोशिकाओं की बस निष्क्रिय assemblages नहीं कर रहे हैं, लेकिन संगठित और गतिशील जटिल जैविक प्रणालियों. बैक्टीरिया biofilm जीवन शैली के लिए planktonic से चले जाते हैं, जीन अभिव्यक्ति और सेल फिजियोलॉजी में परिवर्तन antimicrobials के लिए बढ़ा प्रतिरोध के रूप में भी मनाया जाता है और कई लगातार और पुराने संक्रमण 6 के मूल में किया जा रहा है प्रतिरक्षा सुरक्षा साधनों की मेजबानी कर रहे हैं. हालांकि, इन जीवित संरचनाओं का नियंत्रित विकास भी इस तरह के खतरनाक कचरे साइटों के जैविक उपचार, औद्योगिक पानी या contamin से मिट्टी और भूजल को बचाने के लिए जैव बाधाओं के गठन की जैव निस्पंदन के रूप में औद्योगिक और पर्यावरण अनुप्रयोगों के लिए अवसरों की पेशकशसमझना.
जीवन की biofilm तरह से करने के लिए विशिष्ट आणविक सुविधाओं को तेजी से वर्णित हैं जबकि, सामुदायिक विकास और दृढ़ता ड्राइविंग तंत्र अस्पष्ट रहते हैं. स्कैनिंग विद्युत रासायनिक या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग microscale माप पर हाल के अग्रिमों का उपयोग करना, इन रहने वाले संगठनों संरचनात्मक, रासायनिक और जैविक विविधता 7 काफी प्रदर्शन दिखाया गया है. फिर भी, अब तक, biofilm यांत्रिकी मुख्य रूप से macroscopically जांच की गई है. उदाहरण के लिए, biofilm स्ट्रीमर के अवलोकन के कारण द्रव प्रवाह की दर 8,9 में बदलाव के विरूपण, biofilm टुकड़े का अक्षीय संपीड़न अगर मध्यम से लिफ्ट या कवर तो 10,11, पर्यावरण से एकत्र biofilm की कतरनी और एक समानांतर को हस्तांतरित स्लाइड पर हो थाली rheometer 12,13, एक AFM ब्रैकट 14 या एक समर्पित माइकर से जुड़ी एक जीवाणु biofilm साथ एक गिलास मनका और लेपित का उपयोग परमाणु शक्ति स्पेक्ट्रोस्कोपीअलग biofilm टुकड़े 15,16 की तन्यता ताकत को मापने के लिए ocantilever विधि सामग्री 17 के viscoelastic प्रकृति पर उपयोगी जानकारी प्रदान करने, दस पिछले वर्षों के दौरान लागू किया गया है. हालांकि, यह सामग्री अक्सर इन तरीकों में मामला था जो अपने मूल पर्यावरण, से निकाल दिया जाता है जब सीटू biofilm यांत्रिक गुणों में बारे में जानकारी खो दिया है कि संभावना लगती है. इसके अलावा, एक सजातीय सामग्री के रूप में biofilm के उपचार समुदाय के भीतर भौतिक गुणों के संभावित विविधता के बारे में जानकारी का अभाव है. इसलिए, संरचना biofilm गठन में यांत्रिकी और इस तरह के जीन अभिव्यक्ति patterning या रासायनिक ढ़ाल के रूप में जैविक तत्वों के सटीक निहितार्थ शायद ही पहचाना जा सकता है. Biofilm भौतिक गुणों की एक microscale विवरण की दिशा में प्रगति करने के लिए, नई समर्पित उपकरण की आवश्यकता है.
इस पत्र को प्राप्त करने की कल्पना की एक मूल दृष्टिकोण विवरणbiofilm परेशान और microscale गुण सामग्री के स्थानिक वितरण की ड्राइंग और फिर यांत्रिक विविधता सक्षम किए बिना बगल में स्थानीय यांत्रिक मापदंडों की माप. प्रयोग के सिद्धांत परिपक्व biofilm में चुंबकीय चिमटी का उपयोग कर अपने दूरस्थ लोड हो रहा द्वारा पीछा चुंबकीय microparticles के साथ एक से बढ़ biofilm की डोपिंग पर टिकी हुई है. खुर्दबीन के नीचे imaged नियंत्रित चुंबकीय शक्ति आवेदन के तहत कण विस्थापन स्थानीय viscoelastic पैरामीटर व्युत्पत्ति, अपनी ही स्थानीय पर्यावरण रिपोर्टिंग प्रत्येक कण में सक्षम बनाता है. इन आंकड़ों से, biofilm की 3 डी मैकेनिकल प्रोफाइल स्थानिक और पर्यावरण हालत dependences खुलासा खींचा जा सकता है. पूरे प्रयोग एक ई. पर यहाँ दिखाया जाएगा एक derepressed एफ की तरह प्लाज्मिड ले जाने के एक अनुवांशिक इंजीनियर तनाव द्वारा किए गए कोलाई biofilm. हाल ही में एक कागज 18 में विस्तृत परिणाम बरकरार biofilm यांत्रिकी के इंटीरियर का एक अद्वितीय दृष्टि प्रदान करते हैं.
