Summary
成人老化マウスからの単一ニューロンの活性は、特定の脳領域のニューロンを解離し、蛍光膜電位色素イメージングを用いて研究することができる。グルコースの変化に対する応答を試験することによって、この手法は、成体腹内側視床下部ニューロンのグルコース感受性を研究するために使用することができる。
Abstract
神経活動の研究はしばしば増加結合組織に関連する技術的な問題へのげっ歯類歳未満2ヶ月から神経細胞を使用して実行し、年齢とともに起こる神経細胞の生存率を減少している。ここでは、成人老齢マウスから健康的な視床下部ニューロンの解離のための方法論を説明します。成人老齢マウスからニューロンを研究する能力は、後の年齢で現れる疾患モデルを使用することができ、より正確な発生的に、特定の研究のためかもしれません。単一ニューロンを研究するために電気を使用するのではなく、解離したニューロンの蛍光撮像は、ニューロンの集団の活性を研究するために使用することができる。希望の神経細胞のタイプは、視床下部グルコース感知ニューロンの希である異種のニューロン集団を研究するときに特に便利です。私たちは、茶への回答を研究する大人の腹内側視床下部ニューロンの膜電位色素イメージングを利用細胞外のグルコースのnges。グルコース感知ニューロンは、エネルギーバランスの調節において中心的な役割を果たしていると考えられている。大人のげっ歯類でグルコース感知を研究する能力は機能不全のエネルギーバランスに関連する疾患の優位ので、特に有用である（ 例えば 。肥満）年齢とともに増加。
Introduction
脳は神経内分泌および自律神経系を通じてエネルギー恒常性を調節する。視床下部腹内側部（VMH）は、腹内側核（VMN）と弓状核（ARC）で構成され、エネルギー恒常性の中央制御に重要である。専門的なグルコース感知ニューロンは、VMH内で、神経活動と周辺グルコース恒常1をリンクします。励起されたグルコース（GE）グルコース（GI）ニューロンは、細胞外グルコースが増加するにつれて、それらの活性を低下させる阻害したニューロンが増加;ニューロンを感知するグルコースの2種類がある。 VMHのグルコース感知ニューロンは、一般的に電気生理学またはカルシウム/膜電位感受性色素イメージングを用いて研究している。
電気生理学的パッチクランプ法は、ex vivoで神経活動の研究にゴールドスタンダードであると考えられている。この技術では、ガラスマイクロピペット電極は、高抵抗を介して細胞膜に結合している（GΩ）シール。パッチクランプ電極は、活動電位の周波数（電流クランプ）をリアルタイムで記録またはイオンコンダクタンス（電圧クランプ）は、単一のニューロン内での変更を可能にする。パッチクランプ法は、特定のイオンチャネルコンダクタンスの変化に関する詳細な情報を提供するが、主な欠点は、1つのニューロンが同時に観察され得ることである。それも、具体的な実験的治療を開始する前に、グルコース感知ニューロンからその1が記録されていることを確認するために記録の約30〜45分かかります。また、GI及びGEニューロンは<総VMHニューロン集団の20％を含む。この問題を配合すると、これらのニューロンの識別の細胞マーカーの多くの場合、不足です。従って、明らかである他の技術は、パッチクランプ分析は面倒であることができない貴重な電気的情報、時間がかかり、低い収率を与えるにもかかわらず。
解離VMHニューロンの蛍光イメージングの使用は、HUの研究を可能にする同時にニューロンのndreds。カルシウム感受性色素は、間接的に神経活動の変化に相関する細胞内カルシウムの変化を測定するために使用することができる。膜電位感受性色素、膜電位の変化をモニターするために使用される。細胞膜電位を測定することは、細胞内カルシウムレベルの変化と比較して、ニューロンの活動のより直接的な指標である。さらに、膜電位色素（MPD）イメージングは、潜在的に活動電位発火が変更されておらず、細胞内カルシウムレベルは変化しない可能性があり、膜電位の小さい変化を検出する。これらの蛍光イメージング技術の両方が、幼若マウス2-7からVMHグルコース感知ニューロンを研究するために使用されてきた。結果は、パッチクランプ電気生理学を用いて得られたものよりも詳細であるが、イメージング実験の強度は、それらが同時に必然的にグルコース感知ニューロンの有意な数を含む細胞の大きな集団を評価することである。 MPDイメージングIより均一に全体VMH全体局在している消化管の神経細胞を研究するために特に有用だ、したがって解離しVMH（〜15％GI）で勉強するための十分な集団を提供する。 GEのニューロンが密腹-VMNとARCとVMN間のセルが悪い領域に局在している間は対照的に、彼らはVMH内のニューロン（<1％、GE）のかなりの数を表すものではありません。さらに、単離された神経細胞を研究することによって、星状細胞とシナプス前効果が除去される。生理的接続およびプロセスが失われるので、これは一次ニューロン効果を研究する利点、ならびに不利であることができる。
パッチクランプ電気生理学およびMPD /カルシウム色素イメージングの両方を制限する要因は、若い動物（ 例えば 。マウスやラット<8週齢）を使用する必要がある。これは、加齢に伴って起こる減少し、神経細胞の生存能力と組み合わせて、増加した結合組織に主にある。脳スライスの電気生理学スタッド中新設、結合組織の増加は、それがより困難にニューロンを可視化することができる。増大した結合組織はまた、硬いイメージング研究のための健康なニューロンの大多数を解離することができる。さらに、若い動物からのニューロンは、パッチクランプ記録や撮影のいずれかの間長く生き残る。しかし、若いマウスの使用が主な制限することができます。神経活動および/または神経伝達物質または循環の栄養素に対する応答は、年齢とともに変化する。エネルギーバランスは密接生殖状態に固定されているので、たとえば、エネルギーバランスを調節する視床下部ニューロンは、事前VS思春期後の動物で異なる反応を示すことがある。さらに、多くの疾患は、長期治療を必要とするか、または成人期まで現れていない。このような疾患の主な例は、食事性肥満や2型糖尿病である。グルコース感知ニューロンは、これらの疾患において役割を果たしていると考えられているので、我々が正常MPD撮像expのに使用するために、健康な成人VMHニューロンを培養するための方法論を開発eriments。
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Protocol
1。動物
- すべての手順は、ニュージャージー州の医科歯科大学の機関動物実験委員会によって承認された。
- 12時間のlight/12の時間暗スケジュールでグループの家のオスのC57BL / 6マウスと水と食料を自由摂取のアクセスを許可します。 4-5ヶ月で生け贄に捧げる。マウスの安楽死は麻酔の外科的平面と安楽死の二次形式（横隔膜経由で胸腔内すなわち貫通切開）を用いて行った。これは安楽死にAVMAガイドラインと一致している。
2。灌流液、カバーガラス、ガラスピペット、およびメディアの準備
- 2.5のKClからなる1L灌流溶液を作製、7のMgCl 2、1.25 mMののNaH 2 PO 4、28 mMの炭酸水素ナトリウム、0.5のCaCl 2、7 mMグルコース、1mMのアスコルビン酸、および蒸留のdH 2 Oに3 mMのピルビン酸〜30への浸透圧を調節する約80グラム/ Lスクロースを使用して0ミリオスモル。 95％O 2/5％CO 2でバブリングし、pHを7.4に調整することによって酸素化物。各実験は、灌流溶液約200ミリリットルが必要になります。アリコートは、最大2ヶ月間-20℃で保存することができる。
- グルコース、2.5 mMグルコース、および100 U / mlペニシリン、ストレプトマイシンずに神経基本培地を含有する250ミリリットル神経基本ストックを作る。ショ糖を使用して280ミリオスモルに神経基本株式の浸透圧を調整します。 500ミリリットルは、グルコース、2.5 mMグルコース、および100 U / mlのペニシリンストレプトマイシンずに休止状態メディアを含む株式を休止してください。
- ステリ真空フィルターユニットを使用するだけでなく、株式やフィルター滅菌し、両方をかき混ぜる。ガラス製品や攪拌棒を通してブドウ糖やその他の汚染物質を導入しないように注意してください。光からメディアを保護し、最大2ヶ月間4℃で保存するためにホイルでのボトルを包む。
- 炎4オートクレーブ処理ガラスピペット（9）の先端がチップがないLOしないようにnger鋭い開口直径（〜0.7ミリメートル）、中（〜0.5mm）を、小さな（〜0.3mm）を、（〜0.9ミリメートル）大、中、大である。最大のものはほとんど研磨されるべきであり、最小のものが、その直径の約3分の1にする必要があります。
- 収穫ニューロン、70％エタノールを使用し、ブンゼンバーナーの炎の上を通るきれいな4 25mmのガラス製カバースリップ前日。無菌35mm培養皿に各カバースリップを置き、2ミリリットルのdH 2 O中の滅菌1％のポリ-D-リジンを追加一晩インキュベーター（37℃）で料理を置く。次の日には、無菌のdH 2 O 3倍で洗浄し、カバーグラスは、完全に乾燥できます。
- 1Mの乳酸とグルタ200μlのアリコート75μlのアリコートを加える。-20℃で保存完全に均質性を確保するために、使用前に乳酸とグルタのアリコートを解凍。
- 収穫ニューロンの日には、インスリンなしで1mMの乳酸、0.5mMのグルタ、および2％のB27を含むHibernateの株式からなる新鮮な培養培地30ミリリットルを加える。 VORTEXし、1N NaOHを用いてpHを7.4に調整します。
- 氷上での60mmのガラスシャーレに培養培地の10mlに入れ、氷上に15ミリリットルの円錐管中を2ml入れ、室温で残りのメディアを保つ。
- 収穫ニューロンの日に、1 mMの乳酸、0.5 mMのグルタ、インスリンなしの2％のB27を含む神経基本ストックからなる新鮮な増殖培地25ミリリットルを加える。ボルテックスし、1N NaOHを用いてpHを7.4に調整します。新鮮な増殖培地は、少なくとも30分間、インキュベーター（37℃、5％CO 2）中で平衡化させる。
3。心かん流
- 完全に少なくとも15分間氷上で、95％O 2/5％CO 2 200mlで灌流液および含酸素化合物を解凍。
- アセトン、70％エタノール、およびDH 2 Oでビブラトーム刃を洗うビブラトームに刃を配置します。
- のdH 2 Oでビブラトーム冷却室および灌流チューブをすすぐ冷却室（4℃を埋める）灌流液とし、酸素化し続けています。
- ペントバルビタールナトリウム50 mgのマウスを麻酔/ mlの滅菌水で1:1に希釈し、腹腔内に注射した。マウスが完全に尻尾をつまんで、応答を観察しないで麻酔されていることを確認します。
- 直前に解剖に潅流リザーバとチューブに冷たい灌流液を注ぐ。脳の解剖20〜30ミリリットル保存し、氷の上で酸素化し続けています。チューブを通して上昇し60ミリリットルの注射器から重力流と20gの針が十分な流れを提供しています。気泡が洗い流されるまで、ソリューションを実行することができます。酸素化し続けています。
- マウスの胸郭の上の皮膚をカットバック。胸郭を持ち上げ、慎重に絞りを水平カットを行います。心臓を露出さ武器に向けて胸郭アップを介して2つの横方向の切断を行う。胸郭を抑えるために鉗子を使用してください。
- vascuから洗浄されるように、血液のための出口点を提供するために、右心房にある小さな2ミリメートルのカットを作るLARシステム。
- だけで十分な針開口部を挿入するには、灌流針で左心室を穿刺。片手で所定の位置に針を持ち、もう一方の手で灌流液の流れを開始する。灌流液10〜15mlをした後、血が洗い流されるべきであり、流出物はクリアされます。
4。脳スライスして解剖
- 心臓灌流した後、転送が使用直前に氷上でペトリ皿に冷たい灌流液を酸素化。
- すぐに、首を切る頭蓋骨から脳を除去し、灌流液中に脳を置く。脳を削除するには、次のように、前進皮膚を引っ張って眼窩に向けて頭蓋骨内の正中線のカットを行い、それぞれの目に向けて2横カットを行い、バック頭蓋骨の各側面を引っ張って鉗子を使用して、眼窩間の冠状カットを行い、優しく灌流液中に脳を同軸スパチュラを使用しています。必要に応じて、視索をカットするはさみを使用してください。視床下部に触れないでくださいCエリアと、これは正中隆起と下にある視床下部組織にあまり圧力をかけるため、視索を引っ張らないでください。
- 組織が水没している間に横方向の視床下部に（ブレグマ-3.52 mm）を脳組織の約3ミリメートルの後部と前部をトリミングするかみそりの刃や針を使用してください。脳はまっすぐビブラトームチャックの上に座るしめる前側カットレベルであることが特に重要です。
- 溶液から、残りの脳組織を取り出して、取り付けられた脳切片からソリューションを逃がすために、ろ紙を使用しています。
- ビブラチャックにスーパー接着剤のDABを配置し、脳の大きさに接着剤を広げた。前部面を下にし、視床下部の刃を向けた状態で、接着剤の上に脳組織を置く。余分な接着剤を逃がすとビブラトーム冷却室にチャックを配置。それは脳の周りのバブルアップするように溶液中に置かれたときに多くの接着剤を残さない、十分に注意してください。
- vibratomとE低速（レベル2）と高振幅（レベル9）に設定され、視床下部領域に到達するまで、300〜500程度のスライスを作る。今すぐ前方に、後方から切断薄い100μmのスライスを作る。次のように視覚的な手がかりがある。第三脳室が（-2.70 -2.30ミリメートルブレグマ）非常に小さくなり、視床下部に後部。ブレグマ-2.30 mmと第三脳室は冠状スライス上に背側と腹側のセクションに分かれています。
- 第三脳室のヒューズのセクションでたら、VMH（-1.22 mmまでブレグマ-2.18）の正しい領域に含まれています2500μmのスライスを作る。前部はVMHに、第三脳室は、もはや8（-1.06 -0.82までブレグマ）は、脳の腹側床にはみ出していない。
- 培養培地を含む氷上のペトリ皿にこれらのスライスを転送します。 図1に示すように、VMH（VMN + ARC）を解剖。穏やかに氷上で培養培地2mlにVMH片を転送するためにピペットを使用する。
5。解離と文化
- 室温で氷と場所からVMHを削除します。培養液の4ミリリットルに20 U / mlのパパインを追加します。 34°Cの水浴中で混合し、所定の位置する反転する。消化メディアはもはや曇りになるまで、毎分をチェックしないと転倒混和。無菌フラスコに（0.22μm）で濾過し、消化メディアに組織を移す。
- 30分間34℃で100 rpmで振とうすることによって、組織を消化。
- 消化中に8％ウシ血清アルブミン（BSA）を含有する培地1mlを調製する。コニカルチューブに培養培地およびフィルタを1ml（0.22ミクロン）に80mgのBSAを溶解する。
- コニカルチューブに培養液5mlに転送して、ゆっくりと一度反転させて組織を洗浄します。
- 培養液の6ミリリットルに30μlのDNA分解酵素の酵素を追加し、チュレーションメディアを作るために混ぜます。洗浄培地を吸引し、チュレーションメディアの3ミリリットルを追加します。
- Lの順に粉砕するためにガラスピペットを使用して、最小にargest。優しく10Xを粉末化してから解決するために、より大きな作品のために4分待ちます。新しいコニカルチューブに解離細胞懸濁液を含むトップ2ミリリットルを転送するために第二のピペットを使用してください。 、チュレーションメディアの2ミリリットルを追加します。10倍を粉末化し、3分待ちます。細胞懸濁液にトップ2ミリリットルを転送するために第三のピペットを使用してください。チュレーションメディア、粉薬の5Xの1ミリリットルを加え、2分待ちます。細胞懸濁液にトップ2ミリリットルを転送するために第四のピペットを使用してください。
- 混在しないように注意して、8％のBSAの上に解離した細胞懸濁液レイヤ。 5分間1,000 rpmで遠心分離する。
- 各カバースリップの中央に円柱をクローンX 8ミリメートルオートクレーブさ6ミリメートルを配置します。カバーガラスを完全に乾燥している必要があります。吸引し、440μlの暖かい増殖培地中でペレットを再懸濁。 20分間インキュベーター内で神経細胞のサスペンションと場所をクローニングシリンダーを埋める。
- クローニングシリンダーを取り外して、非常に静かに残骸を洗い流す。各皿のWIを埋める増殖培地2mlの目。いずれの検定が実行される前に、細胞は、少なくとも1時間、回復することができます。
6。 MPDイメージングのための準備
- 121のNaCl、4.7mMのKClを、2のCaCl 2、0.1mMのMgCl 2、1.2mMのMgSO 4を、0.97 mMのK 2 HPO 4、0.23mMのKH 2 PO 4、5mMのNaHCO 3水溶液、および25mMからなる記録液を作るHEPES。 pHを7.4に調整する。
- 所望の低グルコース試験溶液（0.1〜2.0 mMグルコース）を作るためにグルコースを追加する。完全に混合し、400ミリリットルの低グルコース録音ソリューションを予約。 2.5 mMグルコース録音ソリューションを作成し、完全に混合するために、残りの600ミリリットルにグルコースを追加します。
- できるだけ多くの光から染料を保護します。ブルーMPDバイアルに室温緩衝液4mlを加える。完全に混合およびML記録液あたり5μlの染料を追加します。ソリューション間でのピペットで混合して均一な溶液にしてください。色素は、蛍光メートルが含まれています細胞膜を通過することはできません脱分極で細胞に入るolecules、およびクエンチャー分子。アリコートを-20℃で保存し、4日以内に使用してもよい。凍結融解をしないでください複数回。
