Membranpotensialet Dye Imaging av ventromedial Hypothalamus nerveceller fra voksne mus for å studere Glukose Sensing

Summary

Aktiviteten av enkeltnerveceller fra voksen-alderen mus kan studeres ved dissociating nevroner fra bestemte områder av hjernen og bruker fluoriserende membranpotensialet fargestoff bildebehandling. Ved å teste reaksjoner på endringer i glukose, kan denne teknikken brukes til å studere glukose følsomheten av voksne ventromedial hypothalamus nevroner.

Abstract

Studier av neuronal aktivitet er ofte utført ved hjelp av nerveceller fra gnagere mindre enn 2 måneders alder på grunn av tekniske problemer forbundet med økende bindevev og redusert neuronal levedyktighet som oppstår med alderen. Her beskriver vi en metodikk for dissosiasjon av sunne hypothalamus nevroner fra voksen-alderen mus. Evnen til å studere neuroner fra voksne aldrende mus gjør det mulig å bruke sykdomsmodeller som manifesterer på et senere alder og kan være mer nøyaktige utviklingsmessig for visse studier. Fluorescens avbildning av dissosierte nevroner kan brukes til å studere aktiviteten av en populasjon av nerveceller, i motsetning til ved bruk av elektro å studere et enkelt neuron. Dette er spesielt nyttig når man studerer en heterogen neuronal populasjon hvor den ønskede neuronal type er sjelden så som for hypothalamus glukose avføling neuroner. Vi utnyttet membranpotensialet fargestoff avbildning av voksne ventromedial hypothalamus nevroner å studere sine svar til changes i ekstracellulære glukose. Glukose sensing nevroner antas å spille en rolle i sentral regulering av energibalansen. Evnen til å studere glukose avføling hos voksne gnagere er spesielt nyttig ettersom overvekt av sykdommer relatert til uhensiktsmessig energibalanse (fedme f.eks.) Øker med alderen.

Introduction

Hjernen regulerer energi homeostase gjennom nevroendokrine og det autonome nervesystem. Den ventromediale hypotalamus (VMH), som består av den ventromediale kjernen (VMN) og den bueformede kjerne (ARC), er viktig for den sentrale regulering av energihomeostase. Specialized glukose sensing nevroner, i VMH, link neuronal aktivitet og perifert glukose homeostase ^en. Det finnes to typer av glukose sensing nevroner, glukose opphisset (GE) nevroner øke, mens glukose hemmet (GI) nevroner redusere sin aktivitet som ekstracellulære glukose øker. VMH glukose sensing nevroner er generelt studert ved hjelp av elektrofysiologi eller kalsium / membranpotensialet sensitive fargestoff bildebehandling.

Den elektro patch clamp teknikk anses å være gullstandarden i studiet av ex vivo neuronal aktivitet. I denne teknikken blir et glass mikropipette elektrode koblet til cellemembranen via et høy motstand(GΩ) segl. Patch klemme elektroder tillate sanntidsopptak av aksjonspotensial frekvens (strømtang) eller ion konduktans (spenning klemme) endrer innenfor en enkelt nervecelle. Mens patch clamp teknikk gir detaljert informasjon vedrørende endringer i spesifikke ion kanals konduktans, er en stor ulempe at bare én nervecelle kan observeres på en gang. Det tar ca 30-45 min av opptak for å kontrollere at man tar opp fra en glukosesensor nevron før selv begynner en bestemt eksperimentell behandling. Dessuten, GI og GE neuroner utgjør <20% av den totale VMH neuronal populasjon. Compounding dette problemet er mangelen, i mange tilfeller av en identifisering cellular markør for disse nevronene. Således er det klart at til tross for å gi verdifull elektrisk informasjon som andre teknikker kan ikke, er arbeidskrevende patch clamp-analyse, tidkrevende og lavt utbytte.

Bruken av fluorescens avbildning av dissosierte VMH nevroner tillater studiet av hundreds av nevroner samtidig. Kalsium følsomme fargestoffer som kan brukes til å måle intracellulære kalsium endringer, som indirekte korrelere endringer i neuronal aktivitet. Membranpotensialet følsomme fargestoffer som brukes til å overvåke membran mulige endringer. Måling av cellemembranpotensialet er en mer direkte indeks av neuronal aktivitet sammenlignet med endringer i den intracellulære kalsiumnivåer. Videre membranpotensialet fargestoff (MPD) bildebehandling oppdager potensielt mindre endringer i membranpotensialet der aksjonspotensial avfyring ikke er endret og den intracellulære kalsiumnivåer kan ikke endres. Begge disse fluorescens imaging teknikker har blitt brukt til å studere VMH glukose sensing nevroner fra juvenile mus ^2-7. Selv om resultatene er mindre detaljert enn de som oppnås med patch clamp elektrofysiologi, er styrken av bildebehandlings eksperimenter at de samtidig evaluere en stor populasjon av celler som uunngåelig inneholder et betydelig antall glukosefølenerveceller. MPD bildebehandling ier spesielt nyttig for å studere GI nevroner som er mer jevnt lokalisert i hele VMH, og dermed gi en tilstrekkelig befolkning for å studere i dissosiert VMH (~ 15% GI). I kontrast, mens GE neuroner er tett lokalisert til ventrolateral-VMN og celle dårlig området mellom ARC og VMN, har ikke gitt et betydelig antall neuroner innenfor VMH (<1% GE). Dessuten, ved å studere isolerte neuroner, er astrocytic og presynaptiske virkninger elimineres. Dette kan være en fordel i å studere første orden neuron effekter, så vel som en ulempe, siden fysiologiske forbindelser og prosesser går tapt.

