Summary
성인 세 마우스의 단일 뉴런의 활동은 특정 뇌 영역에서 신경 세포를 해리와 형광 막 잠재적 인 염료 이미징을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 포도당의 변화에 시험 응답으로,이 기술은 성인 ventromedial 시상 하부 뉴런의 포도당 민감성을 연구하는데 사용될 수있다.
Abstract
신경 세포의 활동에 대한 연구는 종종 증가로 인해 결합 조직과 관련된 기술적 인 문제에 설치류 생후 2 달 이상에서 신경 세포를 사용하여 수행하고 나이가 발생하는 신경 세포의 생존 능력을 감소합니다. 여기, 우리는 성인 세 마우스의 건강한 시상 하부 신경 세포의 분리를위한 방법을 설명합니다. 성인 나이 든 쥐에서 신경 세포를 연구 할 수있는 능력은 나중에 나이에 명시 특정 연구에 대한 더 많은 발달 정확한 수 있습니다 질병 모델의 사용을 할 수 있습니다. 단일 신경 세포를 연구하는 전기 생리학을 사용하는 것이 아니라 해리 뉴런의 형광 이미징은 뉴런 집단의 활성을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 원하는 신경 세포의 종류는 시상 하부의 포도당 감지 신경 세포에 대한 희귀되는 이기종의 연결 인구를 공부 할 때 특히 유용합니다. 우리는 차에 자신의 반응을 연구하는 성인 ventromedial 시상 하부의 신경 세포의 막 잠재적 인 염료 영상을 활용세포 포도당 nges. 포도당 감지 뉴런 에너지 균형의 조절에 중심적인 역할을하는 것으로 생각된다. 성인 설치류에서 포도당 감지 기능을 연구 할 수있는 능력은 장애 에너지 균형 (예. 비만) 연령 증가와 관련된 질병의 우세 이후에 특히 유용합니다.
Introduction
뇌는 신경 내분비 및 자율 신경 시스템을 통해 에너지 항상성을 조절한다. ventromedial 시상 하부 (VMH)에 ventromedial 핵 (VMN) 및 아치형 핵 (ARC)으로 구성된 에너지 항상성의 중추 조절에 중요하다. 전문 포도당 감지 뉴런은 VMH 내에서 신경 세포의 활동과 주변 포도당 항상성 1을 연결합니다. 포도당 여기 (GE) 포도당 (GI) 신경 세포의 포도당이 증가함에 따라 자신의 활동을 감소 억제하면서 신경 세포가 증가, 신경 세포를 감지하는 포도당의 두 가지 유형이 있습니다. VMH 포도당 감지 신경 세포는 일반적으로 전기 생리학 또는 칼슘 / 막 잠재력에 민감한 염료의 이미지를 사용하여 연구한다.
전기 생리학 패치 클램프 기술은 생체 신경 세포 활동의 연구에서 황금 표준으로 간주됩니다. 이 기술에서는, 유리 마이크로 피펫 전극은 높은 저항을 통해 세포막에 부착(GΩ) 인감. 패치 클램프 전극은 활동 전위의 주파수 (전류 클램프) 또는 이온 전도도 (전압 클램프)의 실시간 기록은 단일 신경 세포 내에서 변경 가능. 패치 클램프 기술은 특정 이온 채널 컨덕턴스의 변화에 관한 상세 정보를 제공하는 반면, 주요 단점은 하나의 신경 세포가 동시에 관찰 할 수 있다는 것이다. 심지어 특정 실험 치료를 시작하기 전에 포도당 감지 신경 세포에서 하나가 기록되어 있는지 확인하기 위해 기록의 약 30 ~ 45 분입니다. 또한, GI와 GE 뉴런은 <총 VMH의 신경 인구의 20 %를 포함한다. 이 문제를 복잡하게하는 것은 이들 뉴런 세포 마커의 식별 많은 경우에 부족이다. 따라서, 클리어 다른 기법, 패치 클램프 분석 힘드는 수 없다는 귀중한 전기 정보, 시간 소모 및 낮은 수율을 제공에도 불구.
해리 VMH 뉴런의 형광 이미징의 사용은 HU의 연구를 허용동시에 신경 세포의 ndreds. 칼슘 민감 염료 간접적 신경 활성의 변화와 상관이 세포 내 칼슘의 변화를 측정 할 수있다. 막 잠재력에 민감한 염료 막 잠재적 인 변경 사항을 모니터링하는 데 사용됩니다. 세포막 전위 측정은 세포 내 칼슘 수준의 변화에 비해 신경 활성의 직접적인 지표이다. 또한, 막 잠재적 인 염료 (MPD) 영상은 잠재적으로 활동 전위 발사가 변경되지 않고 세포 내 칼슘 수준이 변경되지 않을 수 있습니다 막 전위에서 작은 변화를 감지합니다. 이러한 형광 이미징 기술은 모두 청소년 마우스 2-7에서 VMH 포도당 감지 신경 세포를 연구하는 데 사용되었습니다. 결과 패치 클램프 전기 생리학에 의한 것 이상 상세한 있지만, 영상 실험의 강도는 동시에 필연적으로 포도당 감지 신경 세포의 상당수를 포함 세포의 많은 인구를 평가하는 것입니다. MPD 이미징 I더 전체에 균일 VMH에 걸쳐 현지화 GI 신경을 공부에 특히 유용들, 따라서 해리 VMH (~ 15 % GI)에서 공부하는 적절한 인구를 제공한다. GE의 신경 세포가 밀집 ventrolateral-VMN와 ARC와 VMN 사이에 셀별로 지역 언어로 번역하면서 반면에, 그들은 VMH 내에서 신경 세포의 상당수 (<1 % GE)을 대표하지 않습니다. 또한, 고립 된 신경 세포를 연구함으로써, 성상 세포와 시냅스 효과가 제거됩니다. 연결 및 생리적 과정이 손실되기 때문에 이것은 일차 신경 효과를 연구하는 장점뿐만 아니라 단점이 될 수있다.