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Protocol
1. बैक्टीरिया संस्कृति और निलंबन की तैयारी
- एक Lysogeny शोरबा (पौंड) अगर प्लेट से एक हौसले से उगाया कॉलोनी उठाओ तरल लेग मध्यम 100 μ जी / एमएल एम्पीसिलीन और 7.5 μ जी / एमएल टेट्रासाइक्लिन युक्त 5 मिलीलीटर में यह टीका लगाना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 से 6 घंटे के लिए यह सेते एक मंच मिलाते हुए.
- तो, कम से कम मध्यम (M63B1) 0.4% ग्लूकोज और एक ही एंटीबायोटिक सांद्रता के साथ पूरक 5 मिलीलीटर में जीवाणु संस्कृति की 100 μ एल जोड़ें. एक मिलाते हुए मंच पर 37 डिग्री सेल्सियस पर इस हौसले पतला संस्कृति रातोंरात सेते हैं.
- ऊष्मायन के 16 घंटे के बाद, 5 एमएल M63B1, 0.4% ग्लूकोज को रातोंरात संस्कृति μl 100 जोड़ें. एक 0.5 आयुध डिपो तक मिलाते हुए मंच को 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब रखें पहुँच जाता है. निलंबन biofilm गठन के लिए प्रयोग चैनल में इंजेक्शन के लिए फिर तैयार है.
2. चुंबकीय कण तैयारी
- 10 μl चुंबकीय कण ले -2.8 μ व्यास में एम - शेयर से और उन्हें धोने एक चुंबकीय नमूना रैक की सहायता से 190 μl न्यूनतम मध्यम में 3x.
- 5 एक्स 10 6 मोती / एमएल कण एकाग्रता समायोजित करें. आमतौर पर धोया मनका समाधान के 50 μl 0.4% ग्लूकोज के साथ M63B1 का एक और 950 μ एल के साथ मिलाया जाता है.
3. चैनल तैयार करना और biofilm विकास
- चैनल बढ़ते
- दो 8 सेमी लंबे टुकड़े प्राप्त करने के लिए 10 सेमी लंबा दो वर्ग (800 μ मीटर लंबाई की ओर) borosilicate ग्लास केशिकाओं काटें.
- पहली छमाही में कटौती - - 2 सेमी अलावा 1 सेमी की अधिकता के साथ दोनों छोर पर चित्रा 1 के रूप (ताकि सुपर गोंद कहा जाता है) एक तेजी से अभिनय cyanoacrylate गोंद का उपयोग करते हुए दो गिलास स्लाइड पर दो केशिका टुकड़े गोंद.
- पूरे सेटअप और आगे चैनल कनेक्शन के लिए आवश्यक आवश्यक ट्यूबिंग आटोक्लेव.
- सभी बाँझ सामग्री के नीचे इकट्ठाएक लामिना का प्रवाह हुड: मैं) घुड़सवार चैनल और जाल 1, द्वितीय) ट्यूबिंग और कनेक्टर्स, तीन) दो बुलबुला जाल - बुलबुला फिल्टर आमतौर पर बच्चों की ड्रिप खिला (जाल 1) और घर का बना बुलबुला जाल सुरक्षित किया बड़े व्यास की एक 4 सेमी लंबी ट्यूब (जाल 2) के रूप में, चतुर्थ) clamps, वी) M63B1, 0.4% ग्लूकोज, और vi) बेकार की बोतल के साथ भरा 30 मिलीलीटर सीरिंज.