En begrensende faktor i både patch clamp elektrofysiologi og MPD / kalsium fargestoff bildebehandling er behovet for å bruke yngre dyr (f.eks. Mus eller rotter <8 ukers alder). Dette er hovedsakelig på grunn av økt bindevev i kombinasjon med redusert neuronal levedyktighet som oppstår med tiden. I hjernen-slice elektrofysiologi studies, gir økt bindevev det mer vanskelig å visualisere de nervecellene. Økt bindevevet gjør det også vanskeligere å dissosiere et stort antall friske nerveceller for bildediagnostikk. Videre nerveceller fra yngre dyr overlever lenger under enten patch clamp opptak eller bildebehandling. Imidlertid kan bruk av unge mus være en vesentlig begrensning. Neuronal aktivitet og / eller svar på nevrotransmittere eller sirkulerende næringsstoffer endrer seg med alderen. For eksempel, siden energibalansen er nært knyttet til reproduktiv status, kan de hypothalamus nevroner som regulerer energibalansen reagerer forskjellig i pre-vs postpubescent dyr. I tillegg er mange sykdommer krever langvarig behandling eller ikke manifest til voksen alder. Prime eksempler på slike sykdommer er kosten fedme eller type 2 diabetes mellitus. Siden glukose sensing nevroner antas å spille en rolle i disse sykdommene vi utviklet en metode for å lykkes med dyrking av friske voksne VMH nevroner for bruk i MPD bildebehandling experiments.

Protocol

En. Dyr

1. Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Medicine and Dentistry of New Jersey.
2. Gruppe huset mannlige C57BL / 6 mus på en 12 timers light/12 hr mørk tidsplan og la ad libitum tilgang til vann og mat. Blot på 4-5 måneder gammel. Avliving av musene ble utført ved hjelp av kirurgiske planet av anestesi, og en sekundær form for avlivning (dvs. gjennomtrengende innsnitt inn i brysthulen via membranen). Dette er konsistent med de AVMA Retningslinjer for aktiv dødshjelp.

2. Utarbeidelse av Perfusjons Solution, Dekk, Glass Pipettes, og Media

1. Gjør 1L perfusjon løsning bestående av 2,5 mM KCl, 7 mM MgCl _2, 1,25 mM NaH ₂ PO _4, 28 mM NaHCO _3, 0,5 mM CaCl _2, 7 mM glukose, 1 mM askorbat, og 3 mM pyruvat i destillert dH ₂ O. Juster osmolaritet til ~ 300 mOsm bruk av ca 80 g / l sukrose. Oksygenat ved å boble med 95% _O2 / 5% _CO2, og justere pH til 7,4. Hvert eksperiment vil kreve ca 200 ml av perfusjon løsning. Aliquoter kan lagres ved -20 ° C i opp til 2 måneder.
2. Lag 250 ml Neurobasal lager innehold Neurobasal medier uten glukose, 2,5 mM glukose, og 100 U / ml penicillin-streptomycin. Juster osmolaritet av Neurobasal lager til 280 mOsm bruker sukrose. Gjør 500 ml Hibernate lager inneholder Hibernate-A media uten glukose, 2,5 mM glukose, og 100 U / ml penicillin streptomycin.
3. Rør både aksjer vel og filter-sterilisere med Stericup vakuum filter enheter. Vær forsiktig med å innføre glukose eller andre forurensninger gjennom glass eller oppstuss barer. Pakk flaskene i folie for å beskytte media fra lys og oppbevar ved 4 ° C i opptil to måneder.
4. Flamme tips av fire autoklaveres glass pipetter (9 in) slik at tips er no longer skarpe og åpningen diameter er store (~ 0,9 mm), medium-large (~ 0,7 mm), middels (~ 0,5 mm), og liten (~ 0,3 mm). Den største skal være knapt polert og den minste bør være om lag en tredjedel av det diameter.
5. På dagen før høsting neuroner, rene fire 25 mm glass dekkglass ved bruk av 70% etanol, og som passerer over en Bunsen-brenner flammen. Plasser hver dekkglass i en steril 35 mm kultur form og legg i 2 ml sterilt 1% poly-D-lysin i dH ₂ O. Sett serviset i en inkubator (37 ° C) over natten. Den neste dagen, vask med sterilt dH ₂ O 3x og la Dekk tørke helt.
6. Lag 75 pl aliquoter av 1 M melkesyre og 200 pl aliquoter av Glutamax, lagre ved -20 ° C. Fullt tine alikvoter av melkesyre og Glutamax før bruk for å sikre homogenitet.
7. På dagen for høsting nevroner, lage 30 ml frisk kultur media består av Hibernate-En aksje som inneholder 1mm melkesyre, 0,5 mM Glutamax, og 2% B27 uten insulin. Vortex og juster pH til 7,4 ved anvendelse av 1 N NaOH.
8. Sett 10 ml vekstmedium i en 60 mm glasspetriskål på is, satt 2 ml i en 15 ml konisk rør på is og holder de gjenværende medier ved romtemperatur.
9. På dagen for høsting neuroner, blir 25 ml av frisk vekstmateriale som består av Neurobasal lager inneholdende 1 mM melkesyre, 0,5 mM Glutamax, og 2% B27 uten insulin. Vortex og juster pH til 7,4 ved anvendelse av 1 N NaOH. Tillat den friske vekstmedia for å ekvilibrere i en inkubator (37 ° C, 5% _CO2) i minst 30 min.