패치 클램프 전기 생리학 및 MPD / 칼슘 염료 영상 모두에서 제한 요인은 젊은 동물 (예. 마우스 또는 쥐 <8 주령)를 사용할 필요가있다. 이는 나이가 발생 감소 신경 세포의 생존 능력과 함께 증가 된 결합 조직에 주로있다. 뇌 슬라이스 전기 생리학 스터드이거, 증가 된 결합 조직은 더 어려워 신경을 시각화 할 수 있습니다. 증가 된 결합 조직은 어렵게 이미징 연구를위한 건강한 뉴런의 큰 숫자를 해리 할 수 있습니다. 또한, 젊은 동물의 뉴런은 패치 클램프 녹음 또는 영상 중 하나를하는 동안 더 이상 생존. 그러나, 어린 마우스의 사용이 중요한 제한 될 수있다. 신경 세포의 활동 및 / 또는 신경 전달 물질 또는 순환 영양소에 대한 응답은 연령에 따라 변경합니다. 에너지 균형 밀접 생식 상태에 연결되어 있기 때문에 예를 들어, 에너지 균형을 조절하는 시상 하부 뉴런 postpubescent 동물 사전 VS에 다르게 응답 할 수있다. 또한, 많은 질병은 장기 치료를 필요로하거나 성인이 될 때까지 명시하지 않습니다. 이러한 질병의 국무 예는식이 비만이나 2 형 당뇨병이다. 포도당 감지 신경 세포는이 질병에있는 역할을 할 것으로 생각하고 있기 때문에 우리는 성공적으로 MPD 이미징 특급에 사용하기 위해 건강한 성인 VMH의 신경 세포를 배양하기위한 방법론을 개발eriments.
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Protocol
1. 동물
- 모든 절차는 뉴저지의 기관 동물 관리 및 사용 의과 대학위원회와 치과에 의해 승인되었다.
- 그룹 하우스 남성 C57BL / 6 12 시간 light/12 인사 어두운 일정에 마우스 및 물과 음식에 대한 광고를 무제한으로 액세스 할 수 있습니다. 4-5개월 이전에 희생. 마우스의 안락사는 마취의 수술 비행기와 안락사의 보조 형태 (즉, 조리개를 통해 흉강에 절개를 관통)를 사용하여 수행 하였다. 이 안락사에 AVMA 가이드 라인과 일치한다.
2. 관류 솔루션, Coverslips는, 유리 피펫 및 미디어의 준비
- 2.5 밀리미터의 KCl, 12 mM의 MgCl2를 1.25 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 28 mM의 탄산 수소 나트륨, 0.5 mM의 염화칼슘으로 구성된 1L 관류 액을, 12 mM의 포도당, 1 mM의 아스 코르 빈산, 증류 dH보다 2 O 3 mM의 피루 베이트 에 ~ (30) 삼투압 조절약 80 g / L의 크로스를 사용하여 0 mOsm. 95 %, O2 / 5 % CO 2와 버블 링과 7.4로 pH를 조절하여 산소로. 각 실험은 관류 액의 약 200 ㎖가 필요합니다. 분취 량은 최대 2 개월 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 포도당, 2.5 mM의 포도당, 100 U / ㎖ 페니실린 스트렙토 마이신없이 Neurobasal 매체를 포함하는 250 ㎖의 Neurobasal 재고를 확인합니다. 자당을 사용하여 280 mOsm로 Neurobasal 주식의 삼투압을 조절합니다. 500 ml의 포도당, 2.5 mM의 포도당, 100 U / ㎖ 페니실린 스트렙토 마이신없이 최대 절전 모드-A 매체가있는 주식을 최대 절전합니다.
- Stericup 진공 필터 유닛을 사용하여 잘 주식과 필터 소독 모두를 저어. 유리 또는 교반 막대를 통해 포도당이나 기타 오염 물질을 소개하지 않도록주의하십시오. 빛으로부터 미디어를 보호하고 최대 2 개월 동안 4 ° C에 저장할 수 박의 병을 감싸십시오.
- 팁이 더 싸다 없도록 4 멸균 유리 피펫 (9)의 팁을 불꽃NGER 날카로운 개구부 직경이 크고 (~ 0.9 mm), 중대형 (~ 0.7 mm), 중간 (~ 0.5 mm), 소규모 (~ 0.3 mm). 가장 큰 거의 연마해야하며, 최소는 직경의 제에 대한 있어야합니다.
