Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Için Mikrometrik Sondalar uzaktan manyetik uyarılı Published: May 2, 2014 doi: 10.3791/50857

Summary

Bu çalışma, bir ince biyolojik bakteri tabakası ve in situ ara yüzeylerde mikro-organizmalar tarafından yapılmış karmaşık yaşam malzemenin lokal mekanik özelliklerini ölçmek için özel bir manyetik cımbız geliştirilmesi tohumlanmış manyetik parçacıkların uzaktan harekete dayalı orijinal bir yöntem göstermektedir.

Abstract

Arabirimlerde Bakteriyel yapışma ve bir büyüme üç boyutlu heterojen yapılar olarak adlandırılan biyofilm oluşumuna yol açar. Bu yapılar konut hücreler, hücre-dışı polimerik madde bir ağ aracılığı ile fiziksel etkileşimler ile bir arada tutulur. Bakteriyel biyofilm birçok insan faaliyetlerini etkileyecek ve onların özelliklerinin anlaşılması gelişim daha iyi bir kontrol için çok önemlidir - bakım veya eradikasyonu - bunların olumsuz ya da olumlu sonuca bağlı. Bu çalışma, şimdiye kadar, sadece bir makroskopik ve homojen malzeme açısından incelendiğinde, yerinde olmuştu biyofilm lokal fiziksel özellikleri ölçmek için hedefleyen yeni bir yöntem tarif eder. Burada tarif edilen deney, uzaktan biyofilm yapısal özelliklerini bozmadan işletilebilen lokal probları tohum için büyüyen bir biyofilm içine verilmesi manyetik parçacıklar içerir. Adanmış manyetik cımbız deve vardıbiyofilm gömülü her parçacık üzerinde tanımlı bir kuvvet uygulamak için miştir. Kurulum parçacık çekme dönemi time-lapse görüntülerin kaydını etkinleştirmek için bir mikroskop sahnede monte edilir. Parçacık yörüngeleri sonra çekme dizisinden ekstre edilir ve yerel viskoelastik parametreleri ve böylece parametrelerin 3D-uzaysal dağılımının sağlanması için, her parçacık deplasman eğrilerinden elde edilmiştir. Biyofilm mekanik profili içine anlayışlar kazanıyor mimari özellikleri ve bu yapıların belirli biyoloji arasındaki ilişkiyi netleştirmek için biyofilm kontrol amaçlı bakış bir mühendisin açısından değil, aynı zamanda temel bir bakış açısıyla esastır.

Introduction

Bakteriyel biyofilm biyolojik veya yapay zeminlerde 1-3 ile bağlantılı bakteri toplulukları vardır. Bunlar, bu yapı 4,5 korur ve stabilize polisakarit açısından zengin hücre-dışı matrisin üretimi ile bağlanmış bir yapışma büyüme mekanizma ile oluştururlar. Bu biyofilm yüzeylere yapışmış hücrelerin sadece pasif topluluğu değil, ama örgütlü ve dinamik, karmaşık biyolojik sistemleri. Bakteri biyofilm yaşam tarzına planktonik geçtiğinizde, gen ifadesi ve hücre fizyolojisi değişiklikleri antimikrobiklere artan direnci yanı sıra gözlenen ve bir çok kalıcı ve kronik enfeksiyonların 6 kökenli olmanın bağışıklığı ev sahipliği vardır. Ancak, bu canlı yapıların kontrollü gelişimi de bu tür tehlikeli atık sahalarının biyoremediasyonda, endüstriyel su veya Kirlenmiş toprağı ve yeraltı sularını korumak için biyo-engellerin oluşumu biyo-filtre olarak endüstriyel ve çevre uygulamaları için fırsatlar sunuyortirme.