Tre. Cardiac Perfusjons

1. Fullt tine 200 ml perfusjon løsning og oksygenat med 95% _O2 / 5% _CO2 på is i minst 15 min.
2. Vask en vibratome blad med aceton, 70% etanol, og dH ₂ O. Plasser bladet i vibratome.
3. Skyll vibratome kjølekammer og Perfusjonsslangen med dH ₂ O. Fyll kjølekammer (4 ° C) Med perfusjon løsning, og fortsette å oksygenere.
4. Anesthetize en mus med pentobarbital natrium 50 mg / ml, fortynnet 1:01 med sterilt vann, injisert intraperitonealt. Kontroller at musen er fullt bedøvet ved å knipe halen og observere ingen respons.
5. Hell kaldt perfusjon løsning i perfusjons reservoar og rør like før disseksjon. Spar 20-30 ml for hjernen disseksjon og fortsette å surstoff på is. Gravitasjonsstrømning fra en hevet 60 ml sprøyte gjennom rør og en 20 G nål gir tilstrekkelig strømning. Tillat løsning å kjøre inntil luftboblene blir vasket ut. Fortsett å surstoff.
6. Skjær tilbake huden over brystkasse av musen. Løft brystkasse og nøye lage en horisontal kutt gjennom membranen. Lag to laterale kutt gjennom brystkasse opp mot armene for å blottlegge hjertet. Bruk pinsett til å holde tilbake brystkasse.
7. Foreta en liten 2 mm snitt i høyre forkammer for å gi en utgang for blod å bli vasket ut av VascuLar system.
8. Punktering venstre ventrikkel med perfusjon nål, akkurat nok til å sette nålen åpningen. Holde nålen på plass med en hånd og starte strømmen av perfusjons-løsning med den andre hånden. Etter 10 til 15 ml av perfusjon løsning, bør blodet bli vasket ut og avløpsvannet tømmes.