- 수확 신경, 70 % 에탄올을 사용하고 분젠 버너의 불꽃을 통해 전달 깨끗한 네 25mm 유리 coverslips는 전날에. 멸균 35mm 배양 접시에 각각의 커버 슬립을 놓고 2 ㎖ dH보다 2 O.에서 멸균 1 % 폴리-D-라이신을 추가 하룻밤 인큐베이터 (37 ℃)에서 요리를 넣어. 다음 날, 멸균 dH보다 2 O 3 배, 세척 커버 슬립이 완전히 건조 수 있습니다.
- 1 M 유산균과 루타 200 ㎕의 분취 액 75 μL 씩 분주을, -20 ℃에서 보관 어느 정도의 균일 성을 보장하기 위해 사용하기 전에 젖산 루타의 분취 량을 해동.
- 수확 뉴런의 날, 인슐린없이 1mM의 젖산, 0.5 루타, 2 %의 B27를 포함하는 최대 절전 모드 - 주식으로 구성된 신선한 배양액 30 ㎖로 만든다. 할머니rtex 1 N 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다.
- 얼음에 60mm 유리 배양 접시에서 배양 배지 10 ㎖를 넣고, 얼음에 15 ML 원뿔 튜브에 2 ㎖를 넣고 실온에서 남아있는 용지를 보관하십시오.
- 수확 뉴런의 날, 1 ㎜ 젖산, 0.5 ㎜ 루타, 인슐린없이 2 % B27를 포함 Neurobasal 주식으로 구성된 신선한 성장 매체의 25 ㎖로 만든다. 소용돌이와 1 N 수산화 나트륨을 사용하여 pH를 7.4로 조정한다. 신선한 성장 매체가 적어도 30 분 동안 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2)의 평형을 허용합니다.
3. 심장 관류
- 완전 95 % O 2 / 5 더 적어도 15 분 동안 얼음 %의 CO 2와 함께 200 ㎖의 관류 액과 산소로 해동.
- 아세톤, 70 % 에탄올, 및 dH보다 2 O와 vibratome 블레이드를 세척 vibratome에서 블레이드를 배치합니다.
- dH보다 2 O와 vibratome 냉각 실 및 관류 튜브를 씻어 냉각 실 채우기 (4 ° C) 관류 솔루션과 산소를 계속합니다.
- 펜토 바르 비탈 나트륨 50 밀리그램 마우스를 마취 / ㎖, 멸균 물과 1:1로 희석, 복강 내 주입했다. 확인 마우스가 완전히 꼬리를 곤란하게하고 응답을 관찰하지에 의해 마취.
- 단지 해부하기 전에 관류 저장 및 튜브에 차가운 관류 액을 붓는다. 뇌 해부를 위해 20 ~ 30 ㎖에 저장하고 얼음에 산소를 계속합니다. 튜브를 통해 높은 60 ML의 주사기에서 중력 흐름과 20 G 바늘 충분한 흐름을 제공합니다. 기포가 퇴색 될 때까지 솔루션을 실행할 수 있습니다. 산소를 계속합니다.
- 마우스의 흉곽 위의 피부를 다시 잘라. 흉곽을 들어 올리고 조심스럽게 진동판을 통해 수평 절단을합니다. 마음을 노출하는 팔쪽으로 흉곽 업을 통해 두 가지 측면 상처를 확인합니다. 흉곽을 다시 개최하는 집게를 사용합니다.
- 혈액이 vascu 밖으로 세척을위한 출구 지점을 제공하는 우심방에있는 작은 2mm 컷을고맙다 시스템.
- 충분한 바늘 구멍을 삽입하려면 관류 바늘로 좌심실에 구멍. 한 손으로 제자리에 바늘을 잡고 다른 손으로 관류 액의 흐름을 시작한다. 관류 액의 10 ~ 15 ㎖를 한 후, 혈액을 세척해야하며, 유출 물이 취소됩니다.
4. 뇌 슬라이스 및 해부
- 심장 재관류 후, 전송은 사용하기 직전에 얼음에 페트리 접시에 차가운 관류 솔루션을 산소.
- 신속, 목을 벨 두개골에서 뇌를 제거하고 관류 솔루션으로 뇌를 놓습니다. 뇌 제거하려면 앞으로 피부를 당겨, 눈 소켓쪽으로 두개골의 정중선 컷을 만들어, 각각의 눈을 향해 2 측면 컷을 만드는, 다시 두개골의 각면을 당겨 눈 소켓 사이에 관상 컷을하고, 집게를 사용하여 부드럽게 관류 솔루션으로 뇌를 동축 케이블 주걱을 사용합니다. 필요한 경우 광학 책자를 가위로 잘라 사용합니다. hypothalami을 터치하지 마십시오C 영역이가 중간 예하와 기본 시상 하부 조직에 너무 많은 압력을두고 있기 때문에 광학 책자를 잡아 당기지 마십시오.
- 조직이 (브레 그마 -3.52 mm) 잠수하는 동안 옆으로 시상 하부에 뇌 조직에게 약 3mm 후방 및 전방 트림 면도날과 바늘을 사용합니다. 뇌가 vibratome 척에 똑바로 앉아 있도록 전방 사이드 컷이 수평 위치하는 것이 특히 중요합니다.