- 30分間34℃で2.5 mMのグルコース記録液を加えた色素の2ミリリットルで細胞をインキュベートする。乾式加熱ブロックを使用することができる。光から保護してください。
- 2.5 mMおよび0.1 mMの記録·ソリューションに加えて染料でシリンジポンプおよび灌流システムを準備します。 60ミリリットルの注射器からチューブをマニホールドに接続する必要があります。
- 任意のポンプを停止した後、注射器内の圧力上昇を防ぐために、マニホールドでソリューションを切り替える前に、〜のために10秒待ちます。圧力変化は、画像の歪みや、実験中に顕微鏡の焦点の変化を引き起こし、ニューロンを含有する密閉チャンバーへの流体供給を変える。
- マニホールド出力管は、インラインヒーターと密室に接続し、ポリエチレンチューブに接続する必要があります。気泡がクリアされるべきであり、潅流速度は0.5ml /分に設定してください。光から保護してください。
- カバーガラスを乾燥させ、気泡を導入しないことができないように注意しながら、密閉チャンバーに付着ニューロンと25ミリメートルのカバースリップを転送します。スリップが底部片の溝に整列され、記録液の滴が結合する辺に沿って配置され、頂片を静かに適所にカバーグラスを保持するように嵌合されている。
- 記録液で室を埋め、その上に18ミリメートルのカバーガラスを配置し、スポイトを使用しています。静かに所定の位置に小さいカバーグラスを保持するためにチャンバー内に白い輪を装着します。密閉チャンバー内に導入されるの気泡を防止するために、非常にゆっくりと軽く下に押します。
- 2.5 mMのグルコース記録液、ホワイトダウンリング上のプレス用シリンジポンプを起動し、密閉チャンバーに接続します。ゆっくりと白い輪からの圧力を解放し、廃棄物容器に通じる配管に接続します。
- 低明視野光を利用してニューロンを中央に配置します。細胞が光にさらされている時間の量を最小化しよう。
- 灌流システムは、温度の安定化を可能に着目し、均衡を染色する10分間の実行を許可する。
- プライミングながら、をMetaMorphを開き、神経細胞の明視野像（10×）を取る。蛍光画像の3スタック（150ミリ秒、ナローのCy3フィルター、10X）に乗り、5ミクロン以内にフォーカスを決定するために、オートフォーカス機能を使用してください。 10分プライミング期間の終了時に、もう一度ピントを確認。
- 40分間蛍光画像ごとに30秒を記録し始める。 15分間のグルコースを減少させ、最終的に15分間2.5 mMグルコースに戻り、次いで、10分間、2.5 mMグルコースでのベースラインを確立する。溶液は、シリンジポンプを停止させ、10秒待ち、マニホールドのポートをオンにし、別のシリンジポンプを開始することによって変更される。変更は、先に希望の時点BAの発生したマニホールドと細胞との間のタイムラグに基づいsedは。
- 全ての蛍光画像を記録した後、神経細胞の明視野像を取る。
8。 MPDイメージング解析
- 実験の終了時に採取した明視野画像内の各セルの周囲に楕円形の領域を作成することをMetaMorphを使用する。領域は、各ニューロンよりも僅かに大きくする必要があり、セルのダークエッジの外側に1画素にすることができる。 、不健康なオーバーラップ、または破片に近い細胞を選択しないでください。不健康な細胞は、しばしば暗く見える。最後に、バックグラウンドの測定のための細胞も破片地域で5大きな楕円形の領域を作成します。
- 全ての蛍光画像に領域を転送しない動き/シフトが発生していないことを確認するために検査します。 Excelファイル内のすべての画像のために、各地域の蛍光強度を記録するために測定機能を使用してください。をMetamorphでのジャーナルの使用が推奨されます。
- Excelで、各fluoresc 5背景領域の平均を作成するENTイメージ。これは、各時点での平均バックグラウンド値を表す。各画像/時点では、すべての領域の測定値からバックグラウンドを差し引く。バックグラウンドを差し引いた蛍光強度は、強度以下と呼ぶことにする。
- 各セルに対して、分記録の2-8時の平均強度を計算する。これは2.5 mMのグルコースの細胞のベースラインを表している。各処置の両端の2分のバッファは、ノイズを最小化するために使用される。
- 各セルに対して、ベースラインからの変化率（％）を計算します（強度ベースライン）/ベースライン
- 対時間のベースラインからの変化率（％）と折れ線グラフを作成します。
- 分18〜23の間のベースラインからの平均変化率（％）を計算します。分35〜40の間のベースラインからの平均変化率（％）を計算します。画像処理を使用しないとき、ノイズが各セル領域内の強度の平均値、バックグラウンド減算、および5分間oを超える領域強度の平均化によって低減されるR長い。
- 2.5mMのグルコース記録液を2.5mMのグルコース記録溶液と交換した対照実験は、ノイズ閾値を決定するために実行されなければならない。少なくとも6料理や3匹のために18〜23分の間にベースラインからの平均変化率（％）を計算します。これらの値の平均値と標準偏差を決定。
- 平均プラス2標準偏差に対する肯定脱分極応答のしきい値を設定します。平均プラス2標準偏差は、p <0.05の差に相当する。我々の対照実験は、適切な閾値としてベースラインからの10％の変化を明らかにした。
- 各セルに対して、2の基準に基づいて可逆的な脱分極応答を評価する。まず、数分の間にベースラインからの平均変化率（％）18〜23は10％、前のステップで決定された閾値よりも大きくなければなりません。第二に、35〜40分の間にベースラインからの平均変化率（％）は少ないからの平均変化率（％）の半分以下である必要があります分18〜23の間のベースライン。それは、グルタミン酸またはKClでの刺激よりも厳格であることが判明したので、第二の基準を選択した。減少したグルコースに対する反応は可逆的でなくても、不健康なニューロンは、多くの場合、グルタミン酸またはKClでの刺激に応答します。
- 各皿のために、脱分極ニューロンの％を計算します。この値は、異なる治療群のうちのGIニューロンの％を定量するために使用される。
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Representative Results
離れて他の視床下部のエリアからVMHの正確な解剖は一貫性のある結果を得ることが重要である。他のエリアを含めることは、計算された脱分極ニューロンの％を変え、VMHニューロン集団が希薄化する可能性があり。さらに、神経細胞を検出するグルコースは、VMHのグルコース感知ニューロンから機能的にも機構的に異なる可能性が外側視床下部などの他の視床下部の地域で確認されている。 図1は、適切な解剖の正しい解剖学的位置を示している。上記のプロトコルに従って、正しいVMH領域を含有する脳組織を解離させることができる。できない場合があり、各部分集団の全体を維持しながら、さらなる切開は、正確に、VMN及びARCを分離する。 図2は、健康な一例は、VMHニューロンを解離示す。免疫細胞を使用して、我々は我々の準備が> 90％の神経細胞であることを確認した。唯一の健康なニューロンは、データ析のために使用されるべきであるあまりにも多くの不健康なニューロンとSISと料理が廃棄されるべきである。不健康であるニューロンは、多くの場合、大きな程度で、MPDを取る、非常に暗いエッジを有し、かつ不規則な形状を持っている。さらに、ニューロンはほとんどのニューロンは、記録時に互いに接触しないような密度でプレートされるべきである。分析のために選択したニューロンは、他の細胞や残骸に触れてはいけません。
GIニューロンとnonGIニューロンの記録から得られたデータを図3に示す。 10分間のベースラインを得た後、細胞外グルコースが2.5-0.1 mMのより減少した。 GIニューロンは、ベースラインから10％の変化が所定の閾値よりも大きい堅牢な可逆的応答を示す。蛍光の増加は、脱分極を反映している。 GEニューロン過分極応答も検出されるが、周波数は、グルコース感知ニューロンのこのサブタイプに対するこの技術の成功した使用のために（<1％のニューロン）が低すぎる。生理的glucosの範囲電子の減少は、試験し、可逆的に脱分極VMHニューロンの割合を、各ディッシュについて計算した。 図4は、正の関係がグルコースの減少の大きさおよびニューロンの脱分極の割合との間に存在することを示している。これは、成体マウスのニューロンの初代培養に成功し、成体のGI VMHニューロンの研究を可能にするために、蛍光イメージングと組み合わせて使用することができることを実証する。
図1。正しいVMH郭清のためのマーカーと冠状断面。解剖した組織は、他の視床下部のエリアからの最小限の汚染にVMNとARCが含まれています。斜めのカットは、〜からの百分の25から30まで第三脳室の一番下になされるべきであると〜皮質視床下部（ブルー*）を満たしている点と、第三脳室との間に25から30までパーセント（3V）。マウス脳の前頂-1.7ミリメートルに対応するブレグマ-2.8ミリメートルPaxinosとワトソン1998年9から適応。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図2。成体マウスから健康なVMHニューロンの明視野像。この画像は、解離後24時間後に採取し、MPDイメージングに使用されている。だろう（ブルー*）または（赤いx）分析に使用されないであろうがマークされているニューロンのいくつかの例。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
Figure 3。消化管神経細胞（緑色の線）とnonGIニューロン（オレンジライン）の代表的なMPD蛍光トレースします。細胞を15分とAの0.1 mMのGまで減少が続き、10分間2.5 mMグルコース（G）記録溶液で灌流した15分間2.5 mMのGに戻ります。 GIニューロンにおいて、ベースラインからのパーセント変化は0.1 mMのG灌流期間（20〜25分間〜40％の平均）の間に10％以上に増加し、2.5 mMのG反転周期に少ないこの増加の半分以下に減少した（15 35〜40分からの％の平均値）。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。可逆的に蛍光MPDイメージングを用いて検出減少グルコースに反応して脱分極大人のVMHニューロンの割合です。A正の関係は、グルコースの減少とニューロンを脱分極の割合の大きさの間に存在する。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
成体マウスの神経細胞の活動を研究することができることへの鍵は、健康的な神経細胞を解離させる能力である。成体マウスの視床下部ニューロンの解離は幼若マウス由来のニューロンと比較して、プロトコルのいくつかの重要なステップでより困難である。我々は、多くの方法でこの問題を克服している。厚手の500ミクロンの脳スライスを作ることは、若いマウスからの脳組織のために使用される通常250〜350程度のスライスに比べて神経細胞への機械的な損傷を最小限に抑えることができます。しかし、厚いスライスが心臓灌流し、脳組織のパパイン消化に大きな注意を払う必要があります。血液が脳組織で見ている場合は、右心房に切断し、左心室に配置された針の精度および配置を評価する。灌流液の流量及び量も調整することができる。血液が神経細胞に毒性があり、健康的なニューロンの低収量の原因となりますので徹底した灌流が不可欠です。パパイン消化はできるほど効率的である必要があります優しいチュレーションおよび脳組織からの単一細胞の容易な放出のために。より大きな組織片が二チュレーション中に存在する場合にVMH組織は消化の最後に素早く沈み、いつ非効率的なパパイン消化が疑われる。良好な消化を、組織片は、かろうじて第チュレーションの際に裸眼によって検出される。チュレーションが穏やかでない場合には、神経細胞の健康状態が低下します。非効率的なパパイン消化が疑われる場合、パパインの濃度は、5 U / mlまたはパパインの新しいバイアルを使用することができることによって増加させることができる。これは神経細胞の健康を損なう可能性があるので、パパイン濃度が30 U / mlのを超えて増加してはならない。
BSAへの暴露は、プロトコル内の別の重要なステップです。粉砕した細胞は、BSA勾配で遠心分離した後、時間ニューロンの量の両方は、BSAに曝露されるとBSAの量は、ペレットが最小化されるべきで残留させる。上澄みとBSA勾配遠心分離期間の直後に吸引しなければならない。真空吸引は、上清の大部分を除去するために使用することができるが、細胞ペレットを破壊しないように、最後〜100μlをピペットを用いて手動で除去されるべきである。健康なニューロンを得るための別の重要な局面は、細胞密度を最適化することである。メッキニューロンは、あまりにもまばらとして健全ではありません。従って、いくつかのニューロンは、各マウスの脳から得られるので、メッキの前に細胞を計数することは実際的ではない。カウント費やされるであろう時間の間、細胞のかなりの数は、プラスチックに付着すると、失われることになります。出発点として、マウス当たり4皿（〜1×10 4細胞/ ml）を用いて、食器の数の経験的な決定は、最適なニューロン密度を達成するための最も実用的なアプローチである。高齢のマウスからVMHニューロンの収率は、若いマウスからの収量の約半分であると予想することができる。ニューロンの収率を改善するための詳細なトラブルシューティングは、残りのニューロンの定量化を含む解離プロトコルの各ステップで重い神経細胞の消耗のステップを特定する。
我々のプロトコルを使用して、健康的に解離ニューロンは2〜3日までの文化の中で生き残ることができる。しかし、フィルタリングアストロサイト馴化増殖培地を使用することは神経細胞が培養中の2週間まで生存することができます。成長培地で一晩集密初代星状細胞にインキュベートすることによって調整することができる。同じげっ歯類の系統、性別、脳領域からアストロサイトを利用すべきである。星状細胞馴化培地の使用は、別の変数を導入しながら、本変形例は、培養中のより多くの時間を必要とする別の実験のために必要であり得る。また、明らかでない理由のために、我々は、グルコースを感知する能力を容易に、グルタミン酸のような他の刺激に対する応答の維持にもかかわらず、最適以下の神経健康に失われることを見出した。このように、追加の注意が必要です。減少したグルコースに対するニューロンの応答を観察するためには、contaminatiを避けるために不可欠である細菌、カビ、塩、石鹸、およびグルコースによる上。すべてのガラス器具および非滅菌プラスチックは徹底的をdH 2 Oで洗浄する必要があります汚染物質を生体に加えて、界面活性剤および塩が神経細胞の完全性および活性に影響を与えるであろう。グルコースの少量が大幅にグルコース濃度を変更することができます。グルコース感知ニューロンは0.1〜2.5 mMの10,11のnonhyperglycemic生理的範囲内で細胞外グルコースのわずかな変化に非常に敏感であるため、このことは、結果を混乱させるだろう。
MPDイメージング、一貫性および治療群間のサイドバイサイド実験を利用するとき、意味のある結果を得るために不可欠である。可能か、少なくとも日おきにした場合、異なる治療群は、同じ日にテストする必要があります。これは、培養の準備やMPDアリコート中の可能な変更を最小限に抑えます。さらに、我々は撮影を、上記の理由のためにニューロンの解離の24時間以内に行われた場合、少なくとも変動が生じ発見。結果からニューロンを脱分極の％として解析し、VMH解剖し、神経準備の正確性と一貫性も不可欠です。収穫全体のVMHニューロン集団は一定でなければならず、他の領域からの神経細胞を含んではならない。したがって、上記のプロトコルは、密接にかつ正確に従うべきである。別の実験が行われるべきであり、集団の維持が問題でない場合は、組織パンチはVMN又はARCニューロンを単離することができる。
ここに記載されている方法は、成体マウスから健康的なVMHニューロンを収穫する方法を確立し、どのようにグルコース感知ニューロンを研究するMPDイメージングを使用します。その代わりに、実験は、グルコース変化以外の刺激にVMHニューロンの応答を調べるために設計することができる。あるいは、解離プロトコルは他の脳領域から収穫ニューロンに外挿することができる。成体マウス由来のニューロンを用いて、研究は現在、加齢に伴って発症または進行のマウス疾患モデルを用いて行うことができる。 Moreoverは、健康な成人ニューロンはさらに、カルシウムイメージング、電気生理学、単一細胞PCR、免疫細胞化学またはこれらの技術の組み合わせのようなMPD撮像以外の技術を用いて研究することができる。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
NIHのR01 DK55619、NIHのR21をCA139063
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI | used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
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