4. Brain Kutting og Dissection

1. Etter hjerte perfusjon, oksygenoverføring kald perfusjon løsning til en petriskål på is like før bruk.
2. Raskt halshogge, fjerne hjernen fra skallen og plassere hjernen til perfusjon løsning. For å fjerne hjernen: Trekk huden fremover må en midtlinjen kutt i skallen mot øyehulene, lage to laterale kutt mot hvert øye, bruke tang til å trekke tilbake hver side av hodeskallen, foreta en koronale kutt mellom øyehulene, og bruk en slikkepott til å forsiktig overtale hjernen ut i perfusjon løsning. Bruk saks til å klippe de optiske traktater om nødvendig. Gjør du ikke berører hypothalamic området og ikke trekke de optiske traktater fordi dette legger for mye press på median eminense og underliggende hypothalamus vev.
3. Bruk et barberblad og nål til lateralt trimme hjernevevet ca 3 mm posterior og anterior til hypothalamus mens vevet er under vann (bregma -3,52 mm). Det er spesielt viktig for den fremre innsving å være nivå slik at hjernen skal sitte rett på vibratome chuck.
4. Fjern det gjenværende hjernevev fra løsningen og bruker filterpapir for å transportere bort væske fra monterte hjerne-delen.
5. Plasser en skvett av superlim på en vibratome chuck og spre limet til størrelsen på hjernen. Sett hjernevev oppå limet med den fremre side som vender ned og hypotalamus som vender mot sagbladet. Wick bort overflødig lim og legg chucken inn vibratome kjølekammer. Vær forsiktig for ikke å la mye lim som det vil boble opp rundt hjernen når de plasseres i løsning.
6. Med Vibratome satt til en langsom hastighet (nivå 2) og høy amplitude (nivå 9), gjør 300-500 mikrometer skiver inntil nå hypothalamus området. Nå gjør tynne 100 mikrometer skiver skjærende fra bakre til fremre. De visuelle signaler er som følger. Posterior til hypothalamus den tredje ventrikkel vil være svært liten (bregma -2,70 til -2,30 mm). På bregma -2,30 mm, er den tredje ventrikkel separert i dorsal og ventral seksjoner på koronale skive.
7. Når deler av den tredje ventrikkel sikring, lage to 500 mikrometer skiver som vil inneholde den riktige delen av VMH (bregma -2,18 til -1,22 mm). Anterior til VMH, den tredje ventrikkel ikke lenger strekker til ventral etasje i hjernen (bregma -1,06 til -0,82) ^8.
8. Overfør disse skiver til petriskålen på is inneholdende dyrkningsmediet. Dissekere VMH (VMN + ARC), som vist i figur 1. Bruk en pipette til å forsiktig overføre VMH stykker i 2 ml kulturmedier på is.

5. Dissosiasjon og kultur

1. Fjern VMH fra isen og legg ved romtemperatur. Tilsett 20 U / ml papain til 4 ml av vekstmedium. Snu å mikse og plass i en 34 ° C vannbad. Kontroller og bland ved inversjon hvert minutt inntil fordøyelsen medier er ikke lenger skyet. Filter (0,22 um) til en steril kolbe og overføre vevet til fordøyelse media.
2. Fordøy vevet ved risting ved 100 rpm ved 34 ° C i 30 min.
3. Tilbered en ml av media inneholdende 8% bovint serumalbumin (BSA) i løpet av fordøyelsen. Oppløs 80 mg BSA i 1 ml kulturmedier og filter (0,22 um) til et konisk rør.
4. Vask vevet ved å overføre til 5 ml vekstmedium i et konisk rør og langsomt inverterende gang.
5. Tilsett 30 mL DNase enzym til 6 ml av vekstmedium og blandes for å gjøre Triturerings media. Suge vaske media og tilsett 3 ml utgnidning media.
6. Bruk glass pipetter for å Triturer i størrelsesorden largest til minste. Forsiktig Triturer 10x og deretter vente 4 min for større biter å bosette. Bruk andre pipette for å overføre de beste 2 ml inneholdende en dissosierte cellesuspensjon i et nytt kjegleformet rør. Legg 2 ml av Triturerings media, Triturer 10x og vent 3 min. Bruk den tredje pipetten for å overføre de beste 2 ml av cellesuspensjonen. Legg en ml utgnidning media, Triturer 5x og vent 2 min. Bruk fjerde pipette for å overføre den øverste 2ml til cellesuspensjonen.
7. Lag den dissociated cellesuspensjon på toppen av 8% BSA, være forsiktig med å blande. Sentrifuger ved 1000 rpm i 5 min.
8. Plasser autoklaveres 6 mm x 8 mm kloningssylindere i midten av hver dekkglass. Dekk må være helt tørt. Aspirer og resuspender pelleten i 440 pl varmt vekstmedier. Fyll kloning sylindere med nevronale fjæring og plass i inkubatoren i 20 min.
9. Fjern kloning sylindere og svært forsiktig vaske bort rusk. Fyll hver tallerken with 2 ml av vekstmediet. Tillat celler for å gjenopprette i minst 1 time før eventuelle forsøk ble utført under.

6. Forberedelse for MPD Imaging

1. Lag opptaks oppløsning bestående av 121 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 0.1 mM _MgCl2, 1,2 mM _MgSo4, 0,97 mM K ₂ HPO _4, 0,23 mM KH PO _{2 4,} 5 mM _NaHCO3 og 25 mM HEPES. Juster pH-verdien til 7,4.
2. Til glukose for å gjøre den ønskede lave glukose testoppløsningen (0,1 til 2,0 mM glukose). Bland godt og reserverer 400 ml lavt glukoseopptak løsning. Legg glukose til de gjenværende 600 ml for å gjøre 2,5 mM glukose-opptak løsning og bland grundig.
3. Beskytt farge fra lys så mye som mulig. Tilsett 4 ml romtemperatur buffer til en blå MPD ampulle. Bland godt og tilsett 5 mL fargestoff per ml opptaksløsning. Hold oppløsningen ved å blande homogent med pipette i mellom-løsninger. Fargestoffet inneholder fluorescerende molecules, som angir celler med depolarisering, og drikk molekyler, kan som ikke krysse cellemembranen. Aliquoter kan lagres ved -20 ° C og brukt i løpet av 4 dager. Ikke fryse-tine mer enn én gang.
4. Inkuber cellene i 2 ml 2,5 mM glukose opptak løsning pluss fargebad ved 34 ° C i 30 min. En tørr varmeblokk kan benyttes. Beskytt mot lys.
5. Forbered sprøytepumper og perfusjon system med 2,5 mm og 0,1 mm Utskrifts løsninger pluss fargestoff. Tubing fra 60 ml sprøyter bør være koblet til en manifold.
6. Etter å ha stoppet noen pumpe, vente på ~ 10 sek før du bytter løsninger på manifolden for å hindre trykkoppbygging i sprøyten. Trykkendringer endre væskestrømmen til lukket kammer inneholdende neuroner, forårsaker endringer i mikroskop fokus i løpet av eksperimentet og forvrengning av bilder.
7. Manifolden utgangs Slangen bør være koblet til en in-line varmer og deretter polyetylenrør, som kobles til et lukket kammer. Boblene skal være ryddet og perfusjon renten bør settes til 0,5 ml / min. Beskytt mot lys.
8. Overfør 25 mm dekkglass med heft nevroner til lukket kammer, være forsiktig med å la dekkglass for å tørke og ikke å innføre luftbobler. Kupong er justert i sporene i bunnstykket, er et par dråper opptaksløsning plassert langs sidene, og overdelen er forsiktig montert for å holde dekkglass på plass.
9. Bruk en dropper å fylle kammeret med opptaksløsning og deretter plassere en 18 mm dekkglass på toppen. Passe forsiktig hvit ring inn i kammeret for å holde den mindre dekkglass på plass. Trykk ned meget langsomt og forsiktig for å hindre at luftbobler fra å bli introdusert inn i det lukkede kammer.
10. Start sprøytepumpe for 2,5 mM glukose opptaksløsning, trykk ned på den hvite ringen, og koble til lukket kammer. Langsomt frigjøre trykket fra hvit ring og kobles til den slange som fører til en avfallsbeholder.

e "> 7. MPD Imaging

1. Sentrer nervecellene ved hjelp av lav lyse felt lys. Prøv å minimere mengden av tid cellene blir utsatt for lys.
2. Tillat perfusjon system for å gå i 10 min for å tillate stabilisering av temperaturen, fokus og fargestoff likevekt.
3. Mens grunning, åpne MetaMorph programmet og ta et lyst felt image (10X) av nervecellene. Bruk Autofokus-funksjonen til å ta tre stabler av fluorescerende bilder (150 msek, Narrow Cy3 filter, 10X) og bestemme fokus innen 5 mikrometer. Ved slutten av den 10 min fylleperioden, sjekk fokus på nytt.
4. Begynn å spille fluorescerende bilder hver 30 sek for 40 min. Etablere en grunnlinje på 2,5 mM glukose i 10 min, og deretter redusere glukose i 15 min, og til slutt tilbake til 2,5 mM glukose i 15 min. Løsningene er endret ved å stoppe en sprøytepumpe, venter 10 sek, snu en port på manifolden, og starter en annen sprøytepumpe. Endringer skal skje i forkant av ønskede tidspunkter based på etterslep mellom manifolden og celler.
5. Etter innspillingen alle fluorescerende bilder, ta en lyse felt bilde av nervecellene.

8. MPD Imaging Analysis

1. Bruk MetaMorph å skape ovale områder rundt hver celle i den lyse feltbilde tatt ved slutten av forsøket. Regioner bør være litt større enn hver neuron, og kan gjøres en piksel utenfor cellens mørk kant. Ikke velg celler som er usunn, overlapping, eller nær rusk. Usunne celler ofte virker mørke. Til slutt, lage fem store ovale regioner i områder med ingen celler eller rusk for bakgrunnsmålinger.
2. Overfør regionene til alle fluorescerende bilder og inspisere for å kontrollere at ingen bevegelse / skiftet har skjedd. Bruk Mål funksjon for å ta fluorescens intensiteten i hver region for alle bildene i en Excel-fil. Bruken av tidsskrifter i Metamorph anbefales.
3. I Excel, opprette et gjennomsnitt av de fem bakgrunns regionene for hver fluorescerendeent bilde. Dette representerer den gjennomsnittsbakgrunnsverdi på hvert tidspunkt. For hvert bilde / tidspunkt, trekke bakgrunnen fra alle regionens målinger. Bakgrunnen-trekkes fluorescensintensitet vil bli referert til som Intensitet heretter.
4. For hver celle, beregne gjennomsnittlig intensitet under minutter 2-8 av opptaket. Dette representerer Baseline av cellen i 2,5 mM glukose. En 2 minutters buffer på begge ender av hver behandling blir brukt til å minimalisere støy.
5. For hver celle, beregne prosentvis endring fra baseline: (Intensitet-Baseline) / Baseline
6. Lag en linje graf med prosentvis endring fra baseline vs tid.
7. Beregne gjennomsnittlig prosentvis endring fra baseline i løpet av minutter 18-23. Beregne gjennomsnittlig prosentvis endring fra baseline i løpet av minutter 35-40. Mens bildebehandlingen ikke blir brukt, blir støy redusert ved midling av intensiteten i hver celle region, bakgrunn subtraksjon, og midlingen av region intensitet over 5 min or lenger.
8. Kontroll eksperimenter hvor 2,5 mM glukose-opptak oppløsningen blir utvekslet med 2,5 mM glukose opptak løsning må utføres for å bestemme støyterskelen. Beregne gjennomsnittlig prosentvis endring fra baseline i løpet av minutter 18-23 i minst seks retter og tre mus. Bestem gjennomsnitt og standardavvik av disse verdiene.
9. Sett terskelen for et positivt depolarisering respons på middelverdien pluss to standardavvik. Gjennomsnittet pluss to standardavvik tilsvarer en forskjell med p <0,05. Våre kontrolleksperimenter viste en 10% endring fra baseline som den aktuelle terskelverdi.
10. For hver celle, vurdere den reversible depolarisering respons basert på to kriterier. For det første må den gjennomsnittlige prosent forandring fra grunnlinje i løpet av 18 til 23 minutter være større enn 10%, terskelen bestemt i det foregående trinnet. For det andre må den gjennomsnittlige prosent endring fra baseline i løpet av minutter 35-40 være mindre enn halvparten av gjennomsnittlig prosentvis endring frabaseline i løpet av minutter 18-23. Det andre kriterium ble valgt fordi det ble funnet å være mer kritisk enn stimulering med glutamat eller KCl. Usunne nevroner ofte svare på stimulering med glutamat eller KCl selv om deres svar på redusert glukose er ikke reversibel.
11. For hver rett, beregne% av depolariserte nevroner. Denne verdien brukes til å kvantifisere% av GI nevroner mellom ulike behandlingsgruppene.

Representative Results

Den nøyaktige disseksjon av VMH bort fra andre hypothalamus områder som er viktig for å oppnå konsistente resultater. Innlemmelsen av andre områder kan fortynne VMH neuronal populasjon, endring av% av depolariserte neuroner beregnet. Videre har glukosesensor neuroner blitt identifisert i andre hypothalamus regioner, slik som den laterale hypothalamus, som kan være forskjellig funksjonelt og mechanistically fra VMH glukose avføling neuroner. Figur 1 illustrerer de riktige anatomiske områder for riktig disseksjon. Etter protokollen ovenfor, kan hjernevev som inneholder den korrekte VMH-regionen bli dissosiert. Videre disseksjon til nettopp skille VMN og ARC, og samtidig opprettholde helheten i hver undergruppe, ikke kan være mulig. Figur 2 viser et eksempel på sunn dissociated VMH nevroner. Bruke immunocytochemistry, fikk vi bekreftet at våre forberedelser er> 90% nevronale. Kun friske nerveceller bør brukes for data analysesis og retter med for mange usunne nevroner skal kastes. Neuroner som er usunn ofte har meget mørke kanter, ta opp MPD i større grad, og ha uregelmessig form. I tillegg bør neuroner bli belagt med en tetthet slik at de fleste neuroner ikke berører hverandre under opptak. Nevroner valgt for analyse bør ikke berøre andre celler eller rusk.

Data innhentet fra opptak av en GI neuron og en nonGI neuron er vist i figur 3.. Etter å ha fått en baseline for 10 min, ble den ekstracellulære glukose redusert 2,5 til 0,1 mM. GI neuron viser en robust reversible reaksjon som er større enn den forutbestemte terskel på 10% endring fra grunnlinje. Økningen i fluorescens reflekterer depolarisering. Mens GE nevron hyperpolarization svar er også oppdaget, er frekvensen for lav (<1% nevroner) for vellykket bruk av denne teknikken på denne subtype av glukose sensing nervecellen. En rekke fysiologiske gluke reduksjonene ble testet, og prosentandelen av VMH nevroner som reversibelt depolarisert ble beregnet for hver tallerken. Figur 4 viser at en positiv sammenheng mellom størrelsen av glukose reduseres og andelen av depolariserende neuroner. Dette viser at vellykket primærkultur av voksne murine nevroner kan anvendes i forbindelse med fluorescens-avbildning for å tillate undersøkelse av voksne VMH GI neuroner.