- 솔루션에 남아있는 뇌 조직을 제거하고 장착 뇌 섹션에서 솔루션을 멀리 윅 필터 용지를 사용하십시오.
- vibratome 척에 슈퍼 접착제의 덩어리를 놓고 뇌의 크기에 접착제를 확산. 앞쪽면이 아래를 향과 시상 하부 칼날을 향하도록 접착제의 상단에있는 뇌 조직을 넣습니다. 심지 멀리 초과 접착제와는 vibratome 냉각 실에 척을 배치합니다. 이 솔루션으로 뇌 주위에 거품까지 배치 할 때와 같이 많은 접착제를 남기지 않도록주의하십시오.
- vibratom로전자 느린 속도 (레벨 2) 높은 진폭 (레벨 9)으로 설정, 시상 하부 영역에 도달 할 때까지 300 ~ 500 μm의 조각을 만든다. 이제 앞쪽에 후방에서 절단은 100 μm의 조각을 만든다. 다음과 같이 시각적 인 신호입니다. 세 번째 뇌실 (-2.70 -2.30 mm 인 브레 그마) 아주 작은 것입니다 시상 하부에 후방. 브레 그마 -2.30 mm에서 세 번째 뇌실은 관상 조각에 지느러미와 복부 부분으로 분리된다.
- 세 번째 뇌실 퓨즈의 섹션 (-2.18 -1.22 mm 인 브레 그마) VMH의 정확한 영역을 포함하는 두 개의 500 μm의 조각을하면. 앞쪽은 VMH에, 세 번째 뇌실은 더 이상 8 (-1.06 -0.82에 브레 그마) 두뇌의 복부 층으로 확장하지 않습니다.
- 얼음 포함하는 배지에서 배양 접시에이 조각을 전송합니다. 도 1에 도시 된 바와 같이 VMH (VMN + ARC)를 해부. 부드럽게 얼음 배지 2 ㎖의 VMH 조각을 전송 피펫을 사용합니다.
5. 해리와 문화
- 얼음에서 VMH를 제거하고 실내 온도에 배치합니다. 문화 미디어 4 ㎖에 20 U / ㎖ 파파인을 추가합니다. 34 ° C의 물을 욕조에 혼합 배치하는 반전. 소화 매체가 더 이상 흐린 때까지 매 순간을 검사하고 반전으로 섞는다. 멸균 플라스크에 (0.22 μm의) 필터 및 소화 매체로 조직을 전송합니다.
- 30 분 동안 34 ° C에서 100 rpm으로 흔들어 조직을 소화.
- 소화시 8 % 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는 매체 1 ㎖를 준비한다. 원뿔 튜브에 문화 미디어와 필터 1 ㎖ (0.22 μm의)에 80 밀리그램의 BSA를 녹입니다.
- 원뿔 튜브에서 배양 배지 5 ㎖로 전송 천천히 한 번 반전하여 조직을 씻으십시오.
- 문화 미디어 6 ㎖에 30 μL의 DNA 분해 효소 효소를 추가하고 분쇄 미디어를 만들기 위해 혼합한다. 세척 매체를 대기음 및 분쇄 매체의 3 ㎖를 추가합니다.
- (L)의 순서로 씹다하는 유리 피펫을 사용argest 작은합니다. 조심스럽게 배를 씹다하고 해결하는 더 큰 조각이 4 분을 기다립니다. 새로운 원추형 튜브에 해리 된 세포 현탁액을 포함하는 베스트 2 ㎖를 전송하는 제 피펫을 사용한다. , 분쇄 매체의 2 ML을 추가 배를 씹다 3 분을 기다립니다. 세포 현탁액에 최고 2 ㎖를 전송하는 제 피펫을 사용합니다. 분쇄 매체, 씹다 5 배의 1 mL를 넣고 2 분을 기다립니다. 세포 현탁액 2 ㎖ 가기를 전송하는 제 피펫을 사용한다.
- 혼합하지 않도록주의하고, 8 % BSA의 상단에있는 해리 세포 현탁액 레이어. 5 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기.
- 각 커버 슬립의 중심에 실린더를 복제 멸균 6mm X 8mm를 놓습니다. 커버 슬립이 완전히 건조해야한다. 기음과 440 ㎕의 따뜻한 성장 미디어에서 펠렛을 재현 탁. 20 분 동안 인큐베이터에있는 신경 세포의 서스펜션과 장소 실린더 복제를 입력합니다.
- 복제 실린더를 제거하고 매우 조심스럽게 이물질을 씻어. 각 요리 위스콘신 채우기성장 배지 2 ㎖ 일. 어떤 분석이 수행되기 전에 세포가 적어도 1 시간 동안 복구 할 수 있습니다.
6. MPD 이미징을위한 준비
- 121 mM의 NaCl을 4.7 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘, 0.1 mM의 MgCl2를, 1.2 ㎜ 망초, 0.97 mM의 K 2 HPO 4, 0.23 mM의 KH 2 PO 4, 5 mM의 탄산 수소 나트륨, 25 밀리미터로 구성된 레코딩 솔루션을 HEPES. 7.4으로 산도를 조정합니다.
- 원하는 낮은 포도당 테스트 솔루션 (0.1 ~ 2.0 mM의 포도당)를 만들기 위해 포도당을 추가합니다. 철저하게 혼합 400 ML에게 낮은 혈당 기록 솔루션을 보유하고 있습니다. 2.5 mM의 포도당 레코딩 솔루션을 철저하게 혼합 나머지 600 ML에 포도당을 추가합니다.
- 가능한 한 많은 빛으로부터 염료를 보호합니다. 블루 MPD 유리 병에 실온 버퍼의 4 ML을 추가합니다. 철저하게 혼합 ML 녹취 솔루션 당 5 μL 염료를 추가합니다. 솔루션 사이의 펫을 혼합하여 균일 한 용액을 유지합니다. 염료는 형광 M을 포함탈분극과 세포를 입력하고 분자 소광, 이는 세포막을 통과 할 수 olecules. 분취 량은 -20 ° C에 저장 4 일 이내에 사용할 수 있습니다. 냉동 - 해동을하지 마십시오 번 이상.
- 30 분 동안 34 ° C에서 2.5 mM의 포도당 레코딩 솔루션 플러스 염료의 2 ml의 세포를 품어. 건식 가열 블록이 사용될 수있다. 빛으로부터 보호합니다.
- 2.5 ㎜, 0.1 ㎜의 기록 솔루션 플러스 염료 주사기 펌프와 관류 시스템을 준비합니다. 60 ㎖를 주사기에서 튜브 매니 폴드에 연결되어 있어야합니다.
- 매니 폴드에 솔루션을 전환하기 전에 10 초는 주사기의 압력 상승을 방지하기 위해 ~을 위해 모든 펌프를 정지 한 후, 기다립니다. 압력 변화는 이미지의 실험을 왜곡하는 동안 현미경의 초점의 변화를 일으키는 원인이되는 신경 세포를 포함하는 폐쇄 챔버에 유체 전달을 변경합니다.
- 매니 폴드 출력 튜브 라인 히터와 밀폐 챔버에 연결 한 다음, 폴리에틸렌 배관에 접속되어야한다. 거품이 삭제되어야하고, 관류 속도는 0.5 ㎖ / 분으로 설정해야합니다. 빛으로부터 보호합니다.
- coverslip에 공기 방울을 소개 건조하지 수 있도록하지 않도록주의하고, 밀폐 된 챔버에 부착 신경과 25mm의 coverslip에 전송합니다. 슬립이 바닥 부분의 홈에 정렬되어, 레코딩 솔루션의 몇 방울 측면을 따라 배치하고, 상단 부분은 조심스럽게 제자리에 커버 슬립을 유지하기 위해 장착되어 있습니다.
- 레코딩 솔루션과 챔버를 기입 한 후 상단에 18mm의 coverslip에 배치하기 위해 적기를 사용합니다. 조심스럽게 제자리에 작은 커버 슬립을 보유하는 챔버에 흰색 링에 맞게. 밀폐 된 챔버로 유입되는 공기 방울을 방지하기 위해 아주 천천히 가볍게 누르십시오.
- 2.5 mM의 포도당 레코딩 솔루션, 아래로 흰색 링 프레스 주사기 펌프를 시작하고 밀폐 된 챔버에 연결합니다. 천천히 화이트 링에서 압력을 해제하고 폐기물 용기로 이어지는 배관에 연결합니다.
- 낮은 시야 빛을 사용하여 신경을 중앙에 배치합니다. 세포가 빛에 노출되는 시간의 양을 최소화하도록 시도한다.
- 관류 시스템은 온도, 초점이 안정화 할 수 있도록 10 분 동안 실행하고 균형을 염색 할 수 있습니다.
- 프라이밍 동안, Metamorph의 프로그램을 열고 뉴런의 밝은 이미지 필드 (10X)를 가지고 간다. 형광 이미지의 3 스택 (150 밀리 초, 좁은 Cy3에 필터, 10X)를 타고 5 μm의에서 초점을 결정하는 자동 초점 기능을 사용하십시오. 10 분 프라이밍 기간의 끝에서, 한번 더 초점을 확인.
- 40 분에 형광 이미지마다 30 초를 기록하기 시작합니다. 10 분 동안 2.5 mM의 포도당에 기준을 설정 한 다음 15 분 동안 혈당을 감소, 그리고 마지막 15 분 동안 2.5 mM의 포도당으로 돌아갑니다. 솔루션은 주사기 펌프를 정지 10 초를 기다리고, 매니 폴드의 포트를 돌려, 다른 주사기 펌프를 시작하여 변경됩니다. 변경 사항이 미리 원하는 시점 바의 발생해야매니 폴드와 세포 사이의 지연에 나오지.
- 모든 형광 이미지를 촬영 한 후, 신경의 시야 이미지를 촬영.
8. MPD 이미징 분석
- 실험의 끝에서 찍은 밝은 이미지 필드의 각 셀 주위에 타원형 영역을 만드는 데 Metamorph의를 사용합니다. 영역들은 각 뉴런보다 약간 커야하고 셀의 다크 에지의 외측 1 화소로 할 수있다. , 건강에 해로운 중복, 또는 파편에 가까운 셀을 선택하지 마십시오. 건강하지 못한 세포는 종종 어두운 나타납니다. 마지막으로, 배경 측정에 대한 세포 파편을 가진 지역에 5 큰 타원형 영역을 만들 수 있습니다.
- 모든 형광 이미지에 영역을 전송하고 어떤 운동 / 변화가 발생하지 않았는지 확인하기 위해 검사합니다. Excel 파일의 모든 이미지의 영역에 대한 각각의 형광 강도를 기록하는 측정 기능을 사용합니다. Metamorph의에서 저널의 사용을 권장합니다.
- 엑셀에서 각 fluoresc위한 5 배경 영역의 평균을 만들엔트 이미지. 이것은 각 시점에서의 평균 배경 값을 나타낸다. 각각의 이미지 / 시점의 경우, 모든 영역 측정에서 배경을 뺍니다. 배경 차감-형광 강도는 강도 이하로 언급 될 것이다.
- 각 셀의 경우, 분 녹화 2-8 동안의 평균 강도를 계산한다. 이 2.5 mM의 포도당에있는 세포의베이스 라인을 나타냅니다. 각 처리의 양단에 이분 버퍼는 노이즈를 최소화하기 위해 사용된다.
- 각 셀의 경우,베이스 라인에서의 변화율을 계산 : (강도-기준) / 기준
- 대 시간 기준의 퍼센트 변화에 선 그래프를 만듭니다.
- 18 ~ 23 분 동안 기준선에서 평균 변화율을 계산합니다. 35 ~ 40 분 동안 기준선에서 평균 변화율을 계산합니다. 화상 처리가 사용되지 않는 동안, 노이즈는 각 셀 영역 내의 강도의 평균값, 배경 빼기 및 5 분 O 이상의 영역 강도의 평균화를 통해 감소된다R 이상.
- 2.5 mM의 포도당 기록 액을 2.5 mM의 포도당 기록 용액으로 교환되는 제어 실험은 노이즈 임계 값을 결정하기 위해 수행되어야한다. 최소 6 요리와 3 마우스의 경우 18 ~ 23 분 동안 기준선에서 평균 변화율을 계산합니다. 이 값의 평균과 표준 편차를 결정합니다.
- 평균 플러스 2 표준 편차에 긍정적 인 탈분극 응답에 대한 임계 값을 설정합니다. 평균 플러스 2 표준 편차는 P <0.05와의 차이에 해당한다. 우리의 제어 실험은 적절한 임계 값으로 기준에서 10 %의 변화를 공개했다.
- 각 셀에 대해,이 기준에 따라 가역적 탈분극 반응을 평가. 첫째로, 18-23 분 동안 기준선에서 평균 변화율이 10 % 이상, 이전 단계에서 결정된 문턱 있어야한다. 둘째, 35 ~ 40 분 동안 기준선에서 평균 %의 변화가 적은의 평균 변화율의 절반 이상이어야합니다18 ~ 23 분 동안 기준. 이 글루타민산 염 또는 KCl을 함께 자극보다 더 엄격한 것으로 발견 된 이후 두 번째 기준은 선택되었다. 감소 포도당에 대한 그들의 반응은 되돌릴 수 없습니다에도 불구하고 건강에 해로운 신경 세포들은 글루타메이트 또는 KCl을 가진 자극에 반응한다.
- 각각의 요리에, 탈 편광 뉴런의 %를 계산합니다. 이 값은 다른 치료 그룹 사이에 GI 신경 세포의 %를 정량화하는 데 사용됩니다.
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Representative Results
멀리 다른 시상 하부 지역에서 VMH의 정확한 해부 일관된 결과를 얻을 것이 중요합니다. 다른 지역의 포함은 계산 감극 뉴런의 %를 변경, VMH 신경 인구를 희석 수 있습니다. 또한, 포도당 감지 신경 세포는 VMH 포도당 감지 신경 세포의 기능과 기계적으로 다를 수 있습니다 측면 시상 하부, 시상 하부와 같은 다른 지역에서 확인되었다. 1 적절한 해부에 대한 정확한 해부학 적 위치를 보여줍니다 그림. 상기 프로토콜에 따라, 정확한 VMH 영역을 포함하는 뇌 조직은 분해 될 수있다. 각 모집단 전체를 유지하면서 정확하게, VMN 및 ARC를 분리 또한 절개가 가능하지 않을 수 있습니다. 그림 2는 건강의 예 VMH 신경 해리 보여줍니다. 면역 세포를 사용하여, 우리는 우리의 준비가> 90 %의 신경 세포가 있음을 확인. 남은 건강한 뉴런 데이터 analy 사용해야너무 많은 건강에 해로운 신경 세포와 동생과 요리를 폐기해야합니다. 건강에 해로운 신경 세포는 종종, 매우 어두운 가장자리가 더 큰 범위에 MPD를지고 불규칙한 모양이있다. 또한, 뉴런은 대부분의 신경 세포가 녹화 도중 서로 닿지 않는지 같은 밀도로 도금해야한다. 분석을 위해 선택한 뉴런은 다른 세포 파편을 터치 할 수 없습니다.
GI 신경과 nonGI 신경 세포의 기록에서 얻은 데이터는 그림 3에 나와 있습니다. 10 분 기준선을 얻은 후, 세포는 글루코스 2.5-0.1 ㎜ 내지 감소 하였다. GI 신경이 기준에서 10 % 변화의 소정의 임계 값보다 더 강력한 가역 반응을 보여줍니다. 형광의 증가는 탈분극을 반영한다. GE 신경 세포 과분극 응답도 검출되지만, 주파수 포도당 감지 뉴런이 아형에이 기술을 성공적으로 사용하기 위해 (<1 % 뉴런)이 너무 낮다. 생리 glucos의 범위E 감소는 시험 하였다 가역적 감극 VMH 뉴런의 비율이 각 접시에 대해 계산 하였다.도 4는 양의 관계가 글루코스 감소 및 신경 세포를 탈분극의 비율의 크기 사이에 존재한다는 것을 보여준다. 이것은 성인 뮤린 신경의 성공적인 일차 배양 성인 VMH의 GI 뉴런의 연구를 허용하도록 형광 이미징과 함께 사용될 수 있음을 보여준다.
그림 1. 올바른 VMH 해부 용 마커 코로나 섹션. 해부 조직은 다른 시상 하부 영역에서 최소한의 오염과 VMN 및 ARC가 포함되어 있습니다. 대각선 커트는 ~에서 25 % -30 % 세 번째 뇌실의 맨 아래해야한다에 ~ 피질은 시상 하부 영역 (블루 *)를 만족하는 점과 세 번째 뇌실 사이에 25 % -30 %(3V). 마우스의 뇌 브레 그마-1.7에 해당 -2.8 mm 팍시 왓슨 1998 9. 브레 그마에서 적응 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 성인 마우스에서 건강한 VMH 신경의 시야 이미지.이 이미지는 분리 후 24 시간을 촬영하고 MPD 영상에 사용되어왔다. 것 (블루 *) 또는 (빨간색 x) 분석에 사용되지 않습니다가 표시됩니다 뉴런의 몇 가지 예입니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
에프igure 3. GI 신경 세포 (녹색 선)과 nonGI 신경 세포 (오렌지 라인)의 대표 MPD 형광 추적은. 세포는 15 분, 0.1 mM의 G에 감소 다음에 10 분 동안 2.5 mM의 포도당 (G) 기록 용액으로 관류 한 15 분 동안 2.5 mM의 G로 돌아갑니다. GI 신경 세포에서,베이스 라인의 퍼센트 변화는 0.1 ㎜ G 관류 기간 (20 ~ 25 분에서 40 % 평균) 동안 10 % 이상 증가하고 적은 2.5 밀리미터 G 반전 기간 (15의 증가의 절반 이상 감소 35 ~ 40 분에서 %의 평균). 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 역으로 형광 MPD 영상을 이용하여 검출 혈당 감소에 반응 탈분극 성인 VMH 신경 세포의 비율입니다.긍정적 인 관계는 포도당 감소와 뉴런을 탈분극의 비율의 크기 사이에 존재합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
성인 쥐에서 신경 세포의 활동을 연구 할 수있는 열쇠는 건강한 신경 세포를 해리 할 수있는 기능입니다. 성인 마우스의 시상 하부 신경 세포의 분리 청소년 쥐에서 신경 세포에 비해 프로토콜의 몇 가지 주요 단계에서 더 어렵습니다. 우리는 여러 가지 방법으로이 문제를 극복했다. 두께 500 μm의 뇌 조각을 만들기 젊은 쥐에서 뇌 조직에 사용되는 보통 250 ~ 350 μm의 슬라이스에 비해 신경 세포에 기계적 손상을 최소화합니다. 그러나, 두꺼운 조각 심장 관류 및 뇌 조직의 파파인 소화에 더 큰주의가 필요합니다. 혈액이 뇌 조직에서 볼 경우, 우심방의 컷과 좌심실에 배치 바늘의 정밀도와 위치를 평가한다. 유량 및 관류 액의 양이 또한 조정될 수있다. 혈액은 신경 세포에 독성이 건강한 뉴런의 낮은 수율 원인이되므로 철저한 살포는 필수적입니다. 파파인 소화 수 있도록 충분히 효율적이어야합니다부드러운 분쇄 및 뇌 조직에서 단일 세포를 쉽게 릴리스. 큰 조직 조각이 제 분쇄 중에 존재할 때 VMH 조직 소화의 끝에서 빠르게 싱크 때 비효율적 파파인 소화는 의심된다. 좋은 소화, 조직의 조각은 겨우 세 번째 분쇄시 육안으로 감지됩니다. 분쇄 부드러운없는 경우, 신경 세포의 건강을 겪게됩니다. 비효율적 파파인 소화가 의심되는 경우, 파파의 농도 5 U / ㎖로 증가 될 수 있거나 파파의 새로운 바이알을 사용할 수있다. 이 신경 세포의 건강에 악영향을 줄 수 있기 때문에 그러나, 파파인 농도가 30 U / ㎖ 이상으로 증가 할 수 없습니다.
BSA에 대한 노출은 프로토콜의 또 다른 중요한 단계입니다. 후 분쇄 세포는 시간 뉴런의 양 BSA에 노출되어 BSA는 펠릿으로 최소화해야한다 상태로 유지할 수있는 양 모두, BSA의 기울기에 원심 분리되었다. 뜨는 BSA의 그라데이션원심 분리 기간 바로 다음으로 발음해야한다. 진공 흡입은 상등액의 대부분을 제거하기 위해 사용될 수 있지만, 세포 펠렛이 중단되지 않도록 마지막 ~ 100 μL 피펫을 사용하여 수동으로 제거되어야한다. 건강한 신경 세포를 얻는 또 다른 중요한 양태는 세포 밀도를 최적화하는 것이다. 도금 뉴런은 너무 띄엄 띄엄으로 건강하지 않다. 이렇게 몇몇 뉴런 각 마우스의 뇌에서 얻은 때문에, 도금 전에 세포를 세는 실용적이지 않다. 카운팅 소비 될 시간 동안, 세포의 상당수는 플라스틱에 부착 것이고 손실 될 것이다. 출발점으로 마우스 당 4 요리 (~ 1 × 104 세포 / ml)를 사용하여, 식기의 개수의 경험적 결정은 최적의 신경 세포 밀도를 달성하기위한 가장 실용적인 방법이다. 이전 마우스에서 VMH 뉴런의 수율은 어린 마우스에서 수율의 약 절반이 될 것으로 예상 할 수있다. 신경 세포의 수율을 개선하기 위해 추가 문제 해결이 남아있는 신경 세포의 정량화를 포함해리 프로토콜의 각 단계에서 무거운 신경 세포의 감소의 단계를 정확히 파악할 수 있습니다.
우리의 프로토콜을 사용하여, 건강한 해리 뉴런 2 ~ 3 일까지 문화에서 살아남을 수 있습니다. 그러나, 필터링 성상 세포 에어컨 성장 미디어의 사용은 신경이 문화 2 주까지 생존 할 수 있습니다. 성장 미디어 하룻밤 합류 기본 성상 세포의 배양에 의해 조절 될 수있다. 같은 설치류 변형, 성별, 뇌 영역에서 성상 세포가 활용되어야한다. 성상 세포 에어컨 미디어의 사용은 다른 변수를 소개하면서,이 수정은 문화에 더 많은 시간을 필요로하는 다른 실험이 필요할 수 있습니다. 또한, 명확하지 않은 이유로, 우리는 포도당을 감지 할 수있는 능력이 쉽게 이러한 글루타민산 염과 같은 다른 자극에 대한 반응의 유지에도 불구하고, 차선의 신경 세포의 건강과 잃어버린 것으로 나타났습니다. 따라서, 추가적인주의가 필요하다. 감소 포도당 신경 반응을 관찰하기 위해, 염도 피하기 위해 필수적의 균에 의한 곰팡이, 염, 비누 및 글루코스. 모든 유리 및 비 멸균 플라스틱 철저 dH보다 2 O.로 세척해야한다 오염 물질을 살고 외에, 세제 및 염은 신경 세포의 무결성과 활동에 영향을 미칠 것입니다. 포도당의 작은 금액이 크게 포도당 농도를 변경할 수 있습니다. 포도당 감지 신경이 0.1-2.5 mM의 10, 11의 nonhyperglycemic 생리적 범위 내에서 세포의 포도당의 작은 변화에 매우 민감하기 때문에이 결과를 방해 할 것입니다.
치료 그룹 사이의 MPD 영상, 일관성과 나란히 실험을 활용하면 의미있는 결과를 위해 매우 중요합니다. 가능하거나 적어도 일을 교대로하는 경우에 다른 치료 그룹은 같은 날 시험을해야한다. 이것은 문화의 준비 또는 MPD 분량 씩 가능한 변형을 최소화합니다. 또한, 우리는 이미지가 위에서 언급 한 이유로 신경 분리의 24 시간 내에서 수행 될 때 가장 변화가 발생하였습니다. 결과부터VMH의 해부 및 신경 세포의 준비에 신경 정확성과 일관성을 탈분극의 %로 분석하는 것은 필수적이다. 수확 전체 VMH의 신경 세포의 인구는 일정해야하고 다른 지역의 뉴런을 포함 할 수 없습니다. 따라서, 위의 프로토콜은 밀접하고 정확하게 따라야한다. 대안적인 실험이 수행 될이며 인구 정비가 중요하지 않은 경우, 티슈 펀치 VMN 또는 ARC 신경 세포를 분리 할 수있다.
여기에서 설명하는 방법은 성인 마우스와 방법을 포도당 감지 신경 세포를 연구하는 MPD의 이미지를 사용하는 방법에서 건강 VMH 신경을 수확하는 방법을 설정합니다. 대신, 실험은 포도당 변경 이외의 자극에 VMH 신경 세포의 반응을 조사하기 위해 설계 될 수있다. 대안 적으로, 해리 프로토콜은 다른 뇌 영역에서 신경 세포 수확에 외삽 될 수있다. 성체 생쥐에서 신경 세포를 사용하여, 연구는 지금 나이 또는 진행을 개발 뮤린 질병 모델을 사용하여 수행 될 수있다. MoreoveR, 건강한 성인 뉴런은 또한 칼슘 이미징, 전기 생리학, 단일 셀 PCR, 면역 세포 화학 또는 이들 기술의 조합과 같은 MPD 촬상 이외의 기술을 이용하여 연구 될 수있다.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI | used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
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- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
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