- बेकार की बोतल के लिए सिरिंज पंप, बाल चिकित्सा बुलबुला फिल्टर, घर का बना बुलबुला जाल, केशिका (चित्रा 1, पैनल बी), और ट्यूब के द्वारा नियंत्रित 50 मिलीलीटर M63B1 सिरिंज: निम्न क्रम में luer ताला connecters या जंक्शनों के साथ पूरे सेटअप कनेक्ट करें. तब के बारे में 10 मिलीग्राम / घंटा, प्रयोगात्मक दर से अधिक की दर से सिरिंज पंप पर मोड़, बाँझ M63B1, 0.4% ग्लूकोज के साथ सेटअप भरें. ध्यान से ट्रैक और सर्किट में सभी बुलबुले को खत्म करने.
- 10-15 मिनट के लिए प्रणाली के माध्यम से मध्यम प्रवाह; समवर्ती धारा से आयुध डिपो 0.5 पर बैक्टीरिया निलंबन के 1 मिलीलीटर मिश्रणधारा 2.2 में तैयार धोया मनका समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ 1.3.
- पहले और बाद में केशिकाओं: संलग्न (लेकिन पास नहीं है) दो पदों पर टयूबिंग clamps. प्रवाह बंद कर दें.
- ट्यूब को पकड़ देखभाल करने के लिए हवा प्रवेश को रोकने के लिए समाप्त हो जाती है, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर घर बनाया बुलबुला जाल के बाद केशिका में बैक्टीरियल मनका मिश्रण का परिचय. ट्यूबिंग फिर से जोड़ना और फिर clamps बंद करें.
- दूसरा केशिका के लिए एक ही प्रक्रिया को दोहराएँ और बुलबुले के लिए सभी ट्यूबों की जाँच करें.
- माइक्रोस्कोप के लिए तंत्र हस्तांतरण और इसे व्यवस्थित करने और केशिका की सतह को संलग्न करने के लिए बैक्टीरिया सक्षम करने के लिए 15-20 मिनट के लिए खड़े होने की अनुमति देते हैं. एक थोड़ा उच्च स्तर पर बर्बाद कंटेनर के साथ खुर्दबीन मंच पर केशिका स्थापित करें. माइक्रोस्कोप के पास काउंटर शीर्ष पर सिरिंज पंप रखें. बुलबुले पर कब्जा करने के लिए केशिका विमान से थोड़ा अधिक केशिका से पहले बुलबुला जाल तरक्की.
- Biofilm Growth
- आमतौर पर 24 या 48 घंटे इन प्रयोगों में - सिरिंज पंप पर प्रवाह दर को समायोजित करें और प्रवाह शुरू, biofilm अब आवश्यक अवधि के दौरान केशिका सतह पर विकास होगा.
- केशिका नीचे विमान पर ध्यान दें और नमूना छवियों के समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू - 2 छवियों का आमतौर पर एक अधिग्रहण आवृत्ति / मिनट पर्याप्त रूप से biofilm विकास रिपोर्ट करेंगे. इस वीडियो पर नज़र रखता biofilm विकास के बाद नियंत्रण (वीडियो 1, 2 में निष्कर्षों को देखने और 3).
4. चुंबकीय चिमटी स्थापना
- मैन्युअल रूप से नियंत्रित XYZ micromanipulators पर चुंबकीय चिमटी भाड़ और अपेक्षाकृत केशिका को चिमटी की स्थिति को समायोजित करने के लिए खुर्दबीन मंच पर micromanipulators पेंच. उपयुक्त चुंबकीय क्षेत्र ढाल अवलोकन क्षेत्र में उत्पन्न होता है यह सुनिश्चित करने के लिए चित्रा 2 के रूप चिमटी रखें.
- चिमटी टी कनेक्टओ शक्ति एम्पलीफायर के माध्यम से समारोह जनरेटर 24 सेकंड शून्य संकेत और 4 के एक दृश्य प्रदान करने के संकेत तुल्यकालन के लिए 20 सेकंड के बाद उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश शटर को भेजे गए एक ट्रिगर के साथ एक प्रत्यक्ष वर्तमान के 16 सेकंड के बने समय की एक 40 सेकंड की अवधि उत्पन्न करने के लिए चित्रा 3 में के रूप में घटनाओं.
नोट: इन दोनों अभियानों केशिका स्थापना और माप शुरुआत के बीच किसी भी समय हासिल की जा सकती है. चित्रा 4 में अवलोकन स्केच प्रयोग देखें.
5. कमीना वक्र अधिग्रहण
- बाएं हाथ के चुंबकीय ध्रुव और एक ही अवलोकन क्षेत्र में केशिका के बाएं हाथ की बढ़त के किनारे लाने के लिए खुर्दबीन मंच के XY आंदोलन नियंत्रण का प्रयोग करें. (देखें चित्र 2) क्रमशः, केशिका के किनारे से परिभाषित एक्स और वाई-कुल्हाड़ियों के चौराहे और ध्रुव टुकड़ा के किनारे पर विश्लेषण referential की उत्पत्ति लो.
- ठीक फोकस सी का उपयोग केशिका के ऊर्ध्वाधर स्थिति को समायोजित करेंमाइक्रोस्कोप स्थिति की ontrol घुंडी. आमतौर पर पहले जांच की विमान μ 4-7 के बीच एम केशिका नीचे से ऊपर स्थित है. वीडियो 1 स्थानिक निर्देशात्मक के मूल में अपने शीर्ष बाएँ हाथ कोने है कि XY क्षेत्र से मेल खाती है.
- वर्तमान जनरेटर पर और एक ही समय में स्विचन द्वारा खंड 4.2 और चित्रा 3 में वर्णित घटनाओं के 40 सेकंड अनुक्रम ट्रिगर, मैन्युअल रूप से वीडियो 1 की छवि अधिग्रहण अनुक्रम ट्रिगर.
- आवश्यक वीडियो प्राप्त करने के लिए इतने पर बाईं ओर खुर्दबीन मंच की एक 250 μ मीटर अनुवाद द्वारा पड़ोसी अधिकार क्षेत्र को केशिका ले जाएँ और टुकड़ा 2 से 2 वीडियो उत्पन्न करने के लिए खंड 5.3 में के रूप में काम करते हैं और. 250 X 250 μ एम 2 के आम तौर पर 3 से 4 क्षेत्रों विमान बदल रहा है और नए विमान के लिए एक ही आपरेशन दोहरा से पहले एक्स अक्ष के साथ एकत्र कर रहे हैं.
6. बल अंशांकन
- द्वि आसुत पानी की 190 μ एल और एक 2 x 10 9 कणों / मिलीलीटर में चुंबकीय कणों के 10 μl के साथ ग्लिसरॉल के 39.8 ग्राम मिश्रण से एक ग्लिसरॉल समाधान तैयार है और इस मिश्रण के साथ एक प्रयोगात्मक चैनल को भरने और खुर्दबीन मंच पर जगह biofilm नमूना के लिए वर्णित है.
- धारा 4 में संकेत के रूप में चुंबकीय चिमटी स्थापित करने के बाद, धारा 5.4 में संकेत के रूप में चुंबकीय बल लागू करते हैं और अंशांकन फ़ाइल प्राप्त करने के लिए केशिका में प्रत्येक कण वेग (वी) और अपनी स्थिति से निकालने के लिए समय चूक चित्र बनाते हैं. इस फाइल स्टोक्स कानून के अनुसार केशिका के विश्लेषण के क्षेत्र में अपनी स्थिति के एक समारोह के रूप में लागू बल शामिल करना चाहिए, एफ = 6πRηv (नि.: कण की त्रिज्या).
7. विश्लेषण
- धारा 5 में संकेत के रूप में प्राप्त कर लिया छवियों के सभी के ढेर के लिए प्रत्येक फ्रेम में कण पदों के साथ पाठ फ़ाइलों को प्राप्त करने के लिए एक "कण ट्रैकर" सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें. Usinजी छवि ढेर अधिग्रहण आवृत्ति, समय के एक समारोह के रूप में कण विस्थापन (जैसे चित्रा 5 और वीडियो 4) की गणना.
- बल अंशांकन फ़ाइल का उपयोग करना, अनुपालन घटता विस्थापन घटता परिवर्तित (- जम्मू (टी) - माल की कुल अनुपालन समय के एक समारोह के रूप में) अनुपालन सूत्र के अनुसार:
जो सामग्री तनाव के बीच संबंध देता है और पहले से Schnurr और सह कार्यकर्ता 19 द्वारा स्थापित के रूप में एक विशाल, सजातीय viscoelastic मध्यम में एम्बेडेड त्रिज्या आर के एक जांच कण के लिए तनाव लागू होता है. - Viscoelastic सामग्री के लिए सामान्य बर्गर मॉडल को रेंगना अनुपालन घटता समायोजित और viscoelastic मापदंडों, जम्मू 0 निकाले जाते हैं, जे 1, η 0, प्रत्येक कण के लिए η 1 (
नोट: यह phenomenological विश्लेषण पहले ऐसे macroscopic rheology डेटा 20-22 व्याख्या करने के लिए biofilms के रूप में जैविक सामग्री सहित सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नियोजित किया गया है.
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Representative Results
एक ठेठ विश्लेषण अपनी मूल व्यवस्था के बिना परेशान रहने वाले एक biofilm पर माइक्रोन पैमाने पर viscoelastic मापदंडों के स्थानिक वितरण प्रदान करेगा. लोचदार अनुपालन - - गहराई के साथ और biofilm के एक पार्श्व आयाम के साथ Y-अक्ष के z-अक्ष के एक समारोह के रूप में दिया जाता विशिष्ट परिणाम जे 0 के मूल्यों जहां 7 चित्र में दिखाया गया. प्रत्येक बिंदु रेंगना वक्र विश्लेषण एक जे 0 मूल्य प्रदान की गई है जो एक मनका से मेल खाती है. डेटा लगभग तीन परिमाण के आदेश है, लेकिन यह भी कहा कि मजबूत पार्श्व विविधता खत्म biofilm की गहराई के साथ विभिन्न स्थानीय अनुपालन सभी biofilm ऊंचाइयों पर जगह ले ली.
आंकड़े यह भी biofilm के यांत्रिक गुणों द्वारा समर्थित थे कि मजबूत संकेत प्रदान करने, यहाँ एक व्यापक और असममित आकार (चित्रा 8) का प्रदर्शन किया जो अनुपालन मूल्यों के वितरण के लिए उपयोग दीअत्यधिक बहुलक जैल पार से जुड़े. दरअसल, अनुरूप व्यवहार पहले केंद्रित और अत्यधिक पार से जुड़े actin जैल 23 पर प्रदर्शन किया गया है.
इसके अलावा, इन तरह के कम प्रवाह की दर के रूप में विभिन्न पर्यावरणीय शर्तों के तहत किया biofilm स्थानीय संपत्तियों की सीटू माप में biofilm आंतरिक संगठन पर इस तरह के एक परिवर्तन के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए सक्षम. 9 चित्र में, 0.1 मिलीग्राम / घंटा से बढ़ी एक biofilm का अनुपालन मान 1 मिलीलीटर / घंटा से बढ़ी biofilm की तुलना में अभी भी एक बेहद विषम मैकेनिकल प्रोफाइल लेकिन गहरी biofilm परत का कोई उच्च कठोरता का प्रदर्शन किया. इन परिणामों biofilm संगठन पर बाह्य परिस्थितियों का महत्वपूर्ण प्रभाव का प्रदर्शन किया.
चित्रा 2. खुर्दबीन मंच और स्थानिक referential की परिभाषा पर केशिका के लिए सम्मान के साथ चुंबकीय चिमटी की स्थिति. शीर्ष देखने केशिका में माप क्षेत्र की स्थिति को दर्शाता है.
समय के 40 सेकंड की अवधि में संकेतों के चित्रा 3. तुल्यकालन.
857/50857fig4.jpg "/>
चित्रा 4. अवलोकन स्केच प्रयोग.
चित्रा 5. कण प्रक्षेपवक्र विश्लेषण से निकालता है. पैनल पर पता चलता है पर कण की स्थिति अभी चुंबकीय शक्ति आवेदन (40 सेकंड की अवधि के समय 23.79 सेकंड) से पहले अपने आरंभिक स्थिति में और सही पर एक ठेठ कण की छवि छोड़ दिया . एक साथ पैनल बी इन आंकड़ों से व्युत्पन्न विस्थापन की अवस्था की साजिश से पता चलता है ImageJ कण पर नजर रखने का उपयोग कर पाया प्रक्षेपवक्र के प्रदर्शन के साथ समय 30 सेकंड; यहाँ हम समय टी के लिए समय में 23.79 सेकंड शुरू करने प्रक्षेपवक्र निकालने दिखाने = 40 सेकंड की अवधि के 31.29 सेकंड.
बर्गर के phenomenological मॉडल के आधार पर 6 चित्रा. Viscoelastic पैरामीटर व्युत्पत्ति. (ए) लोचदार Hookean वसंत (जे 0) और एक मैक्सवेल तत्व (वसंत (के साथ श्रृंखला में न्यूटन dashpot (η 0) के संयोजन में मिलकर यांत्रिक मॉडल बर्गर जम्मू 1) और dashpot (η 1) समानांतर में). (बी) बर्गर समीकरण को समायोजित (हरे रंग में) की अवस्था के साथ एक साथ नीले रंग में प्रयोगात्मक ट्रेस रेंगना.
चित्रा 7. 1 मिलीलीटर के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा उगाया एक biofilm में लोचदार अनुपालन के स्थानिक वितरण / घंटा पोषक तत्वों प्रवाह. प्रत्येक कण द्वारा रिपोर्ट अनुपालन मूल्यों कस्टम रंग नक्शे गर्म करने के लिए एक शांत का उपयोग कर एक (yz) विमान पर एक प्रक्षेपण के रूप में यहां का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. Biofilm के नीचे की परत में स्थित कणों द्वारा रिपोर्ट अनुपालन मानों सब से कम 0.2 मीटर 2 / एन जबकि 1 एम 2 / एन ऊपर ऊपरी 15 μ मीटर परत रिपोर्ट मूल्यों में पाया कणों
चित्रा 8. Biofilm (ए) में और ग्लिसरॉल (बी) में प्राप्त viscoelastic मापदंडों, एक सजातीय चिपचिपा तरल की सामान्यीकृत वितरण. Biofilm सामग्री विविधता का संकेत असममित और व्यापक वितरण (3.6 की विषमता और सामान्यीकृत विचरण 2.4) का प्रदर्शन किया. इसके विपरीत, सममित और एक सजातीय मध्यम निस्र्पक संकीर्ण वितरण ग्लिसरॉल (0.23 और सामान्यीकृत विचरण 0.03 का तिरछापन) में प्राप्त हुई थी.
चित्रा 9. 0.1 मिलीग्राम / घंटा पोषक तत्वों के प्रवाह का एक कम प्रवाह के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा उगाया एक biofilm में लोचदार अनुपालन के स्थानिक वितरण. अनुपालन मूल्यों biofilm गहराई के अनुसार प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. प्रतीक रंग अनुपालन पर्वतमाला दे.
10. चुंबकीय ध्रुव खाका चित्रा. आयाम सेमी में दिए गए हैं.
11. चुंबकीय चिमटी तारों चित्रा. पैनल में आयामों के साथ तरफ देखने - कसकर तांबे के तार की 2120 बदल जाता है हवा और इसके केंद्र में मुलायम चुंबकीय मिश्र धातु ध्रुव डालने से पहले चुंबकीय तार (पैनल बी) के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रत्यक्ष वर्तमान पैनल सी के रूप में दिखाया चुंबकीय ध्रुवता परिभाषित कुंडली में आपूर्ति की है. चित्रा 4 में अवलोकन स्केच प्रयोग भी मिलते हैं.
वीडियो 1: यह फिल्म सिर्फ केशिका में सेल कण मिश्रण के इंजेक्शन के बाद biofilm के प्रारंभिक चरण से पता चलता है. अधिग्रहण आवृत्ति 1 छवि / सेक है और फिल्म 10 फ्रेम / सेकंड में खेला जाता है. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
वीडियो 2: इस मूवी को 4 घंटा वृद्धि के बाद biofilm से पता चलता है. कण उत्तरोत्तर बी में वितरित करने के लिए सतह से अलग कर रहे हैं iofilm मात्रा, नीले तीर टुकड़ी की घटनाओं के निशान. अधिग्रहण आवृत्ति 2 छवि / मिनट है और फिल्म 15 फ्रेम / सेकंड में खेला जाता है. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
वीडियो 3: Biofilm 20 घंटा वृद्धि के बाद. फिल्म केशिका तल पर 20 माइक्रोन स्थित एक मध्यम विमान में ले लिया है. छवियाँ 2 छवियों / मिनट आवृत्ति पर हासिल किया गया है और फिल्म के 15 फ्रेम / सेकंड में खेला जाता है. इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
4 वीडियो: ImageJ का उपयोग विशिष्ट कण ट्रैकिंग. फिल्म समय पर 23 सेकंड शुरू करने और समय पर 30 सेकंड के समाप्त होने के पूरे दृश्य का एक उद्धरण से पता चलता है. पीला प्रक्षेपवक्र चुंबकीय actuation पर कण विस्थापन से पता चलता है. अधिग्रहण आवृत्ति 30 छवियों / सेक है और फिल्म / सेकंड 30 तख्ते पर खेला जाता है.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "लक्ष्य =" _blank "> इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
यह चुंबकीय कण बोने और अपने मूल राज्य में एक से बढ़ biofilm के viscoelastic मापदंडों के सीटू 3 डी मैपिंग में सक्षम प्रयोग खींच रहा है. यह दृष्टिकोण ई. के यांत्रिक विविधता का पता चला कोलाई biofilm यहां उगाई और दृढ़ता से एक मौलिक बाह्य मैट्रिक्स का निहितार्थ और पार से जोड़ने की अधिक ठीक इसके डिग्री, सुझाव biofilm भौतिक गुणों का समर्थन biofilm घटकों बाहर बात करने के लिए सुराग दिया था.
जीवाणु biofilm में यांत्रिक गुणों पैटर्न की मान्यता है कि इन जटिल सामग्री का एक व्यापक प्रतिनिधित्व के निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है. इन निष्कर्षों यांत्रिक पैटर्न और ऐसे biofilm विकास underpinning ड्राइविंग बलों को स्पष्ट करने में मदद करनी चाहिए जो जीन अभिव्यक्ति microniches, के रूप में जैविक विषमताओं को जोड़ने कारण रिश्तों को स्पष्ट करने के लिए रास्ता खुला.
अब तक, biofilm व्यवस्था का प्रश्नnical गुण देखने का एक macroscopic बिंदु से मुख्य रूप से संबोधित किया और अक्सर नुकसान की जानकारी के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम का प्रतिनिधित्व करता है जो अपनी आरंभिक साइट 8,9,12,13, से biofilm scraping द्वारा किया गया था. हमारे noninvasive विधि अपने मूल वातावरण में biofilm 3 डी मैकेनिकल प्रोफाइल की सीटू लक्षण वर्णन में पहले के बारे में लाता है.
दृष्टिकोण अभी तक कोलाइडयन जांच की चुंबकीय दूरदराज के प्रवर्तन की विशेषताओं में रहने वाले एक सीमा है. दरअसल, यह ध्रुव कण दूरी, पोल सामग्री संपत्ति और कुंडल प्रदर्शन द्वारा दिए गए सुलभ बलों की एक आंतरिक सीमा को प्रदर्शित करता है. सेट अप के मौजूदा विन्यास यहां जांच biofilms के लिए पर्याप्त था, जो 200 से पा, अप करने के लिए कठोरता मूल्यों की जांच कर सक्षम होना चाहिए. फिर भी, हमारे सेट अप के आगे इंजीनियरिंग - उदाहरण के लिए, शामिल, विद्युत ठंडा - 2 से 3 का एक पहलू से बल और समय सीमा के स्थानांतरण सक्षम होना चाहिए.
डब्ल्यूई वर्तमान में एक बड़ा समय के पैमाने पर जांच की निष्क्रिय विस्थापन द्वारा रिपोर्ट स्थानीय viscoelastic मापदंडों को जोड़ने संबंध की जांच के लिए एक biofilm में शारीरिक और dynamical गुणों से संबंधित पर काम कर रहे हैं. इसके अलावा, हम अपने यांत्रिक प्रोफाइल पर biofilm के विभिन्न घटकों को लक्षित विभिन्न रसायनों के प्रभाव की खोज कर रहे हैं.
इस नए दृष्टिकोण जीवाणु biofilm आंतरिक यांत्रिकी के विवरण से पता चलता है और वास्तु गुण और विशिष्ट के बीच संबंधों को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण biofilm नियंत्रण प्रयोजनों के लिए देखने के एक इंजीनियर के बिंदु से, लेकिन यह भी एक मौलिक दृष्टिकोण से रहने वाले इन संरचनाओं की एक बेहतर समझ के लिए योगदान इन संरचनाओं के जीव विज्ञान.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम एजेंस Nationale से अनुदान ला Recherche, PIRIbio कार्यक्रम Dynabiofilm और CNRS अंतःविषय जोखिम कार्यक्रम से बहना द्वारा समर्थित भाग में था. हम ई. प्रदान करने के लिए पांडुलिपि और क्रिस्टोफ़ Beloin के बारे में उनकी महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए फिलिप Thomen धन्यवाद इस काम में इस्तेमाल कोलाई तनाव.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
References
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