Figur 1. Koronale delen med markører for korrekt VMH disseksjon. Den dissekert vev inneholder VMN og ARC med minimal forurensning fra andre hypothalamus områder. Diagonale fresing fra ~ 25 til 30% under toppen av den tredje ventrikkel til ~ 25 til 30% mellom det punkt hvor den møter cortex hypothalamus området (blått) og den tredje ventrikkel(3 V). Tilpasset fra bregma -2,8 mm Paxinos og Watson 1998 ^9, tilsvarende mus Brain bregma-1.7mm. Klikk her for å se større bilde .

Figur 2. Lysfelt bilde av sunne VMH neuroner fra voksne mus. Dette bildet ble tatt 24 timer etter dissosiasjon og har vært brukt for MPD avbildning. Noen få eksempler på nevroner som ville (blå *) eller ville ikke (rød x) brukes for analyse er merket. Klikk her for å se større bilde .

Figure tre. Representative MPD fluorescens spor av en GI neuron (grønn linje) og en nonGI neuron (oransje linje). Celler ble perfundert med 2,5 mM glukose (G)-opptak oppløsningen i 10 minutter, etterfulgt av en reduksjon til 0,1 mM G i 15 minutter og en tilbake til 2,5 mM G i 15 min. I GI nervecellen, prosentvis endring fra baseline økt til over 10% i løpet av 0,1 mm G perfusjon periode (40% i gjennomsnitt 20-25 min) og den falt til mindre enn halvparten av denne økningen i 2,5 mm G reversering periode (15 % gjennomsnittlig 35-40 min). Klikk her for å se større bilde .

Figur 4. Andelen av voksne VMH nevroner som reversibelt depolarize i respons til redusert glukose oppdaget ved hjelp av fluorescerende MPD bildebehandling. Apositiv sammenheng mellom omfanget av glukose nedgang og prosentandelen av depolariserende nevroner. Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Nøkkelen til å være i stand til å studere aktiviteten av neuroner fra voksne mus er evnen til å dissosiere friske nerveceller. Dissosiasjon av hypothalamus neuroner fra voksne mus er mer vanskelig i flere viktige trinnene i protokollen i forhold til nerveceller fra unge mus. Vi har overvunnet dette problem på en rekke måter. Making tykke 500 mikrometer hjernen skiver minimerer mekanisk skade på nervecellene i forhold til de vanlige 250-350 mikrometer skiver som brukes for hjernevev fra yngre mus. Men tykkere skiver krever større oppmerksomhet til hjerte perfusjon og papain fordøyelsen av hjernevev. Dersom blod blir sett på hjernevev, evaluere presisjon og plassering av snittet i høyre atrium og nålen plassert i venstre ventrikkel. Strømningshastigheten og mengden av perfusjons-løsning kan også justeres. En grundig perfusjon er viktig ettersom blod er toksisk for nevroner og vil resultere i et lavere utbytte av friske nerveceller. Papain fordøyelse må være effektiv nok til å tillatefor skånsom trituration og enkel frigjøring av enkeltceller fra hjernevev. En ineffektiv papain fordøyelse mistenkes når VMH vevet synker raskt ved slutten av fordøyelse og når større vev stykker er til stede under det andre triturering. Med god fordøyelse, blir vev-stykker knapt påvises med det blotte øye i løpet av tredje triturering. Hvis trituration er ikke mild, vil nevronale helse lider. Hvis det er mistanke om en ineffektiv papain fordøyelsen, kan konsentrasjonen av papain økes med 5 U / ml, eller en ny beholder med papain kan brukes. Imidlertid bør det papain konsentrasjonen ikke økes over 30 U / ml, siden dette kan svekke neuronal helse.

Eksponeringen mot BSA er et annet kritisk punkt i protokollen. Etter utgnidd cellene er blitt sentrifugert på BSA gradient, vil både mengden av tids neuroner blir utsatt for BSA, og mengden av BSA tillates å forbli med pellet bør minimaliseres. Supernatanten og BSA gradientskal suges umiddelbart etter sentrifuge periode. Vakuum kan anvendes for å fjerne det meste av supernatanten, men den siste ~ 100 ul må fjernes manuelt med en pipette, slik at cellepelleten ikke blir forstyrret. Et annet viktig aspekt ved skaffe friske nerveceller er å optimalisere celletetthet. Nevroner belagt altfor tynt er ikke så sunt. Siden så mange neuroner oppnådd fra hver mus i hjernen, er det ikke praktisk å telle celler før plettering. I løpet av den tid som ville bli brukt telling, vil et betydelig antall celler holder seg til plast og ville gå tapt. Ved hjelp av fire retter per mus (~ 1 x 10 ⁴ celler / ml) som et utgangspunkt, empirisk bestemmelse av antall retter er den mest praktiske måte å oppnå optimal neuron tetthet. Utbyttet av VMH nevroner fra eldre mus kan forventes å være om lag halvparten av utbyttet fra unge mus. Ytterligere feilsøking for å forbedre nevron avkastning innebærer kvantifisering av nevroner resterpå hvert trinn av dissosiasjon protokollen for å finne trinn av tunge nevronale avgang.

Ved hjelp av vår protokoll, kan sunne dissosiert nevroner overleve i kultur opp til 2-3 dager. Men bruk av filtrert astrocyte kondisjonevekstmedier kan neurons å overleve opptil to uker i kultur. Vekstmedier kan være betinget av ruger på konfluente primære astrocytter over natten. Astrocytter fra samme gnager stamme, kjønn og hjernen regionen bør utnyttes. Mens bruken av astrocyte kondisjonerte media innfører en annen variabel, kan denne modifisering være nødvendig for alternative forsøk som krever mer tid i kultur. Dessuten, av grunner som ikke er klart, har vi funnet at evnen til å sanse glukose er lett tapt med suboptimal neuronal helse, til tross for opprettholdelsen av responser på andre stimuli, slik som glutamat. Dermed må ekstra forsiktighet utvises. Å observere nevrale responser til redusert glukose, er det viktig å unngå contamination av bakterier, mugg, salter, såpe og glukose. Alt glass og sterile plast bør vaskes grundig med dH ₂ O. Foruten å leve forurensninger, ville vaskemidler og salter påvirke nevrale integritet og aktivitet. Små mengder glukose kan betydelig endre glukose konsentrasjoner. Dette ville forstyrre resultater siden glukose sensing nevroner er svært følsomme for små endringer i ekstracellulær glukose innenfor nonhyperglycemic fysiologiske utvalg av 0,1 til 2,5 mM ^10,11.

Ved anvendelse av MPD avbildning, konsistens-og side-ved-side-eksperimentering mellom behandlingsgruppene er avgjørende for meningsfulle resultater. Forskjellige behandlingsgrupper skal bli testet på samme dag, hvis det er mulig eller i det minste på alternerende dager. Dette minimerer faren for variasjoner i kultur preparater eller MPD mengdene. I tillegg har vi funnet det minste variasjon oppstår når avbildning utføres innen 24 timer av neuron dissosiasjon av grunner som er nevnt ovenfor. Siden resultateranalyseres som en% av depolariserende nevroner, nøyaktighet og konsistens i VMH disseksjon og nevronale forberedelse er også viktig. Den samlede VMH nevronale befolkningen høstet må være konstant og må ikke inneholde nerveceller fra andre regioner. Således bør protokollen ovenfor følges nøye og presist. Men, hvis alternative eksperimenter skal utføres og vedlikehold befolkning er ikke en bekymring, vev slag kan gjøres for å isolere VMN eller ARC nevroner.

Metodene som beskrives her etablere hvordan å høste friske VMH nevroner fra en voksen mus og hvordan du bruker MPD imaging å studere glukose sensing nevroner. I stedet kan eksperimenter være utformet for å undersøke VMH neuronal respons på stimuli annet enn glukose endringer. Alternativt kan dissosiasjon protokollen ekstrapoleres til slakte neuroner fra andre hjerneregioner. Ved hjelp av nerveceller fra voksne mus, kan studiene nå utføres ved hjelp murine sykdom modeller som utvikler eller fremgang med alderen. Moreover, kan friske voksne neuroner bli ytterligere undersøkt ved hjelp av andre enn MPD avbildningsteknikker slik som kalsium-avbildning, elektrofysiologi, enkeltcelle PCR, immunocytokjemi, eller en kombinasjon av disse teknikker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)	Invitrogen	15140	other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm)	Millipore		other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips	Warner	#1 25mm round
18 mm Glass coverslips	Warner	#1 18mm round
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 minus insulin (50x)	Invitrogen	0050129SA
Razor blade	VWR	55411
Vibratome & cooling chamber	Vibratome	Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades	Polysciences	22370	injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension	Worthington	LS003124
BSA, suitable for cell culture	Sigma		other vendor acceptable
DNAse, for cell culture	Invitrogen		other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
Membrane Potential Dye (blue)	Molecular Devices	R8042
In-line heater	Warner	SF-28
Syringe pumps	WPI	sp100i	other vendor acceptable
Closed chamber	Warner	RC-43C
Polyethylene tubing	Warner	PE-90
Metamorph	Molecular Devices		alternate image analysis software acceptable
Microscope	Olympus	BX61 WI	used with 10X objective
Camera	Photometrics	Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set	Chroma	41007a
Illumination System	Sutter Instruments	Lambda DG-4