Yaşam biyofilm şekilde spesifik moleküler özellikleri giderek tarif edilirken, toplum kalkınması ve sebat sürüş mekanizmalar belirsizdir. Tarama elektrokimyasal veya floresan mikroskobu kullanarak microscale ölçümlerde son gelişmeleri kullanarak, bu canlı örgütler yapısal, kimyasal ve biyolojik heterojenite 7 önemli sergiledikleri gösterilmiştir. Oysa, şimdiye kadar, biyofilm mekaniği ağırlıklı makroskopik incelenmiştir. Örneğin, biyofilm flamalar gözlenmesi nedeniyle sıvı akış oranlarında 8,9 değişimlere deformasyon, biyofilm adet tek eksenli sıkıştırma agar ortamından kaldırın veya kapak sonra 10,11, çevreden toplanan biyofilm kesme ve bir paralel transfer slaytlar üzerinde büyüdü plaka rheometre 12,13, AFM konsol 14 veya özel bir MICR bağlı bir bakteriyel biyofilm ile cam boncuk ve kaplamalı kullanarak atomik kuvvet spektroskopisimüstakil biyofilm parçalarının 15,16 çekme kuvvetinin ölçülmesi için ocantilever yöntem olup, malzeme 17 viskoelastik doğası hakkında yararlı bilgi veren, son on yıl içinde uygulanmıştır. Ancak, bu madde genellikle bu yaklaşımlarda olduğu ve kendi doğal çevresi, çıkarıldığında in situ biyofilm mekanik özellikleri üzerinde bilgiler kaybolur gibi görünmektedir. Ayrıca, homojen bir malzeme olarak biyofilm tedavi toplum içinde fiziksel özelliklerinin olası heterojenliği hakkında bilgi kaçırır. Bu nedenle, yapı, biyofilm içinde mekanik ve bu gen ifadesi modelleme veya kimyasal gradyanlar gibi biyolojik özelliklerin tesisinin etkileri hemen hemen tanınabilir. Biyofilm fiziksel özelliklerinin bir mikro tanımı doğru ilerlemeye, yeni özel aletler gereklidir.

Bu kağıt elde etmek için tasarlanmış özgün bir yaklaşım detaylarıbiyofilm rahatsız ve mikro malzeme özelliklerinin mekansal dağılımı çizim ve daha sonra mekanik heterojenliğini sağlayan olmadan yerinde yerel mekanik parametrelerin ölçümü. Deneyin ilkesi, olgun biyofilm manyetik cımbız kullanarak uzaktan yükleme ardından manyetik mikro büyüyen bir biyofilm doping üzerinde durmaktadır. Mikroskop altında görüntülenmiş kontrollü manyetik kuvvet uygulaması altında parçacık deplasman yerel viskoelastik parametresi türetme, kendi yerel çevre raporlama her parçacık sağlar. Bu verilerden, biyofilm 3B mekanik profil mekansal ve çevresel durum bağımlılıkları açığa çizilebilir. Bütün deney, E. burada gösterilir Bir zorlandığı F-benzeri plazmid taşıyan bir genetiği suşu tarafından yapılan coli biyofilm. Son kağıt 18'de detaylı sonuçlar bozulmamış biyofilm mekaniğinin iç benzersiz bir vizyon sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Bakteriler Kültür ve Süspansiyon Hazırlanması

  1. , Bir lizojeni Broth (LB) agar plakasından bir taze koloni yetiştirilen Seçim sıvı LB ortamı içerisinde 100 μ g / ml ampisilin ve 7.5 μ g / ml tetrasiklin ihtiva eden 5 ml içinde inoküle ve 37 ° C'de 5-6 saat süreyle inkübe bir çalkalama platformu.
  2. Daha sonra, en az ortam (M63B1)% 0.4 glikoz ve aynı antibiyotik konsantrasyonları ile desteklenmiş 5 ml bakteri kültürü 100 μ ilave edin. Bir çalkalama platformu üzerinde 37 ° C 'de bu yeni seyreltilmiş kültür gece boyunca inkübe edin.
  3. Kuluçkadan 16 saat sonra, 5 ml M63B1,% 0.4 glikoz, gece boyunca kültürün 100 ul ekle. 0.5 OD kadar çalkalama platformunda 37 ° C'de tüp Ol ulaşılır. Süspansiyon, biyofilm formasyonu için deney kanal içine enjeksiyon için hazırdır.

