Summary
A atividade de neurônios individuais de ratos em idade adulta pode ser estudado por dissociar os neurônios de regiões específicas do cérebro e usando membrana fluorescente potencial de imagem corante. Por testes de respostas a alterações nos níveis de glucose, esta técnica pode ser utilizada para estudar a sensibilidade à glicose dos neurónios hipotalâmicos ventromediais adultos.
Abstract
Estudos sobre a atividade neuronal são frequentemente realizadas utilizando neurônios de roedores com menos de 2 meses de idade, devido às dificuldades técnicas associadas com o aumento do tecido conjuntivo e diminuição da viabilidade neuronal que ocorrem com a idade. Aqui, descrevemos uma metodologia para a dissociação de neurônios do hipotálamo de ratos saudáveis em idade adulta. A capacidade para estudar os neurónios de ratos adultos em idade permite a utilização de modelos de doenças que se manifestam numa idade mais avançada e pode ser mais preciso para a developmentally certos estudos. Imagens de fluorescência de neurónios dissociados pode ser utilizado para estudar a actividade de uma população de neurónios, em oposição ao uso de electrofisiologia para estudar um único neurónio. Isso é particularmente útil quando se estuda uma população neuronal heterogêneo no qual o tipo neuronal desejado é raro, como para glicose sentindo neurônios do hipotálamo. Utilizamos membrana potencial de imagem corante de neurônios do hipotálamo ventromedial adultos para estudar as suas respostas a chaNGES na glucose extracelular. Neurônios sensores de glicose são acreditados para jogar um papel na regulação central do equilíbrio energético. A capacidade para estudar a detecção de glicose em roedores adultos é particularmente útil uma vez que a predominância de doenças relacionadas com o balanço de energia disfuncional (por exemplo. Obesidade) aumentar com a idade.
Introduction
O cérebro regula a homeostase energética através da neuroendócrino e sistema nervoso autônomo. O hipotálamo ventromedial (VMH), constituída pelo núcleo ventromedial (VMN) e o núcleo arqueado (ARC), é importante para a central de regulação da homeostase da energia. Neurônios sensores de glicose Especializadas, no VMH, vincular a atividade neuronal e homeostase da glicose periférica 1. Existem dois tipos de sensores de glicose neurônios; glicose animado (GE) neurônios aumentar enquanto a glicose inibida (GI) neurônios diminuir a sua actividade com o aumento da glicose extracelular. Neurônios glicose VMH sensores geralmente são estudados utilizando eletrofisiologia ou cálcio / membrana potencial de imagem sensível corante.
A técnica de patch clamp eletrofisiológico é considerada o padrão-ouro no estudo da atividade neuronal ex vivo. Nesta técnica, um eléctrodo de micropipeta de vidro é ligado à membrana celular através de uma elevada resistência(GÊ) selo. Eletrodos patch clamp permitir a gravação em tempo real do potencial de ação freqüência (pinça de corrente) ou condutância de íons (braçadeira de tensão) muda dentro de um único neurônio. Embora a técnica de patch clamp fornece informações detalhadas sobre mudanças na condutância de canais iônicos específicos, uma grande desvantagem é que apenas um neurônio pode observar ao mesmo tempo. Demora cerca de 30-45 minutos de gravação para verificar que se está a gravação de um neurônio sensor de glicose antes mesmo de iniciar um tratamento experimental específico. Além disso, GI e GE neurônios compreendem <20% do total da população neuronal VMH. Para agravar este problema é a falta, em muitos casos, de um marcador celular de identificação para esses neurônios. Assim, é evidente que apesar de fornecer informação eléctrica valiosa que outras técnicas não é possível, a análise de fixação de membranas é trabalhoso, demorado e baixo rendimento.
A utilização de imagens de fluorescência de neurónios dissociados VMH permite o estudo de hundreds de neurônios simultaneamente. Corantes sensíveis de cálcio pode ser utilizado para medir alterações de cálcio intracelular, que indirectamente se correlacionam com alterações na actividade neuronal. Corantes sensíveis potenciais de membrana são utilizados para monitorar mudanças potenciais de membrana. Medir o potencial de membrana celular é um indicador mais directa da actividade neuronal em comparação com alterações nos níveis de cálcio intracelular. Além disso, a membrana potencial corante (MPD) imagens potencialmente detectar pequenas mudanças no potencial da membrana onde a ação potencial de disparo não é alterada e os níveis de cálcio intracelular pode não mudar. Ambas as técnicas de imagiologia de fluorescência foram utilizados para estudar VMH neurónios sensores de glucose de ratinhos jovens 2-7. Embora os resultados são menos detalhadas do que as obtidas com patch clamp eletrofisiologia, a força de experimentos com imagens é que eles avaliam simultaneamente uma grande população de células que, inevitavelmente, incluem um número significativo de neurônios sensores de glicose. MPD i imagemé particularmente útil para estudar os neurónios GI que são mais uniformemente localizada ao longo de todo o VMH; proporcionando assim uma população adequada para estudar o VMH dissociado (~ 15% GI). Por outro lado, enquanto os neurônios da GE são densamente localizada no ventrolateral-VMN e celular pobre região entre o ARC e VMN, eles não representam um número significativo de neurônios dentro do VMH (<1% GE). Além disso, através do estudo de neurônios isolados, astrocitária e efeitos pré-sinápticos são eliminados. Isto pode ser uma vantagem em estudar os efeitos de primeira ordem de neurónios, bem como uma desvantagem uma vez que as ligações e os processos fisiológicos estão perdidos.
Um factor limitante, tanto Electrofisiologia de fixação de membranas e MPD / cálcio corante de imagem é a necessidade de utilizar animais mais novos (por exemplo, ratos ou ratazanas. <8 semanas de idade). Isto é, predominantemente, devido a um aumento do tecido conjuntivo, em combinação com a diminuição da viabilidade neuronal que ocorre com a idade. No cérebro-slice eletrofisiologia do parafuso prisioneiros, o aumento do tecido conjuntivo faz com que seja mais difícil visualizar os neurônios. O aumento do tecido conjuntivo também torna mais difícil dissociar um grande número de neurônios saudáveis para estudos de imagem. Além disso, os neurônios dos animais mais jovens sobrevivem por mais tempo durante o registo patch clamp ou imagem. No entanto, o uso de ratos jovens pode ser uma grande limitação. Actividade e / ou uma resposta a neurotransmissores ou nutrientes que circulam neuronal muda com a idade. Por exemplo, uma vez que o balanço energético está intimamente ligada ao estado reprodutivo, os neurônios do hipotálamo que regulam o balanço energético podem responder de forma diferente em pré-vs animais pós-púberes. Além disso, muitas doenças necessitam de um tratamento a longo prazo ou não se manifestar até a idade adulta. Os principais exemplos de tais doenças são a obesidade dietética ou Diabetes Mellitus Tipo 2. