Summary
Dette dokumentet viser en original metode basert på det fjernaktivering av magnetiske partikler sådd i en bakterie biofilm og utvikling av dedikerte magnetiske pinsett for å måle in situ de lokale mekaniske egenskapene til det komplekse levende materiale bygget av mikroorganismer på grenseflater.
Abstract
Bakteriell adhesjon og vekst av grenseflater føre til dannelse av tredimensjonale heterogene strukturer såkalte biofilm. Cellene bor i disse strukturene er holdt sammen av fysiske interaksjoner mediert av et nettverk av ekstracellulære polymere stoffer. Bakterielle biofilmer påvirke mange menneskelige aktiviteter og forståelsen av deres egenskaper er avgjørende for en bedre kontroll over sin utvikling - vedlikehold eller utrydding - avhengig av deres negative eller gunstig utfall. Dette dokumentet beskriver en ny metode tar sikte på å måle in situ de lokale fysiske egenskapene til biofilm som hadde vært til nå undersøkt bare fra et makroskopisk og homogent materiale perspektiv. Eksperimentet som er beskrevet her involverer innføring av magnetiske partikler i en voksende biofilm til frø lokale sonder som kan fjern aktuerte uten å forstyrre de strukturelle egenskaper av biofilm. Dedikerte magnetiske pinsett var utvikloped å utøve en bestemt kraft på hver partikkel innebygd i biofilmen. Oppsettet er montert på det stadium av et mikroskop for å muliggjøre opptak av time-lapse bilder av partikkel-trekking periode. De partikkel-baner blir så trukket ut fra trekke-sekvensen og de lokale viskoelastiske parametre blir utledet fra hver partikkel fortrengningskurve, for derved å gi den 3D-romlige fordelingen av parametrene. Å få innsikt i biofilm mekanisk profilen er viktig fra en ingeniørs synspunkt for biofilm styring, men også fra et grunnleggende perspektiv for å avklare forholdet mellom de arkitektoniske egenskaper og den spesifikke biologi av disse strukturene.
Introduction
Bakterielle biofilmer er samfunn av bakterier assosiert med biologiske eller kunstige overflater 1-3. De danner med en adhesjons-vekstmekanisme kombinert med produksjon av polysakkarid-rik ekstracellulær matriks som beskytter og stabiliserer byggverk 4,5. Disse biofilm er ikke bare passive sammensetninger av celler stakk til overflater, men organisert og dynamiske komplekse biologiske systemer. Når bakterier bytte fra planktoniske til biofilm livsstil, endringer i genuttrykk og cellefysiologi observert samt økt motstand mot antimikrobielle stoffer og vertens immunforsvar blir på opprinnelsen til mange vedvarende og kroniske infeksjoner seks. Men den kontrollert utvikling av disse levende strukturer tilbyr også muligheter for industri-og miljøapplikasjoner, for eksempel bioremediering av farlig avfall steder, bio-filtrering av industrielle vann eller dannelse av bio-barrierer for å beskytte jord og grunnvann fra contaminasjon.
Mens molekylære funksjoner som er spesifikke for biofilm livsstil blir stadig beskrevet, mekanismer som driver utvikling av lokalsamfunn og utholdenhet fortsatt uklare. Ved hjelp av den siste utviklingen på mikroskala målinger ved hjelp av scanning elektrokjemisk eller fluorescens mikroskopi, har disse levende organisasjoner vist seg å utvise betydelig strukturelle, kjemisk og biologisk heterogenitet 7. Likevel, inntil nå, biofilm mekanikere har i hovedsak vært undersøkt makroskopisk. For eksempel, observasjon av biofilm streamere deformasjon på grunn av variasjoner i fluidstrømningshastigheter 8,9, uniaksial kompresjon av biofilmstykker løftes fra agar medium eller dyrket på dekslet skyves 10,11, skjær av biofilm oppsamlet fra omgivelsene og deretter overført til en parallell plate reometer 12,13, atom kraft spektroskopi ved hjelp av en glassperle og belagt med en bakteriell biofilm festet til en AFM cantilever 14 eller en dedikert microcantilever metode for måling av strekkfasthet av frittliggende biofilm fragmenter 15,16 har blitt gjennomført i løpet av de ti siste årene, noe som gir nyttig informasjon om viskoelastisk natur av materialet 17. Imidlertid virker det sannsynlig at informasjon om in situ biofilm mekaniske egenskaper går tapt når materialet er fjernet fra sitt opprinnelige miljø, som ofte var tilfellet i disse tilnærmingene. Videre behandling av biofilmen som et homogent materiale som bommer på informasjon om den mulige heterogeniteten av de fysikalske egenskaper i samfunnet. Derfor kan de eksakte virkningene av struktur mekanikken i biofilmdannelse og biologiske egenskaper som genuttrykk mønster eller kjemiske gradienter neppe bli gjenkjent. For å gå videre mot en mikro beskrivelse av biofilm fysiske egenskaper, er pålagt nye dedikerte verktøy.
Denne artikkelen detaljer en original tilnærming unnfanget for å oppnåmåling av lokale mekaniske parametre i situ, uten å forstyrre den biofilm og muliggjøre uttak av den romlige fordelingen av mikromaterialegenskapene og deretter den mekaniske heterogenitet. Prinsippet om forsøket hviler på doping av en voksende biofilm med magnetiske mikropartikler etterfulgt av sin fjern lasting ved hjelp av magnetiske pinsett i den modne biofilm. Partikkel forskyvning under kontrollerte magnetisk kraft søknad fotografert under mikroskopet muliggjør lokale viskoelastisk parameter derivasjon, hver partikkel rapporterer sin egen lokale miljø. Fra disse dataene, kan 3D mekanisk profil av biofilm bli trukket, avslører romlige og miljømessige tilstand avhengigheter. Hele forsøket vil bli vist her på en E. coli biofilm laget av en genetisk konstruert stamme som bærer en derepressed F-lignende plasmid. Resultatene er beskrevet i en nyere artikkel 18 gir en unik visjon av det indre av intakte biofilm mekanikk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Bakterier Kultur og fjæring Forberedelse
- Pick et ferskt dyrket koloni fra en Lysogeny Broth (LB) agar plate, inokulere det i 5 ml flytende LB-medium inneholdende 100 μ g / ml ampicillin og 7,5 μ g / ml tetracyklin, og inkubere det i 5 til 6 timer ved 37 ° C på en risting plattform.
- Deretter tilsettes 100 μ l av bakteriekulturen i 5 ml minimal medium (M63B1) supplert med 0,4% glukose og de samme antibiotiske konsentrasjoner. Inkuber denne ferske utvannet kultur over natten ved 37 ° C på en ristende plattform.
- Etter 16 timer med inkubering, tilsettes 100 mL over natten kultur til 5 ml M63B1, 0,4% glukose. Hold røret ved 37 ° C til risteplattform inntil en OD 0,5 er nådd. Suspensjonen er så klar for injeksjon i eksperimentet kanal for biofilmdannelse.
2. Magnetic Particle Forberedelse
- Ta 10 mL magnetiske partikler -2,8 μ m i diameter - fra lager-og vaske dem 3x i 190 mL minimum medium ved hjelp av en magnetisk prøvebeholder.
- Juster partikkelkonsentrasjonen til 5 x 10 6 perler / ml. Typisk 50 pl av den vaskede vulsten oppløsningen blir blandet med en ytterligere 950 μ l av M63B1 med 0,4% glukose.
Tre. Channel Forberedelse og Biofilm Vekst
- Kanal Montering
- Skjær to kvadratiske (800 μ m sidelengde) borsilikatglass kapillærer 10 cm lange for å få to 8 cm lange biter.
- Lim de to kapillar-stykker på to glassplater - halvert først - 2 cm fra hverandre med 1 cm overhenget på hver ende som i figur 1 ved hjelp av en hurtigvirkende cyanoakrylat-lim (såkalte super-lim).
- Autoklav hele oppsettet og nødvendig rør som kreves for ytterligere kanalforbindelse.
- Samle alle de sterile materialer underen laminær hette: i) den montert kanal og felle 1, ii) slangen og koblingene, iii) de to boble feller - boblen filter som vanligvis brukes til å sikre barnas drypp-fôring (felle en) og den hjemmelagde boble felle som en 4 cm langt rør med større diameter (fellen 2), iv) klemmer, v) 30 ml sprøyter som er fylt med M63B1, 0,4% glukose, og vi) avfallsflaske.
- Koble hele oppsettet med Luer Lock connecters eller veikryss i følgende rekkefølge: 50 ml M63B1 sprøyte kontrollert av sprøytepumpen, pediatrisk boble filter, hjemmelaget boble felle, kapillær (Figur 1, panel B), og røret til avfallsflasken. Deretter fyller oppsettet med steril M63B1, 0,4% glukose, slå på sprøytepumpen med en hastighet på ca 10 ml / t, høyere enn de eksperimentelle priser. Nøye oppdage og eliminere alle boblene i kretsen.
- Strømnings mediet gjennom systemet i 10-15 min; samtidig blande 1 ml av bakteriesuspensjonen på OD 0,5 fra Seksjon1,3 med 1 ml av den vaskede vulsten oppløsning fremstilt i avsnitt 2.2.
- Fest (men ikke lukk) klemmer til slangen i to posisjoner: før og etter de kapillærer. Slå strømmen av.
- Introduser bakteriell-perle blandingen i kapillær etter hjemmelaget boble felle ved hjelp av en 1 ml sprøyte, ta vare å holde opp røret slutter å hindre luft oppføring. Re-feste slangen og deretter lukke klemmene.
- Gjenta samme prosedyre for den andre kapillær og alle rør for bobler.
- Overfør anordningen til mikroskopet og la det stå i 15-20 min for å gjøre det mulig for bakteriene å slå seg og fester seg til overflaten av kapillarrøret. Monter kapillær på mikroskopet scenen med avfallsbeholderen på et litt høyere nivå. Plasser sprøytepumpen på benkeplaten ved siden av mikroskopet. Heve boble felle før kapillær litt høyere enn kapillær flyet til fange bobler.
- Biofilm Growth
- Justere strømningshastigheten på sprøytepumpe og begynner strømmen, vil biofilm nå utvikles på kapillær flaten den nødvendige tid - vanligvis 24 eller 48 timer i disse forsøkene.
- Fokus på kapillær bunnen flyet og starte intervallopptak av eksempelbilder - vanligvis et oppkjøp frekvens på to bilder / min vil nok rapportere biofilm vekst. Dette videomonitorer biofilm vekst post-kontroll (se utdrag i Videoer 1, 2 og 3).
4. Magnetiske Pinsett Installasjon
- Skru de magnetiske pinsett på manuelt styrte XYZ micromanipulators og skru micromanipulators på mikroskopet scenen for å justere plasseringen av pinsett relativt til kapillær. Plasser pinsett som i figur 2 for å sikre den riktige magnetfelt gradient er generert i observasjonssonen.
- Koble pinsett to funksjonsgenerator via en effektforsterker for å generere en 40 s periode laget av 24 sek null-signal og 16 sek av 4 En likestrøm med en utløser som sendes til den lyse felt lyset lukker etter 20 sek for signalsynkronisering som gir en sekvens av arrangementer som i figur 3.
Merk: Disse to operasjoner kan oppnås til enhver tid mellom kapillar installasjon og måling begynnelsen. Se eksperimentere oversikt skisse i Figur 4.
5. Creep Curve Acquisition
- Bruk xy bevegelse styring av objektbord for å bringe kanten av den venstre magnetiske pol og den venstre kant av kapillarrøret i samme observasjonsfeltet. Ta opprinnelsen av analysen referanse i skjæringspunktet på x-og y-aksene som er definert av kanten av kapillarrøret og kanten av endestykket, henholdsvis (se figur 2).
- Juster den vertikale posisjonen til kapillær med fint fokus control knott av mikroskopet posisjon. Vanligvis er det første undersøkte planet ligger mellom 4 til 7 μ m over kapillær bunnen. Video 1 svarer til xy-feltet som har sin øvre venstre hjørne i origo for den romlige referanse.
- Utløs 40 sek sekvens av begivenheter som er beskrevet i avsnitt 4.2 og figur 3 ved å koble inn strømgenerator, og på samme tid, manuelt utløse bildeinnlastingen sekvens av video 1..
- Flytt kapillær til naboen høyre felt av en 250 μ m oversettelse av mikroskopet scenen til venstre og opererer som i pkt. 5.3 å generere Video 2 av skive 2 og så videre for å skaffe de nødvendige videoer. Vanligvis 3-4 felt av 250 x 250 μ m 2 er samlet langs x-aksen før endring av flyet og å gjenta samme operasjonene for den nye planet.
6. Force Kalibrering
- Forbered en glyserol løsning ved å blande 39,8 g glyserol med 190 μ l av bi-destillert vann og 10 mL av magnetiske partikler på en 2 x 10 9 partikler / ml og fylle opp en eksperimentell kanal med denne blandingen og legg den på mikroskopet scenen som beskrevet for biofilm prøven.
- Etter å ha installert de magnetiske pinsett som angitt i § 4, gjelder den magnetiske kraften som angitt i punkt 5.4 og få tid-lapse bilder å trekke hver enkelt partikkelhastighet (v) og sin posisjon i kapillær å utlede kalibreringsfilen. Den skal inneholde anvendt kraft som en funksjon av posisjonen i sonen for analyse av kapillarrøret i henhold til Stokes lov F = 6πRηv (R: radius av partikkelen).
7. Analyse
- Bruk en "partikkel tracker" programvare for å få tekstfiler med partikkel stillinger i hver ramme for alle de stabler av bilder ervervet som angitt i § 5. Using bildestabelen anskaffelses frekvens, beregne partikkelforskyvning som funksjon av tiden (for eksempel figur 5 og video 4).
- Ved hjelp av den kraft som kalibrerings fil, konvertere fortrengningskurver til overholdelse kurver (total overholdelse av materialet - J (t) - som en funksjon av tid) i henhold til overholdelse formelen:
som gir forholdet mellom material belastning og anvendt belastning for en sonde partikkel med radius R innleiret i en inkompressibel, homogen viskoelastisk medium som tidligere er etablert av Schnurr og medarbeidere 19. - Juster krype samsvar kurvene til den generelle Burgers modell for viskoelastiske materialer og utlede de viskoelastiske parametre, J 0 J 1, η 0, η 1 for hver partikkel (
Merk: Denne fenomenologiske analysen har vært tidligere ansatt for et bredt spekter av materialer, inkludert biologiske materialer som biofilm å tolke makroskopiske reologi data 20-22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En typisk analyse vil gi den romlige fordelingen av de viskoelastiske parametre på micron skala på en levende biofilm uten å forstyrre den opprinnelige ordningen. Typiske resultater er vist i figur 7, hvor verdiene av J 0 - det elastiske compliance - er gitt som en funksjon av z-aksen langs dybden og på y-aksen langs en lateral dimensjon av biofilm. Hvert punkt tilsvarer en perle som krype kurve analyse har gitt en J 0 verdi. Dataene viste at lokal samsvar varieres langs dybden av biofilmen i løpet nesten tre størrelsesordener, men også at sterke sideveis heterogenitet fant sted ved alle biofilm høyder.
Dataene ga også tilgang til fordelingen av samsvars verdier som utstilt her en utbredt og asymmetrisk form (Figur 8), som gir sterke indikasjoner på at mekaniske egenskapene til biofilm ble støttet avkryssbundet polymer gels. Faktisk har analogt atferd tidligere blitt vist på konsentrerte og kryssforbindelser aktin gels 23.
I tillegg er disse in situ målinger av biofilm lokale egenskaper som utføres under forskjellige miljøbetingelser, for eksempel lavere strømningshastighet gjør det mulig å demonstrere effekten av en slik variant av biofilmen interne organisasjonen. I figur 9, compliance verdiene av en biofilm dyrket ved 0,1 ml / hr oppviste en fortsatt svært heterogen mekanisk profil, men ikke høyere stivhet i dypere biofilmlaget som sammenlignet med biofilm dyrket ved 1 ml / hr. Disse resultatene viste betydelig innvirkning på de ytre forhold på biofilm organisasjonen.
Figur 2. Posisjonering av de magnetiske pinsett med hensyn til den kapillære på objektbordet og avgrensning av den romlige referanse. Topprisset viser posisjonen til måleområdet i kapillarrøret.
Fig. 3. Synkronisering av signalene over 40 sek tidsperiode.
857/50857fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksperimenter oversikt skisse.
Figur 5. Ekstrakt fra partikkel bane analyse. Panel A viser til venstre et bilde av en typisk partikkel i sin utgangsstilling like før magnetisk kraft applikasjon (tid 23,79 sek i 40 sek periode), og på den høyre posisjonen til partikkelen ved 30 sek sammen med visningen av banen funnet ved hjelp ImageJ partikkel tracker Panel B viser handlingen i forskyvning kurve avledet fra disse dataene.; her viser vi en bane ekstrakt starter på tiden 23,79 sek opp til tiden t = 31,29 sek på 40 sek periode.
Figur 6. Viskoelastisk parameter avledning på grunnlag av den fenomenologisk modell av Burger. (A) Burgers mekanisk modell som består i en kombinasjon av elastisk Hookean fjær (J 0) og newtonsk-demper (η 0) i serie med en Maxwell element (spring ( J 1) og demper (η 1) i parallell). (B) Creep eksperimentelle spor i blått sammen med kurven (i grønt) justeres til Burgers ligning.
Figur 7. Romlig fordeling av elastisk compliance i en biofilm dyrket 24 timer ved 37 ° C under 1 ml / time næringsstoffer strømme. Compliance verdier som rapporteres fra hver partikkel er representert her som en projeksjon på en (yz) plan ved hjelp av en kald til varm definerte fargekart. Compliance verdier som rapporteres fra partikler som ligger i det nederste laget av biofilm er alle lavere enn 0,2 m 2 / N mens partikler som finnes i de øvre 15 μ m lag rapport verdier over 1 m 2 / N.
Figur 8. Normalisert fordelinger av de viskoelastiske parametre ble oppnådd i biofilm (A) og i glycerol (B), kan en homogen viskøs væske. Biofilm oppviste asymmetrisk og bred fordeling (skjevhet på 3,6 og normaliserte varians 2,4) som indikerer heterogenitet av materialer. I motsetning til dette var symmetrisk og snever fordeling som karakteriserer et homogent medium erholdt i glycerol (skjevhet på 0,23 og normaliserte varians 0,03).
Fig. 9. Romlig fordeling av elastisk overholdelse i en biofilm dyrket 24 timer ved 37 ° C under en nedre strøm av 0,1 ml / hr næringsstoffer strømning. Overensstemmelse verdier er representert i henhold til biofilm dybde. Symbol farger gir compliance-serier.
Figur 10. Magnetic pole blåkopi. Dimensjoner er gitt i cm.
Figur 11. Magnetiske pinsett ledningsnett. Panel A - brukes til tett avvikle de 2120 omdreininger med kobbertråd og bygge den magnetiske coilen (panel B) før du setter den myke magnetisk legering stang i midten. Likestrøm tilføres i spolen avgrenser magnetisk polaritet som vist i panel C. Se også eksperimentere oversiktsskisse i figur 4..
Video 1: Denne film viser den innledende fasen av biofilm like etter injeksjon av celle-partikkelblandingen i kapillarrøret. Anskaffelses frekvens er en image / sek og filmen er spilt på 10 bilder / sek. Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Video 2: Denne filmen viser biofilm etter fire timers vekst. Partikler blir progressivt fjernes fra overflaten som skal fordeles inn i b iofilm volum, blå piler markere avløsning hendelser. Oppkjøp frekvens er to image / min og filmen spilles med 15 bilder / sek. Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Video 3: Biofilm etter 20 timers vekst. Filmen er tatt i en midtplan ligger 20 mikrometer over kapillær bunnen. Bildene ble kjøpt på to bilder / min frekvens og filmen spilles med 15 bilder / sek. Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Video 4: Typisk partikkel sporing ved hjelp ImageJ. Filmen viser et ekstrakt av hele sekvensen starter på tidspunktet 23 sekunder og slutter ved 30 sek. Gul banen viser partikkel forskyvning på magnetisk påvirkning. Oppkjøp frekvens er 30 bilder / sek og filmen spilles med 30 bilder / sek.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "target =" _blank "> Klikk her for å se denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne magnetiske partikler seeding og trekke eksperiment aktivert i situ 3D kartlegging av de viskoelastiske parametre for en voksende biofilm i sin opprinnelige tilstand. Denne fremgangsmåten viste den mekaniske heterogenitet av E. coli biofilm vokst her og ga ledetråder til å påpeke de biofilm komponenter som støtter de biofilm fysiske egenskaper, sterkt tyder på en grunnleggende implikasjon av den ekstracellulære matrise og mer presist dens grad av kryssbinding.
Erkjennelsen av mekaniske egenskaper mønstre i bakteriell biofilm er avgjørende for å bygge en helhetlig fremstilling av disse komplekse materialer. Disse funnene åpner opp veien for å avklare årsakssammenhenger som knytter mekaniske mønstre og biologiske heterogeniteter eksempel genuttrykk microniches, som skal bidra avklare drivkreftene som ligger til grunn biofilm utvikling.
Inntil nå, spørsmålet om biofilm mechaniske egenskaper hadde vært adressert hovedsakelig fra en makroskopisk synspunkt og ofte ved å skrape biofilm fra sitt opprinnelige område 8,9,12,13, noe som representerer en vesentlig risiko for tap av informasjon. Vår invasiv metode medfører den første in situ karakterisering av biofilm 3D mekanisk profil i sitt opprinnelige miljø.
Tilnærmingen ennå har en begrensning som er bosatt i egenskapene til den magnetiske fjernaktivering av kolloidale prober. Faktisk viser det en iboende utvalg av tilgjengelige krefter gitt av pol-partikkel avstand, pole materialegenskaper og coil ytelse. Den gjeldende konfigurasjon av oppsettet aktivert sondering av stivhet verdier opp til 200 Pa, som var tilstrekkelig for biofilm undersøkt her. Ikke desto mindre ytterligere konstruksjon av vår set-up - som involverer, for eksempel, elektromagnet kjøling - bør muliggjøre forskyvning av kraft-og tidsgrenser med en faktor på 2 til 3.
We jobber for tiden om de fysiske og dynamiske egenskaper i en biofilm etterforsker forholdet knytte lokale viskoelastiske parametere rapportert av den passive forskyvning av sonden på et større tidsskala. I tillegg er vi utforsker virkningen av ulike kjemikalier rettet mot ulike komponenter av biofilm på sin mekaniske profil.
Denne nye tilnærmingen avslører detaljene i biofilm interne mekanikk og bidrar til en bedre forståelse av disse levende strukturer, avgjørende fra en ingeniørs synspunkt for biofilm styring, men også fra et grunnleggende perspektiv for å avklare forholdet mellom de arkitektoniske egenskaper og den spesifikke biologien til disse strukturene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var delvis støttet med tilskudd fra Agence Nationale pour la Recherche, PIRIbio program Dynabiofilm og fra CNRS Tverrfaglig Risk programmet. Vi takker Philippe Thomen for hans kritisk lesing av manuskriptet og Christophe Beloin for å gi E. coli-stamme som brukes i dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1: Reagents and cells | |||
| Magnetic particles | Life technologies | 14307D | Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter |
| Ampicillin (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Tetracycline (Antibiotic) | Sigma-Aldrich | 87128 | |
| Bacterial strain MG1655gfpF | UGB, Institut Pasteur, France | Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline. | |
| Table 2: Capillaries and tubing | |||
| Filters for pediatric perfusion | Prodimed-Plastimed | 6932002 | |
| Hollow Square Capillaries | Composite Metal Scientific | 8280-100 | Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0512 | Diameter 1 mm |
| Tubing silicone peroxyde | VWR international | 228-0700 | Diameter 3 mm |
| Table 3: Biofilm growth | |||
| Lysogeny Broth (LB) solution | Amresco-VWR | J106-10PK | Standard medium used to grow bacteria. |
| M63B1 solution | Home-made | Standard minimum medium used to grow bacteria. | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose. |
| Table 4: Electronics | |||
| Camera EMCCD | Hamamatsu | C9100-02 | |
| Heater controller | World precision instruments | 300354 | |
| Function generator | Agilent technologies | 33210A | |
| Power amplifier | Home-made | It gives a current signal with amplitudes up to 4 A. | |
| Syringe pumps | Kd Scientific | KDS-220 | |
| Shutter | Vincent Associates | Uniblitz T132 | |
| Magnetic tweezers | Home-made | Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11. | |
| Table 5: Optics | |||
| Inverted microscope | Nikon | TE-300 | |
| S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) | Nikon | This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth. | |
| Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20 2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 | Chroma | 1)#49020 2)#31002 | Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block. |
| Table 6: Image analysis | |||
| ImageJ | NIH - particle tracker plugin | ||
References
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
- Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
- Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
- Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
- Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
- Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
- Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
- Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
- Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
- Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
- Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
- Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
- Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
- Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
- Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).