2.. Manyetik Parçacık Hazırlık

  1. 10 ul manyetik parçacıkların alın -2.8 μ m çapında - stoktan ve yıkayınız manyetik örnek rafın yardımı ile 190 ul ortam içinde en az 3 kat.
  2. 5 x 10 6 boncuk / ml parçacık konsantrasyonu ayarlayın. Tipik olarak, yıkanmış boncuk çözeltisi 50 ul% 0.4 glukoz ile M63B1 bir başka 950 μ l ile karıştırılır.

3.. Kanal Hazırlama ve Biyofilm Büyüme

  1. Kanal Montaj
    1. İki 8 cm uzun parçalar elde etmek için 10 cm uzunluğunda iki kare (800 μ m kenar uzunluğu) borosilikat cam kılcal damarları kesilmiş.
    2. Ilk yarıda kesmek - - 2 cm arayla 1 cm çıkıntı ile iki ucunda, Şekil 1 deki gibi (yani süper yapıştırıcı denir) hızlı etkili siyanoakrilat tutkal kullanarak iki cam slaytlar üzerine iki kılcal adet Tutkal.
    3. Tüm kurulum ve daha fazla kanal bağlantısı için gerekli olan boru otoklavlayın.
    4. Tüm steril malzemeler altında toplamakLaminer akış kaputu: i) monte kanal ve tuzak 1, ii) boru ve bağlantıları, iii) iki kabarcık tuzakları - kabarcık filtre yaygın çocuk damla-besleme (tuzak 1) ve ev yapımı kabarcık tuzak güvenliğini sağlamak için kullanılan daha büyük bir çapa sahip olan bir 4 cm uzun bir boru (trap 2) gibi, iv) kelepçeler, v) M63B1,% 0.4 glukoz, ve vi) atık şişe ile doldurulmuş 30 ml şırınga.
    5. Atık şişeye şırınga pompası, çocuk kabarcık filtre, ev yapımı kabarcık tuzak, kılcal (Şekil 1 Panel B) ve tüp ile kontrol edilen 50 ml M63B1 şırınga: aşağıdaki sırayla Luer Lock konnektörleriyle veya birleşme ile bütün kurulum bağlayın. Daha sonra, yaklaşık 10 ml / saat, deney oranları daha yüksek bir oranda bir şırınga pompası açmadan, steril M63B1,% 0.4 glukoz ile birlikte kurulum doldurun. Dikkatle izlemek ve devredeki tüm kabarcıklarını yok.
    6. 10-15 dakika boyunca sistem üzerinden orta akış; eş zamanlı bölüm den 0.5 OD da bakteri süspansiyonu 1 ml karıştırınBölüm 2.2 'de hazırlanan yıkanmış boncuk çözeltisi, 1 ml ile 1.3.
    7. Öncesi ve sonrası kılcal damarlar: takın (ancak kapatmayın) iki pozisyonlarda boru kelepçeleri. Akışını kapatın.
    8. Tüpü tutmak için özen hava girişini önlemek için biter, 1 ml şırınga kullanarak ev yapımı baloncuk kapanı sonra tüpün içine bakteri-boncuk karışımı tanıtmak. Tüp yeniden takın ve ardından kelepçeler kapatın.
    9. İkinci kılcal için aynı işlemleri tekrarlayın ve baloncuklar için tüm tüpleri kontrol edin.
    10. Mikroskop için transfer aparatı ve yerleşmek ve kılcal yüzeyine bağlamak için bakteri sağlamak için, 15-20 dakika boyunca bekletilmesi. Biraz daha yüksek bir düzeyde atık konteyneri mikroskop sahneye kılcal takın. Mikroskop yanında tezgah üstü üzerine şırınga pompası yerleştirin. Kabarcıklar yakalamak için kılcal düzlemine göre biraz daha yüksek bir kılcal önce kabarcık tuzak yükseltin.
  2. Biyofilm Growth
    1. Genellikle 24 veya 48 saat, bu deneylerde - şırınga pompası akış hızını ayarlamak ve akışını başlatmak, biyofilm artık gerekli süre boyunca kılcal yüzeyde geliştirecektir.
    2. Kılcal alt düzlemde odaklanın ve örnek görüntülerin time-lapse kayıt başlamak - 2 görüntülerin genellikle bir toplama frekans / dk yeterli biyofilm büyüme rapor edecektir. Bu video monitörleri biyofilm büyüme sonrası-kontrol (Video 1, 2 özleri görmek ve 3).

4. Manyetik Cımbız Kurulum

  1. Elle kontrol XYZ mikromanipülatörler manyetik cımbız vida ve nispeten kılcal cımbız konumunu ayarlamak için mikroskop sahnede mikromanipülatörler vida. Uygun manyetik alan gradyanı gözlem bölgesinde üretilen sağlamak için, Şekil 2'deki gibi cımbız yerleştirin.
  2. Cımbız t bağlayıno güç amplifikatörü ile fonksiyon jeneratörü 24 saniye sıfır sinyal ve 4, bir dizi sinyal senkronizasyon sağlamak için 20 saniye sonra parlak saha ışık çekim gönderilen bir tetikleyici doğru akım ile 16 saniye yapılmış bir zaman 40 saniye süre üretmek için Şekil 3'te gibi olaylar.
    Not: Bu iki işlem kılcal yükleme ve ölçüm başı arasında her zaman elde edilebilir. Şekil 4'te genel kroki deney bakın.

5.. Sünme Eğrisi Edinme

  1. Sol taraftaki manyetik kutup ve aynı gözlem alanında kılcal sol taraftaki kenar kenarını getirmek için mikroskop kademesinin xy hareket kontrolü kullanın. (Şekil 2), sırasıyla, kılcal kenarı tarafından belirlenen x-ve y-eksenleri kesiştiği ve kutup parçasının kenarında analizi, Referans kökenini al.
  2. Ince odak c kullanarak kılcal dikey konumunu ayarlamakmikroskop pozisyon ontrol topuzu. Genellikle ilk muayene uçak μ 4-7 m arasında kılcal alt üzerinde yer almaktadır. Video 1. mekansal göndergesel kökeni onun sol üst köşesi vardır xy alanına karşılık gelir.
  3. Mevcut jeneratörün üzerinde ve aynı zamanda geçiş yaparak Bölüm 4.2 ve Şekil 3'te anlatılan olayların 40 sn dizisini tetikleyecek, elle video 1 görüntü toplama dizisini tetikleyebilir.
  4. Gerekli videoları elde etmek böylece sola mikroskop aşamasında bir 250 μ m çeviri tarafından komşu hakkı alana kılcal hareket ve dilim 2 video 2 oluşturmak için bölüm 5.3 olarak çalışan ve. 250 x 250 μ m 2 Tipik haliyle 3-4 alanları uçak değiştirilmesi ve yeni bir uçak için aynı işlemleri tekrar önce, x-ekseni boyunca toplanır.

6.. Kuvvet Kalibrasyon

  1. Bi-damıtılmış su 190 μ l ve 2 x 10 9 parçacıklar / ml 'de manyetik parçacıklar 10 ul gliserol 39.8 g karıştırarak bir gliserol çözeltisini hazırlayın ve bu karışım ile deneysel kanalı doldurmak ve mikroskop sahne üzerine yerleştirin biyofilm örnek için tarif edildiği gibi.
  2. 4. bölümde belirtildiği gibi manyetik cımbız kurduktan sonra, bölüm 5.4 'de belirtildiği gibi manyetik kuvvet uygulamak ve kalibrasyon dosyasını elde etmek için kılcal her bir parçacık hızı (v) ve konumunu ayıklamak için zaman atlamalı görüntüler olun. Bu dosya stokes hukukuna göre kılcal analiz bölgesinde konumunun bir fonksiyonu olarak uygulanan kuvveti içermelidir, F = 6πRηv (R: partikülün çapı).

7. Analizi

  1. 5. bölümünde belirtildiği gibi kazanılmış görüntülerin tüm yığınları için her karede parçacık konumları ile metin dosyalarını almak için bir "parçacık izci" yazılımını kullanın. Istimalg görüntü yığını elde etme sıklığı, zamanın bir fonksiyonu olarak parçacık yer değiştirme (örneğin, Şekil 5 ve Video 4) hesaplar.
  2. Kuvvet kalibrasyon dosyasını kullanarak, uyum eğrilerine yer değiştirme eğrileri dönüştürmek (- J (t) - malzemenin toplam uyum zamanın bir fonksiyonu olarak) uyum formüle göre:

    bu malzemenin gerilme arasındaki ilişkiyi verir ve daha önce Schnurr ve iş 19 tarafından tespit edilen bir sıkıştırılamaz, homojen bir viskoelastik bir ortam içinde gömülü yarıçapı R bir sonda parçacık için stres uygulanan.
  3. Viskoelastik malzemeler için genel Burgers modeline uyum sürünme eğrileri ayarlayın ve viskoelastik parametreler, J 0 türetmek, J 1, η 0, her parçacık için η 1 (
    Not: Bu olgusal analizi daha önce böyle makroskobik rheolojisi Verilere 20-22 yorumlamak biyofilmlerin gibi biyolojik malzemeler dahil geniş bir malzeme yelpazesi için istihdam edilmiştir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tipik bir analiz orijinal düzeni bozmadan canlı bir biyofilm üzerinde mikron ölçeğinde viskoelastik parametrelerin dağılımını sağlar. Elastik uyumluluk - - derinliği boyunca ve biyofilm bir yan boyut boyunca y-ekseninin z-ekseninin bir fonksiyonu olarak verilir Tipik sonuçlar J 0 değerleri Şekil 7 'de gösterilmiştir. Her nokta sürünme eğrisi analizi J 0 değer sağlamıştır bir boncuk karşılık gelir. Veri neredeyse üç büyüklükte emir ama aynı zamanda güçlü yanal heterojenliği üzerinde biyofilm derinliği boyunca değişen yerel uyumluluk tüm biyofilm yüksekliklerinde yer aldığını ortaya koydu.

Veriler de biyofilm mekanik özellikleri tarafından desteklenen olduğunu güçlü endikasyonlar sağlayarak, burada yaygın ve asimetrik şekil (Şekil 8) sergilenen uyum değerlerinin dağılımına erişim verdiyüksek polimer jelleri çapraz bağlanmış olabilir. Gerçekten de, daha önce benzer davranış, konsantre edildi ve yüksek derecede çapraz bağlanmış jeller aktin 23 üzerinde gösterilmiştir.

Buna ek olarak, bu tür düşük akış hızı gibi farklı çevre koşulları altında, biyofilm yerel özelliklerinin in situ ölçümlerinde biyofilm organizasyonuna göre, böyle bir varyasyon etkisini göstermek için olanak sağlar. Şekil 9'da, 0.1 ml / st 'de yetiştirilen bir biyofilm uyum değerleri, 1 ml / st' de yetiştirilen biyofilm ile karşılaştırıldığında yine de yüksek ölçüde heterojen bir mekanik profil ancak derin biyofilm tabakasının yüksek seviyede sertlik sergiledi. Bu sonuçlar biyofilm organizasyon dış koşulların önemli bir etki göstermiştir.

Şekil 1
Rong> Şekil 1. Kılcal kroki montaj.

Şekil 2,
Şekil 2,. Mikroskop kademesi ve mekansal göndergesel tanımı ile ilgili kılcal ile ilgili olarak, manyetik cımbız Konumlandırma. Üstten görünüşüdür kılcal ölçüm bölgesinin konumunu gösterir.

Şekil 3,
Zaman 40 saniye süre boyunca sinyallerin Şekil 3.. Senkronizasyon.

857/50857fig4.jpg "/>
Şekil 4. Bakış kroki Deney.

Şekil 5,
Şekil 5. Parçacık yörünge analizi ayıklar. Panel A şovları da parçacığın pozisyonuna sadece manyetik kuvvet uygulaması (40 sn dönemin süresi 23.79 sn) önce, başlangıç ​​konumunda ve sağda tipik bir parçacığın imajını sol . birlikte Panel B, bu verilerden elde edilen yer değiştirme eğrisinin grafiğini göstermektedir ImageJ parçacık izci kullanarak bulunan yörünge ekran süresi 30 saniye; burada zaman t anda 23.79 sn kadar başlayan bir yörünge özü göstermek = 40 sn sürenin 31.29 sn.

Şekil 6, Burger fenomenolojik model bazında Şekil 6. Viskoelastik parametresi türetme. (A) elastik Hookyen ilkbahar (J 0) ve Maxwell elemanı (yay ile (seri Newton amortisör (η 0) bir arada oluşan mekanik modeli BURGERS J 1) ve amortisör (η 1) paralel olarak). (B) Burgers denkleme ayarlandı (yeşil) eğrisi ile birlikte, mavi deneysel iz Kayma.

Şekil 7
Şekil 7. 1 ml altında 37 ° C'de 24 saat yetiştirilen bir biyofilm elastik uyum Mekansal dağıtım / saat besin akar. Her bir parçacık tarafından bildirilen değerler Uyum özel renk haritası ısınmak için serin kullanarak (yz) düzlemi üzerindeki bir izdüşümü olarak burada temsil edilmektedir. Biyofilm alt katmanda bulunan parçacıklar tarafından bildirilen uyum değerleri tüm daha düşük olan 0.2 m 2 / N ise 1 m 2 / N üzerindeki üst tabaka 15 μ m rapor değerleri bulunan parçacıklar

Şekil 8,
Şekil 8,. Biyofilm (A) ve gliserol (B) 'de elde edilen viskoelastik parametreler, homojen yapışkan bir sıvı normalize edilmiş dağılımları. Biyofilm malzeme heterojen gösteren asimetrik ve geniş dağılımına (3.6 çarpıklık ve normalize varyans 2.4) sergiledi. Buna karşılık, simetrik ve homojen bir orta karakterize dar dağıtım gliserol (0.23 ve normalize varyans 0.03 çarpıklık) elde edildi.

ontent "fo: keep-together.within-page =" always "> Şekil 9,
Şekil 9,. 0.1 ml / saat besin akışın bir alt akışı altında 37 ° C'de 24 saat yetişen bir biyofilm elastik uyum uzaysal dağılımı. Uyum değerleri biyofilm derinliğine göre temsil edilmektedir. Sembol renkler uyum aralıkları vermek.

Şekil 10,
10. Manyetik kutup planı Şekil. Boyutlar cm olarak verilmiştir.

Şekil 11
11. Manyetik cımbız kablo rakam. Panel A boyutlara sahip yan görünüm - sıkıca bakır tel 2,120 döner rüzgar ve merkezinde yumuşak manyetik alaşım kutup takmadan önce manyetik bobin (panel B) oluşturmak için kullanılır. Doğru akım Panel C'de gösterildiği gibi manyetik kutupları oluşturan bobin beslenir. Şekil 4'te genel taslağını deney Ayrıca bkz.

Video 1: Bu film sadece kılcal hücre parçacık karışımının enjeksiyonundan sonra biyofilm ilk safhasını göstermektedir. Toplama frekansı 1 görüntü / sn ve film 10 kare / sn oynanır. Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.

Video 2: Bu film 4 saat büyütmeden sonra biyofilm gösterir. Parçacıklar kademeli b içine dağıtılacak yüzeyden ayrılır iofilm hacmi, mavi oklar dekolmanı olayları işaretlemek. Toplama frekansı 2 görüntü / dk ve film 15 kare / sn oynanır. Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.

Video 3: Biyofilm 20 saat büyümeden sonra. Film kılcal tabanına 20 um bulunan bir orta düzlemde alınır. Görüntüler 2 images / dak frekansta elde edildi ve film 15 kare / sn oynanır. Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.

Video 4: ImageJ kullanarak Tipik partikül izleme. Film 23 saniye zaman başlayıp anda 30 saniye sona bütün dizinin bir özeti göstermektedir. Sarı yörünge manyetik harekete geçirilmesi üzerine parçacık değiştirmesini göstermektedir. Toplama frekansı 30 görüntü / saniye ve film / sn 30 kare oynanır.https://www.jove.com/files/ftp_upload/50857/JoVE_Video4.avi "target =" _blank "> Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu manyetik parçacık tohumlama ve özgün durumuna büyüyen bir biyofilm viskoelastik parametrelerinin yerinde 3D ​​haritalama etkin deney çekerek. Bu yaklaşım E. mekanik heterojenitesini ortaya coli biyofilm burada büyüyen ve güçlü bir temel hücre dışı matrisin anlamı ve çapraz bağlama derecesini daha doğrusu düşündüren, biyofilm fiziksel özellikleri destekleyen biyofilm bileşenleri işaret ipuçları verdi.

Biyolojik bakteri tabakası mekanik özellikler desen tanınması bu kompleks maddelerin kapsamlı bir temsilini oluşturmak için çok önemlidir. Bu bulgular mekanik kalıplarını ve biyofilm gelişimini destekleyen itici güçleri netleştirilmesi yardımcı olmalıdır gen ekspresyon microniches, biyolojik heterojenliklerin bağlayan nedensel ilişkileri netleştirmek için yolu açmak.

Şimdiye kadar, biyofilm mecha sorunical özellikleri görünümünde bir makroskopik açıdan esas olarak ele ve sık sık bilgi kaybı önemli bir risk temsil başlangıç ​​sitesinden 8,9,12,13, biyofilm kazıma tarafından olmuştu. Bizim invazif olmayan bir yöntem orijinal ortamında biyofilm 3B mekanik profili in situ karakterizasyonunda ilk beraberinde getirmektedir.

Yaklaşım henüz kolloidal sondaları manyetik Uzaktan çalıştırma özelliklerine yaşayan bir sınırlama vardır. Gerçekten de, bu kutup parçacık mesafe, kutup malzeme özellikleri ve performansı bobin tarafından verilen erişilebilir kuvvetlerin içsel bir aralık görüntüler. Set-up Geçerli konfigürasyon burada incelenen biyofilmlerin için yeterli 200 Pa, kadar katılık değerleri sondalama sağladı. Yine de, bizim set-up daha fazla mühendislik - örneğin içeren, electromagnet soğutma - 2 ila 3 kat kuvvet ve zaman sınırları kaydırılmasının sağlanması gerekir.

We şu anda daha geniş bir zaman ölçeğinde probun pasif değiştirmesi ile bildirilen lokal viskoelastik parametreler bağlayan ilişkiyi araştıran bir biyofilm fiziksel ve dinamik özellikleri ile ilgili üzerinde çalışıyoruz. Buna ek olarak, mekanik profilinde biyofilm farklı bileşenleri hedefleyen çeşitli kimyasalların etkisini araştırmaktadır.

Bu yeni yaklaşım, bakteriyel biyofilm iç mekaniğinin ayrıntıları ortaya çıkarır ve mimari özellikleri ve özel arasındaki ilişkiyi netleştirmek için çok önemli biyofilm kontrol amaçlı bakış bir mühendisin açısından değil, aynı zamanda temel bir bakış açısıyla bu canlı yapıların, daha iyi anlaşılmasına katkıda Bu yapıların biyolojisi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Agence Nationale hibe la Recherche, PIRIbio programı Dynabiofilm ve CNRS Disiplinlerarası Risk programdan dökmek tarafından desteklenen bir parçası oldu. Biz E. sağlamak için yazının ve Christophe Beloin onun eleştirel okuma Philippe Thomen teşekkür Bu çalışmada kullanılan coli suşu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1: Reagents and cells
Magnetic particles Life technologies 14307D Micrometric magnetic particle, 2.8 µm diameter
Ampicillin (Antibiotic) Sigma-Aldrich A9518
Tetracycline (Antibiotic) Sigma-Aldrich 87128
Bacterial strain MG1655gfpF UGB, Institut Pasteur, France Produces F pili at its surface, resistant to Ampicilllin and tetracycline.
Table 2: Capillaries and tubing
Filters for pediatric perfusion Prodimed-Plastimed 6932002
Hollow Square Capillaries Composite Metal Scientific 8280-100 Manufactured in Borosilicate glass. Square 0.8 mm x 0.8 mm
Tubing silicone peroxyde VWR international 228-0512 Diameter 1 mm
Tubing silicone peroxyde VWR international 228-0700 Diameter 3 mm
Table 3: Biofilm growth
Lysogeny Broth (LB) solution Amresco-VWR J106-10PK Standard medium used to grow bacteria.
M63B1 solution Home-made Standard minimum medium used to grow bacteria.
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Used to make M63B1 medium with 0.4% glucose.
Table 4: Electronics
Camera EMCCD   Hamamatsu C9100-02
Heater controller World precision instruments 300354
Function generator Agilent technologies 33210A
Power amplifier Home-made It gives a current signal with amplitudes up to 4 A.
Syringe pumps Kd Scientific KDS-220
Shutter Vincent Associates Uniblitz T132
Magnetic tweezers Home-made Two electromagnetic poles, each made of a copper coil with 2,120 turns of 0.56 mm in diameter copper wire and soft magnetic alloy cores (Supra50-Arcelor Mittal, France) square shaped according to the blueprint shown in Figure 10. The two cores are mounted north pole facing south pole, in order to generate a magnetic force in one direction along the length of the capillary. See coil wiring details in Figure 11.
Table 5: Optics
Inverted microscope  Nikon TE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3) Nikon This a long working distance objective enabling observation of the biofilm in the depth.
Epifluorescence filters: 1) for green fluorescence: Exc 480/20 nm; DM 495; Em 510/20  2) for Red fluorescence: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55 Chroma 1)#49020 2)#31002 Particle displacement upon force application is recorded using the red fluoresecnce filter block.
Table 6: Image analysis
ImageJ NIH - particle tracker plugin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
  2. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg Infect Dis. 8, 881-890 (2002).
  3. Costerton, J. W., Stewart, P. S. Battling biofilms. Scientific American. 285, 74-81 (2001).
  4. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  5. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
  6. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
  7. Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6, 199-210 (2008).
  8. Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: an in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnology and bioengineering. 65, 83-92 (1999).
  9. Klapper, I., Rupp, C. J., Cargo, R., Purvedorj, B., Stoodley, P. Viscoelastic fluid description of bacterial biofilm material properties. Biotechnol Bioeng. 80, 289-296 (2002).
  10. Korstgens, V., Flemming, H. C., Wingender, J., Borchard, W. Uniaxial compression measurement device for investigation of the mechanical stability of biofilms. Journal of microbiological. 46, 9-17 (2001).
  11. Cense, A. W., et al. Mechanical properties and failure of Streptococcus mutans biofilms, studied using a microindentation device. Journal of microbiological methods. 67, 463-472 (2006).
  12. Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
  13. Towler, B. W., Rupp, C. J., Cunningham, A. B., Stoodley, P. Viscoelastic properties of a mixed culture biofilm from rheometer creep analysis. Biofouling. 19, 279-285 (2003).
  14. Lau, P. C., Dutcher, J. R., Beveridge, T. J., Lam, J. S. Absolute quantitation of bacterial biofilm adhesion and viscoelasticity by microbead force spectroscopy. Biophysical journal. 96, 2935-2948 (2009).
  15. Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Micro-cantilever method for measuring the tensile strength of biofilms and microbial flocs. Journal of microbiological methods. 55, 607-615 (2003).
  16. Aggarwal, S., Poppele, E. H., Hozalski, R. M. Development and testing of a novel microcantilever technique for measuring the cohesive strength of intact biofilms. Biotechnology and bioengineering. 105, 924-934 (2010).
  17. Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
  18. Galy, O., et al. Mapping of Bacterial Biofilm Local Mechanics by Magnetic Microparticle Actuation. Biophysical journal. 103, 1-9 (2012).
  19. Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
  20. Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
  21. Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
  22. Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
  23. Apgar, J., et al. Multiple-particle tracking measurements of heterogeneities in solutions of actin filaments and actin bundles. Biophysical journal. 79, 1095-1106 (2000).

Tags

Biyomühendislik Sayı 87 Bakteriyel biyofilm manyetik cımbız visko-elastik parametreleri mekansal dağılımı akış hücresi hücre dışı matriks
Için Mikrometrik Sondalar uzaktan manyetik uyarılı<em&gt; In situ</emBakteriyel biyofilm Fiziksel Özelliklerinin&gt; 3D Mapping
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Galy, O., Zrelli, K.,More

Galy, O., Zrelli, K., Latour-Lambert, P., Kirwan, L., Henry, N. Remote Magnetic Actuation of Micrometric Probes for in situ 3D Mapping of Bacterial Biofilm Physical Properties. J. Vis. Exp. (87), e50857, doi:10.3791/50857 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter