Summary
La actividad de las neuronas individuales de ratones adultos en edad puede ser estudiado por disociar las neuronas de regiones específicas del cerebro y el uso de membrana fluorescente potencial de formación de imágenes de colorante. Por respuestas de prueba a cambios en la glucosa, esta técnica se puede utilizar para estudiar la sensibilidad a la glucosa de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos.
Abstract
Estudios de la actividad neuronal se realizan a menudo utilizando las neuronas de los roedores de menos de 2 meses de edad, debido a las dificultades técnicas asociadas con el aumento de tejido conectivo y la disminución de la viabilidad neuronal que se producen con la edad. Aquí se describe una metodología para la disociación de las neuronas hipotalámicas sanos de ratones adultos en edad. La capacidad para estudiar las neuronas de los ratones de edad adulta permite el uso de modelos de enfermedades que se manifiestan a una edad más tarde y podría ser de desarrollo más preciso para ciertos estudios. Imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas se puede utilizar para estudiar la actividad de una población de neuronas, en lugar de utilizar la electrofisiología para estudiar una sola neurona. Esto es particularmente útil cuando el estudio de una población neuronal heterogéneo en el que el tipo neuronal deseada es rara como para las neuronas hipotalámicas de glucosa de detección. Hemos utilizado el potencial de membrana de imagen de colorante de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos para estudiar sus respuestas a changes en glucosa extracelular. Neuronas detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en la regulación central del balance de energía. La capacidad para estudiar detección de glucosa en roedores adultos es particularmente útil ya que el predominio de enfermedades relacionadas con el balance de energía disfuncional (por ejemplo. La obesidad) aumentar con la edad.
Introduction
El cerebro regula la homeostasis de la energía a través de la neuroendocrino y el sistema nervioso autónomo. El hipotálamo ventromedial (HVM), compuesto por el núcleo ventromedial (VMN) y el núcleo arqueado (ARC), es importante para la regulación central de la homeostasis energética. Neuronas de detección de glucosa especializados, dentro del hipotálamo ventromedial, vinculan la actividad neuronal y periférico homeostasis de la glucosa 1. Hay dos tipos de glucosa de detección de glucosa en las neuronas; excitado (GE), las neuronas aumentan mientras que la glucosa inhibe (GI), las neuronas disminuyen su actividad a medida que aumenta extracelulares de glucosa. Neuronas de detección VMH glucosa se estudian generalmente usando electrofisiología o calcio / potencial de membrana de formación de imágenes colorante sensible.
La técnica de patch clamp electrofisiológico se considera el estándar de oro en el estudio ex vivo de la actividad neuronal. En esta técnica, un electrodo de micropipeta de vidrio está unido a la membrana celular a través de una alta resistencia(GΩ) sello. Electrodos de patch clamp permiten la grabación en tiempo real de la acción potencial de la frecuencia (pinza de corriente) o conductancia de iones (fijación de voltaje) cambia dentro de una sola neurona. Mientras que la técnica de patch clamp proporciona información detallada con respecto a los cambios en las conductancias de los canales de iones específicos, un gran inconveniente es que sólo una neurona puede observado a la vez. Se tarda aproximadamente 30 a 45 min de la grabación para comprobar que uno está grabando desde una neurona detección de glucosa, incluso antes de comenzar un tratamiento experimental específico. Por otra parte, las neuronas GI y GE comprenden <20% de la población total neuronal hipotálamo ventromedial. Agravando este problema es la falta, en muchos casos, de un marcador celular para la identificación de estas neuronas. Por lo tanto, está claro que a pesar de que proporciona valiosa información eléctrica que otras técnicas no pueden, el análisis de patch clamp es laborioso, lento y bajo rendimiento.
El uso de imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas VMH permite el estudio de Hundreds de neuronas simultáneamente. Colorantes sensibles al calcio pueden ser utilizados para medir los cambios de calcio intracelular, lo que indirectamente se correlacionan con los cambios en la actividad neuronal. Potenciales colorantes sensibles de membrana se utilizan para supervisar los cambios potenciales de membrana. La medición de potencial de la membrana celular es un índice más directa de la actividad neuronal en comparación con los cambios en los niveles de calcio intracelulares. Por otra parte, el potencial de formación de imágenes de membrana tinte (MPD) potencialmente detecta pequeños cambios en el potencial de membrana en la potencial de acción disparando no se altera y los niveles intracelulares de calcio podría no cambiar. Ambas técnicas de formación de imágenes de fluorescencia se han utilizado para estudiar VMH neuronas de detección de glucosa a partir de ratones jóvenes 2-7. Si bien los resultados son menos detalladas que las obtenidas con la electrofisiología de pinzamiento zonal, la fuerza de los experimentos de imagen es que evaluar simultáneamente una gran población de células que incluyen inevitablemente un importante número de neuronas de detección de glucosa. MPD imágenes is particularmente útil para el estudio de las neuronas GI que se localizan a lo largo de todo el hipotálamo ventromedial de manera más uniforme; proporcionando así una población adecuada para estudiar en el hipotálamo ventromedial disociado (~ 15% GI). En contraste, mientras que las neuronas de GE están densamente localizado en el ventrolateral-VMN y pobres de células región entre el arco y VMN, que no representan un número significativo de neuronas dentro del hipotálamo ventromedial (<1% GE). Por otra parte, mediante el estudio de las neuronas aisladas, astrocítica y efectos presinápticos son eliminados. Esto puede ser una ventaja en el estudio de efectos de primer orden de las neuronas, así como una desventaja ya que se pierden las conexiones y procesos fisiológicos.
Un factor limitante en tanto patch clamp electrofisiología y la imagen de colorante MPD / calcio es la necesidad de utilizar animales jóvenes (por ejemplo, ratones o ratas. <8 semanas de edad). Esto se produce principalmente debido al aumento de tejido conectivo en combinación con la disminución de la viabilidad neuronal que se produce con la edad. En el cerebro-slice espárrago electrofisiologíaIES, el aumento de tejido conectivo hace que sea más difícil de visualizar las neuronas. El aumento de tejido conectivo también hace más difícil disociar un gran número de neuronas sanas para los estudios de imagen. Además, las neuronas de los animales más jóvenes sobreviven más tiempo durante la grabación de patch clamp o imágenes. Sin embargo, el uso de ratones jóvenes puede ser una limitación importante. Actividad y / o respuestas a neurotransmisores o nutrientes que circulan neuronal cambian con la edad. Por ejemplo, dado que el balance de energía está estrechamente ligada a la situación reproductiva, las neuronas del hipotálamo que regulan el equilibrio energético pueden responder de manera diferente en la pre-vs animales postpubescent. Además, muchas enfermedades requieren tratamiento a largo plazo o no se manifiestan hasta la edad adulta. Los principales ejemplos de tales enfermedades son obesidad dietética o diabetes mellitus tipo 2. Dado que las neuronas de detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en estas enfermedades hemos desarrollado una metodología para el cultivo con éxito neuronas adultas del VMH saludables para su uso en formación de imágenes de exp MPDeriments.
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Protocol
1. Animales
- Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey.
- Casa Group masculino C57BL / 6 ratones en un horario oscuro hr light/12 12 horas y permitir el acceso ad libitum al agua y los alimentos. Sacrificar a los 4-5 meses de edad. La eutanasia de los ratones se realizó utilizando el plano quirúrgico de anestesia y una forma secundaria de la eutanasia (es decir, penetrar en la incisión en la cavidad torácica a través de la membrana). Esto es consistente con las Directrices de la AVMA en Eutanasia.
2. Preparación de la perfusión de soluciones, cubreobjetos, pipetas de vidrio, y Medios de Comunicación
- Hacer solución de perfusión 1L que consiste en 2,5 mM de KCl, 7 mM de MgCl 2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 mM de NaHCO3, 0,5 mM de CaCl2, glucosa 7 mM, ascorbato 1 mM, y piruvato 3 mM en agua destilada dH 2 O. Ajuste la osmolaridad de ~ 300 mOsm utilizando aproximadamente 80 g / L de sacarosa. De compuestos oxigenados por burbujeo con 95% de O2 / 5% de CO 2 y ajustar el pH a 7,4. Cada experimento requerirá aproximadamente 200 ml de solución de perfusión. Las alícuotas se pueden almacenar a -20 ° C durante hasta 2 meses.
- Hacer 250 ml Neurobasal madre que contiene los medios de comunicación Neurobasal sin glucosa, glucosa 2,5 mM, y 100 U / ml de penicilina-estreptomicina. Ajuste la osmolaridad de las acciones Neurobasal a 280 mOsm usando sacarosa. Marca 500 ml Hibernate madre que contiene Hibernate-A los medios de comunicación sin glucosa, glucosa 2,5 mM y 100 U / ml penicilina-estreptomicina.
- Revuelva las dos poblaciones bien y filtrar esterilizar utilizando Stericup unidades de filtro de vacío. Tenga cuidado de no introducir la glucosa u otros contaminantes a través de las barras de las copas o revolver. Envuelva las botellas en papel de aluminio para proteger los medios de comunicación de la luz y almacenar a 4 ° C durante un máximo de 2 meses.
- La llama de la punta de 4 pipetas de vidrio esterilizados en autoclave (9 pulgadas) de manera que las puntas no son lodiámetros nger afilados y la apertura es grande (~ 0,9 mm), medio-grande (~ 0,7 mm), media (~ 0,5 mm) y pequeño (~ 0,3 mm). El más grande se debe apenas pulido y el más pequeño debe haber alrededor de un tercio de ese diámetro.
- El día antes de las neuronas de cosecha, limpias cuatro cubreobjetos de vidrio de 25 mm utilizando etanol al 70% y que pasan a través de una llama de un mechero Bunsen. Coloque cada cubreobjetos en un 35 mm placa de cultivo estéril y añadir 2 ml estéril 1% de poli-D-lisina en dH 2 O. Ponga los platos en una incubadora (37 ° C) durante la noche. Al día siguiente, lavar con dH 2 O estéril 3x y permitir cubreobjetos se seque por completo.
- Hacer 75 alícuotas de 1 M de ácido láctico y 200 ml de alícuotas de GlutaMAX; almacenar a -20 ° C. Descongelar totalmente alícuotas de ácido láctico y GlutaMAX antes de su uso para asegurar la homogeneidad.
- En el día de las neuronas de cosecha, hacer 30 ml de medio de cultivo fresco que consisten en Hibernate-A de stock 1 mM que contiene ácido láctico, 0,5 mM GlutaMAX, y 2% B27 sin insulina. VoRTEX de y ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH 1N.
- Poner 10 ml de medio de cultivo en una placa de Petri de 60 mm de vidrio en el hielo, poner 2 ml en un tubo cónico de 15 ml en hielo y mantener los medios de comunicación restantes a temperatura ambiente.
- En el día de las neuronas de cosecha, hacer 25 ml de medio de crecimiento fresco que consisten en Neurobasal de stock que contenía 1 mM de ácido láctico, mM de GlutaMax 0,5, y 2% B27 sin insulina. Vortex y ajustar el pH a 7,4 utilizando NaOH 1N. Permitir que el medio de crecimiento fresco se equilibre en una incubadora (37 ° C, 5% de CO 2) durante al menos 30 min.
3. Perfusión cardíaca
- Descongelar totalmente 200 ml solución de perfusión y de compuestos oxigenados con un 95% de O 2/5% de CO 2 en hielo durante al menos 15 min.
- Lavar una hoja vibratome con acetona, etanol al 70%, y dH 2 O. Coloque la hoja en la vibratome.
- Enjuague la cámara de enfriamiento vibratome y tubos de perfusión con dH 2 O. Llene la cámara de refrigeración (4 ° C) Con solución de perfusión y continuar para oxigenar.
- Anestesiar a un ratón con pentobarbital sódico 50 mg / ml, se diluyó 1:01 con agua estéril, se inyecta por vía intraperitoneal. Verifique que el ratón está totalmente anestesiado por pellizcar la cola y observar ninguna respuesta.
- Verter solución de perfusión fría en el depósito de perfusión y tubos justo antes de la disección. Ahorra 20 a 30 ml para la disección del cerebro y continuar para oxigenar el hielo. El flujo por gravedad desde una elevada jeringa de 60 ml a través del tubo y una aguja de calibre 20 proporciona un caudal suficiente. Deje que la solución funcione hasta que las burbujas de aire son lavados. Continuar para oxigenar.
- Reduzca la piel por encima de la caja torácica del ratón. Levante la caja torácica y cuidadosamente haga un corte horizontal a través del diafragma. Haga dos cortes laterales a través de la caja torácica hacia los brazos para exponer el corazón. El uso de fórceps para contener la caja torácica.
- Hacer un pequeño corte de 2 mm en la aurícula derecha para proporcionar un punto de salida para que la sangre se lava fuera de la vascularizaciónsistema lar.
- Perforar el ventrículo izquierdo con la aguja de perfusión, lo suficiente para insertar la abertura de la aguja. Mantenga la aguja en su lugar con una mano y comenzar el flujo de la solución de perfusión con la otra mano. Después de 10 a 15 ml de solución de perfusión, la sangre debe ser lavado y el efluente se borrará.
4. Cerebro rebanar y disección
- Después de la perfusión cardiaca, la transferencia oxigenada solución de perfusión en frío a una placa de Petri en hielo justo antes del uso.
- Rápidamente decapitar, retire el cerebro contra el cráneo y el lugar del cerebro en la solución de perfusión. Para extraer el cerebro: tire de la piel hacia adelante, hacer un corte en la línea media en el cráneo hacia las cuencas de los ojos, hacer 2 cortes laterales uno hacia el ojo, usar pinzas para tirar de cada lado del cráneo, hacer un corte coronal entre las cuencas de los ojos, y use una espátula para persuadir suavemente el cerebro hacia la solución de perfusión. Utilice unas tijeras para cortar las vías ópticas si es necesario. No tocar el hipotálamoZona C y no tire de las vías ópticas, porque esto pone mucha presión en la eminencia media y el tejido hipotalámico subyacente.
- Utilice una hoja de afeitar y la aguja para recortar lateralmente el tejido cerebral de aproximadamente 3 mm posterior y anterior al hipotálamo, mientras que se sumerge el tejido (bregma -3,52 mm). Es especialmente importante que el corte lateral anterior esté nivelado para que el cerebro se siente erguida en la tirada vibratome.
- Retire el tejido cerebral restante de la solución y utilizar papel de filtro para absorber la solución de la sección del cerebro montado.
- Coloca una gota de pegamento en un mandril vibratome y difundir el pegamento con el tamaño del cerebro. Ponga el tejido cerebral en la parte superior de la cola con la cara anterior hacia abajo y el hipotálamo frente a la cuchilla. Wick el exceso de pegamento y colocar el plato en la cámara de refrigeración vibratome. Tenga cuidado de no dejar mucho pegamento, ya que la burbuja alrededor del cerebro cuando se coloca en solución.
- Con el Vibratome ajuste a una velocidad lenta (nivel 2) y alta amplitud (nivel 9), hacer 300-500 micras rodajas hasta llegar al área hipotalámica. Ahora haga delgadas 100 micras rodajas de corte de la parte posterior a la anterior. Las señales visuales son las siguientes. Posterior al hipotálamo el tercer ventrículo será muy pequeña (bregma -2,70 a -2,30 mm). En bregma -2,30 mm, el tercer ventrículo se separa en secciones dorsal y ventral en el corte coronal.
- Una vez que las secciones de la tercera fusible ventrículo, hacen dos 500 micras rebanadas que van a contener la región correcta del hipotálamo ventromedial (bregma -2,18 a -1,22 mm). Anterior a la VMH, el tercer ventrículo ya no se extiende hasta el suelo ventral del cerebro (bregma -1,06 a -0,82) 8.
- Transferir estas rebanadas de la placa de Petri en hielo que contiene medios de cultivo. Diseccionar el hipotálamo ventromedial (VMN + ARC) como se muestra en la Figura 1. Utilice una pipeta para transferir suavemente los pedazos VMH en 2 ml de medio de cultivo en el hielo.
5. Disociación y Cultura
- Retire el hipotálamo ventromedial de hielo y poner a temperatura ambiente. Añadir 20 U / ml de papaína a 4 ml de medio de cultivo. Invertir para mezclar y colocar en un 34 ° C baño de agua. Compruebe y mezclar por inversión cada minuto hasta que los medios de comunicación la digestión ya no está nublado. Filtrar (0,22 m) en un matraz estéril y transferir el tejido a los medios de la digestión.
- Se digiere el tejido por agitación a 100 rpm a 34 ° C durante 30 min.
- Preparar 1 ml de medio que contiene 8% de albúmina de suero bovino (BSA) durante la digestión. Disolver 80 mg de BSA en 1 ml de medios de cultivo y de filtro (0,22 m) en un tubo cónico.
- Lavar el tejido mediante la transferencia a 5 ml de medios de cultivo en un tubo cónico y lentamente invirtiendo una vez.
- Añadir 30 l de la enzima DNasa a 6 ml de medio de cultivo y se mezcla para hacer los medios de trituración. Aspirar los medios de lavado y añadir 3 ml de medio de trituración.
- Use las pipetas de vidrio para triturar en el orden de largest a menor. Tritura suavemente 10 veces y luego esperar 4 minutos para las piezas más grandes para solucionar. Utilice la segunda pipeta para transferir los 2 ml superiores que contienen una suspensión de células disociada a un nuevo tubo cónico. Añadir 2 ml de medio de trituración, triturar 10 veces y esperar 3 min. Utilice la tercera pipeta para transferir los 2 ml superiores de la suspensión de células. Añadir 1 ml de los medios de trituración, 5x triturar y esperar 2 min. Utilice la cuarta pipeta para transferir la parte superior 2 ml de la suspensión celular.
- Capa de la suspensión celular disociada en la parte superior de la BSA 8%, teniendo cuidado de no mezclar. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min.
- Coloque autoclave de 6 mm x 8 mm clonación cilindros en el centro de cada cubreobjetos. Cubreobjetos deben estar completamente secos. Aspirar y resuspender el precipitado en 440 medios de cultivo l cálido. Rellene clonación cilindros con la suspensión neuronal y colocar en la incubadora durante 20 min.
- Retire los cilindros de clonación y muy suavemente lavar escombros. Llene cada wi platoº 2 ml de medio de crecimiento. Permiten a las células para recuperar por lo menos 1 hora antes de realizar cualquier ensayo.
6. Preparación para el MPD Imaging
- Haga solución de grabación que consiste en NaCl 121 mM, 4,7 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 0,1 mM de MgCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 0,97 mM K 2 HPO 4, 0,23 mM KH 2 PO 4, 5 mM NaHCO 3, y 25 mM HEPES. Ajustar el pH a 7,4.
- Añadir la glucosa para hacer la solución de ensayo bajo nivel de glucosa deseado (glucosa 0,1-2,0 mM). Mezclar bien y reservar 400 ml solución de bajo grabación glucosa. Añadir la glucosa a las restantes 600 ml para que la solución de grabación de glucosa 2,5 mM y mezclar bien.
- Proteja tinte de la luz tanto como sea posible. Añadir 4 ml de temperatura ambiente Buffer a un vial de Blue MPD. Mezclar bien y añadir 5 l colorante por solución de grabación ml. Mantener la solución homogénea mezclando con la pipeta en entre soluciones. El tinte fluorescente contiene molecules, que entran en las células con la despolarización, y moléculas de extintor, que no pueden cruzar la membrana celular. Las alícuotas se pueden conservar a -20 ° C y se utilizó dentro de 4 días. No congelar y descongelar más de una vez.
- Se incuban las células en 2 ml de solución 2,5 mM de glucosa grabación además de colorante a 34 º C durante 30 min. Un bloque de calentamiento en seco se puede utilizar. Proteger de la luz.
- Preparar bombas de jeringa y sistema de perfusión con 2,5 mM y 0,1 mM más soluciones de grabación de tinte. Tubo de 60 ml jeringas debe ser conectado a un colector.
- Después de parar cualquier bomba, espere ~ 10 seg antes de cambiar las soluciones en el colector para evitar la acumulación de presión en la jeringa. Los cambios de presión alteran de suministro de fluido a la cámara cerrada que contiene las neuronas, provocando cambios en el foco del microscopio durante el experimento y la distorsión de las imágenes.
- El tubo de salida del colector debe estar conectado a un calentador en línea y luego un tubo de polietileno, que se conecta a una cámara cerrada. Las burbujas deben borrarse y la tasa de perfusión se debe establecer en 0,5 ml / min. Proteger de la luz.
- Transfiera 25 mm cubreobjetos con las neuronas adherentes a la cámara cerrada, teniendo cuidado de no permitir que el cubreobjetos se seque y no introducir burbujas de aire. El deslizamiento se alinea en las ranuras de la pieza inferior, un par de gotas de solución de grabación se coloca a lo largo de los lados, y la pieza superior está equipado con cuidado para mantener el cubreobjetos en su lugar.
- Utilice un gotero para llenar la cámara con una solución de grabación y luego colocar un cubreobjetos de 18 mm en la parte superior. Encajar suavemente anillo blanco en la cámara para mantener el cubreobjetos más pequeños en su lugar. Presione hacia abajo muy lentamente y suavemente para evitar las burbujas de aire se introduzca en la cámara cerrada.
- Arranque la bomba de jeringa para la solución de grabación de glucosa 2,5 mM, presione hacia abajo el anillo de color blanco, y conectarse a la cámara cerrada. Lentamente libere la presión del anillo blanco y conectarse a la tubería que conduce a un contenedor de residuos.
- Centre las neuronas usando poca luz brillante campo. Trate de minimizar la cantidad de tiempo que las células están expuestas a la luz.
- Deje que el sistema de perfusión funcione durante 10 minutos para permitir la estabilización de la temperatura, concentración y tinte equilibrio.
- Si bien cebado, abra el programa MetaMorph y tomar una imagen de campo claro (10 veces más) de las neuronas. Utilice la función de enfoque automático para tomar 3 pilas de imágenes fluorescentes (150 ms, filtro Cy3 estrecho, 10X) y determinar el enfoque dentro de 5 micras. Al final del período de cebado 10 min, comprobar el enfoque una vez más.
- Comience a grabar imágenes fluorescentes cada 30 segundos durante 40 min. Establecer una línea de base en glucosa 2,5 mM durante 10 min, a continuación, disminuir la glucosa durante 15 min, y finalmente volver a la glucosa 2,5 mM durante 15 min. Soluciones se cambian al detener una bomba de jeringa, esperando 10 segundos, girando un puerto en el colector, y de iniciar otra bomba de jeringa. Los cambios deben ocurrir antes de los puntos de tiempo deseados based en el desfase entre el colector y las células.
- Después de grabar todas las imágenes fluorescentes, tomar una imagen de campo claro de las neuronas.
8. Análisis MPD Imaging
- Utilice MetaMorph para crear regiones ovales alrededor de cada celda de la imagen de campo brillante tomada en el final del experimento. Las regiones deberían ser un poco más grande que cada neurona y se pueden hacer 1 pixel fuera del borde oscuro de la célula. No elija las células que no son saludables, se superponen, o cerca de los escombros. Las células enfermas a menudo se ven oscuras. Por último, crear 5 grandes regiones ovales en áreas con ausencia de células o restos de mediciones de fondo.
- Transfiera las regiones a todas las imágenes fluorescentes e inspeccionar para verificar que se ha producido ningún movimiento / cambio. Utilice la función de medición para registrar la intensidad de fluorescencia de cada región para todas las imágenes en un archivo de Excel. Se recomienda el uso de Revistas en Metamorph.
- En Excel, cree una media de las regiones 5 fondo para cada colgimagen ent. Esto representa el valor medio de fondo en cada punto de tiempo. Para cada punto de la imagen / tiempo, restar el fondo de todas las mediciones de la región. La intensidad de fondo-resta de fluorescencia se denominan en adelante la intensidad.
- Para cada celda, el cálculo de la intensidad media durante 2-8 minutos de grabación. Esto representa la línea de base de la célula en glucosa 2,5 mM. Un tampón de 2 minutos en ambos extremos de cada tratamiento se utiliza para minimizar el ruido.
- Para cada celda, se calcula el porcentaje de cambio desde la línea base: (Intensidad-Línea de base) / Línea de base
- Crear un gráfico de líneas con el porcentaje de cambio desde la línea base con respecto al tiempo.
- Calcule el cambio porcentual promedio desde la basal durante 18-23 minutos. Calcule el cambio porcentual promedio desde la basal durante 35-40 minutos. Si bien el procesamiento de imágenes no se utiliza, el ruido se reduce a través de la promediación de la intensidad dentro de cada región celular, sustracción de fondo, y el promedio de la intensidad de región en 5 min OR más largo.
- Los experimentos de control en las que se intercambia solución de grabación de glucosa 2,5 mM con solución de grabación de glucosa 2,5 mM deben ser realizados para determinar el umbral de ruido. Calcule el cambio porcentual promedio desde la basal durante 18-23 minutos por lo menos por 6 platos y 3 ratones. Determinar la media y la desviación estándar de estos valores.
- Establecer el umbral de una respuesta positiva a la despolarización de la media más 2 desviaciones estándar. La media más 2 desviaciones estándar corresponde a una diferencia con p <0,05. Nuestros experimentos de control mostraron un cambio del 10% del valor inicial como el valor umbral adecuado.
- Para cada celda, evaluar la respuesta de despolarización reversible basado en 2 criterios. En primer lugar, el cambio medio por ciento de la línea de base durante 18-23 minutos debe ser mayor que 10%, el umbral determinado en el paso anterior. En segundo lugar, el cambio porcentual promedio desde la basal durante 35-40 minutos debe ser inferior a la mitad de la variación porcentual promedio dela línea de base durante 18-23 minutos. El segundo criterio se eligió ya que se encontró que era más rigurosa que la estimulación con glutamato o KCl. Las neuronas no saludables a menudo responden a la estimulación con glutamato o de KCl a pesar de que sus respuestas a la disminución de la glucosa no son reversibles.
- Para cada plato, se calcula el% de las neuronas despolarizadas. Este valor se utiliza para cuantificar el% de neuronas GI entre los diferentes grupos de tratamiento.
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Representative Results
La disección precisa de la VMH lejos de otras zonas del hipotálamo es importante para obtener resultados consistentes. La inclusión de otras áreas podría diluir la población neuronal VMH, cambiando el% de neuronas despolarizadas calculados. Además, las neuronas de detección de glucosa se han identificado en otras regiones hipotalámicas, tales como el hipotálamo lateral, la cual puede diferir funcionalmente y mecánicamente a partir de glucosa detección de neuronas VMH. Figura 1 ilustra las ubicaciones anatómicas correctas para la disección adecuada. Siguiendo el protocolo anterior, tejido cerebral que contiene la región correcta VMH puede disociarse. Además la disección para separar precisamente el VMN y ARC, manteniendo al mismo tiempo la totalidad de cada subpoblación, puede no ser posible. Figura 2 muestra un ejemplo de sana disociado neuronas VMH. El uso de inmunocitoquímica, se confirmó que nuestra preparación es> 90% neuronal. Sólo las neuronas sanas deben ser utilizados para análisis de datossis y platos con demasiadas neuronas saludables deben ser desechados. Las neuronas que no son saludables a menudo tienen bordes muy oscuras, tomen el MPD en mayor medida, y tienen formas irregulares. Además, las neuronas deben sembraron a una densidad tal que la mayoría de las neuronas no se tocan entre sí durante la grabación. Las neuronas elegidos para el análisis no deben estar en contacto con otras células o restos.
Los datos obtenidos a partir de grabaciones de una neurona GI y una neurona nonGI se muestran en la Figura 3. Después de obtener una línea de base durante 10 minutos, la glucosa extracelular se redujo desde 2,5 hasta 0,1 mM. La neurona GI muestra una respuesta robusta reversible mayor que el umbral predeterminado de cambio 10% del valor basal. El aumento de la fluorescencia refleja la despolarización. Mientras que también se detectan respuestas de hiperpolarización GE neurona, la frecuencia es demasiado baja (<1% de neuronas) para el uso con éxito de esta técnica en este subtipo de neurona detección de glucosa. Una gama de glucos fisiológicosE disminuye se probaron y se calculó el porcentaje de neuronas VMH que despolariza de forma reversible para cada plato. Figura 4 muestra que existe una relación positiva entre la magnitud de la disminución de la glucosa y el porcentaje de neuronas despolarizante. Esto demuestra que el cultivo primario de neuronas éxito murinos adultos se puede utilizar en conjunción con imágenes de fluorescencia para permitir el estudio de adultos VMH neuronas GI.
Figura 1. Sección coronal con marcadores para la disección HVM correcta. El tejido diseccionado contiene el VMN y ARC con la mínima contaminación de otras áreas del hipotálamo. Se deben hacer cortes diagonales de ~ 25-30% por debajo de la parte superior del tercer ventrículo a ~ 25-30% entre el punto en el que la corteza se encuentra con el área hipotalámica (azul *) y el tercer ventrículo(3V). Adaptado de bregma -2,8 mm Paxinos y Watson 1998 9, correspondiente a Ratón Cerebro bregma-1.7mm. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Imagen de campo claro de las neuronas VMH sanos de un ratón adulto. Esta imagen fue tomada 24 h después de la disociación y se ha utilizado para obtener imágenes de MPD. Algunos ejemplos de las neuronas que lo haría (azul *) o no (rojo x) sea utilizada para el análisis están marcados. Haz click aquí para ver la imagen más grande .
Figura 3. Representante rastros de fluorescencia MPD de una neurona GI (línea verde) y una neurona nonGI (línea naranja). Las células se sometieron a perfusión con glucosa 2,5 mM solución de grabación (G) durante 10 minutos, seguido de un descenso a 0,1 mM G durante 15 min y una volver a 2,5 mm g durante 15 min. En la neurona GI, el porcentaje de cambio desde el valor inicial se incrementó a más del 10% durante el período de perfusión 0,1 mM G (40% promedio de 20 a 25 minutos) y se redujo a menos de la mitad de este aumento en el periodo de reversión mm G 2.5 (15 % promedio de 35 a 40 min). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 4. El porcentaje de neuronas adultas VMH que despolarizar de forma reversible en respuesta a la disminución de la glucosa detectada utilizando imágenes MPD fluorescente. Aexiste relación positiva entre la magnitud de la disminución de la glucosa y el porcentaje de despolarizar las neuronas. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
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Discussion
La clave para ser capaz de estudiar la actividad de las neuronas de ratones adultos es la capacidad de disociar las neuronas sanas. La disociación de las neuronas del hipotálamo de ratones adultos es más difícil en varios pasos clave en el protocolo en comparación con las neuronas de ratones jóvenes. Hemos superar este problema en un número de maneras. Hacer rodajas gruesas 500 micras cerebrales minimiza los daños mecánicos a las neuronas en comparación con los habituales 250-350 micras rodajas utilizados para el tejido cerebral de los ratones más jóvenes. Sin embargo, rodajas más gruesas requieren mayor atención a la perfusión cardiaca y la digestión con papaína de tejido cerebral. Si la sangre se ve en el tejido cerebral, evaluar la precisión y la colocación de la incisión en la aurícula derecha y la aguja que se coloca en el ventrículo izquierdo. La tasa y la cantidad de solución de perfusión de flujo también se pueden ajustar. Una perfusión completa es imperativo, ya que la sangre es tóxico para las neuronas y se traducirá en un menor rendimiento de las neuronas sanas. La digestión con papaína tiene que ser lo suficientemente eficaz para permitirpor trituración suave y fácil liberación de células aisladas de tejido cerebral. Una digestión con papaína ineficiente se sospecha cuando el tejido VMH hunde rápidamente al final de la digestión y cuando más grandes piezas de tejido están presentes durante la segunda trituración. Con buena digestión, las piezas de tejido se apenas detectada por el ojo desnudo durante la tercera trituración. Si la trituración no es suave, la salud neuronal sufrirá. Si se sospecha de una digestión con papaína ineficiente, la concentración de papaína se puede aumentar en 5 U / ml o un nuevo vial de la papaína se puede utilizar. Sin embargo, la concentración de papaína no debe ser aumentado por encima de 30 U / ml, ya que puede poner en peligro la salud neuronal.
La exposición a la BSA es un paso crítico en el protocolo. Después las células se trituraron han sido centrifugada en el gradiente de BSA, tanto la cantidad de neuronas de tiempo están expuestos a BSA y la cantidad de BSA permitió permanecer con el sedimento debe reducirse al mínimo. El sobrenadante y el gradiente de BSAdebe ser aspirado inmediatamente después del período de centrifugación. La aspiración por vacío se puede utilizar para eliminar la mayoría de sobrenadante, pero la última ~ 100 l debe ser retirado manualmente con una pipeta de manera que el sedimento de células no se interrumpe. Otro aspecto importante de la obtención de las neuronas sanas es optimizar la densidad celular. Las neuronas chapada demasiado poco no son tan saludables. Desde tan pocas neuronas se obtienen de cada cerebro de ratón, no es práctico para contar las células antes de la siembra. Durante el tiempo que se gastaría contando, un número significativo de células se adherirá a la plástica y se perdería. El uso de 4 platos por ratón (~ 1 × 10 4 células / ml) como punto de partida, la determinación empírica del número de platos es el enfoque más práctico para lograr la densidad óptima de la neurona. El rendimiento de las neuronas VMH de los ratones de edad avanzada se puede esperar a ser aproximadamente la mitad del rendimiento de los ratones jóvenes. Otras soluciones para mejorar el rendimiento de la neurona consiste en la cuantificación de las neuronas restantesen cada paso de la disociación de protocolo para identificar pasos de desgaste neuronal pesada.
Utilizando el protocolo, las neuronas disociadas saludables pueden sobrevivir en la cultura hasta 2-3 días. Sin embargo, el uso de medios de crecimiento de astrocitos se filtró acondicionado permite que las neuronas sobreviven hasta 2 semanas en cultivo. Medios de crecimiento pueden estar condicionados por incubación en astrocitos primarios confluentes durante la noche. Los astrocitos de la misma cepa de roedores, el sexo, y la región del cerebro deben ser utilizados. Mientras que el uso de medios de astrocitos acondicionado introduce otra variable, esta modificación puede ser necesario para los experimentos alternativos que requieren más tiempo en cultivo. Además, por razones que no están claras, se ha encontrado que la capacidad de detectar la glucosa se pierde fácilmente con la salud neuronal subóptima, a pesar del mantenimiento de las respuestas a otros estímulos, tales como el glutamato. Por lo tanto, el cuidado adicional se debe tomar. Para observar las respuestas neuronales a la disminución de la glucosa, que es imprescindible para evitar contaminatipor bacterias, el moho, las sales, jabón, y la glucosa. Toda la cristalería y los plásticos no estériles deben ser lavadas a fondo con dH 2 O. Además de los contaminantes que viven, detergentes y sales afectarían la integridad y la actividad neuronal. Pequeñas cantidades de glucosa podrían cambiar significativamente las concentraciones de glucosa. Esto altera los resultados desde las neuronas de detección de glucosa son muy sensibles a pequeños cambios en la glucosa extracelular dentro del rango fisiológico nonhyperglycemic de 0,1-2,5 mM 10,11.
Cuando la utilización de formación de imágenes MPD, consistencia y la experimentación de lado a lado entre los grupos de tratamiento son vitales para resultados significativos. Diferentes grupos de tratamiento deben ser probados en el mismo día, si es posible, o al menos en días alternos. Esto reduce al mínimo las posibles variaciones en las preparaciones de cultivo o alícuotas MPD. Además, se encontró la menor variación se produce cuando se realiza la proyección de imagen dentro de las 24 horas de la disociación de la neurona por las razones mencionadas anteriormente. Dado que los resultadosse analizan como un% de despolarizar las neuronas, la precisión y la coherencia en la disección hipotálamo ventromedial y preparación neuronal es también esencial. La población total neuronal HVM cosechado debe ser constante y no debe contener las neuronas de otras regiones. Por lo tanto, el protocolo anterior se debe seguir de cerca y con precisión. Sin embargo, si los experimentos alternativos se van a realizar y el mantenimiento de la población no es una preocupación, golpes de tejido se pueden hacer para aislar las neuronas VMN o ARC.
Los métodos descritos aquí establecer cómo cosechar neuronas VMH sanas de un ratón adulto y cómo utilizar imágenes MPD para estudiar las neuronas de glucosa en la detección. En lugar de ello, los experimentos pueden ser diseñados para examinar VMH las respuestas neuronales a los estímulos distintos de los cambios de glucosa. Por otra parte, el protocolo de disociación puede ser extrapolado a las neuronas de la cosecha de otras regiones del cerebro. Uso de las neuronas de ratones adultos, los estudios ahora se pueden realizar utilizando modelos murinos de enfermedades que se desarrollan o el progreso con la edad. MoreoveR, neuronas adultas saludables se pueden estudiar adicionalmente usando técnicas distintas de la formación de imágenes MPD tales como imágenes de calcio, la electrofisiología, la PCR de una sola célula, inmunocitoquímica o una combinación de estas técnicas.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI | used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
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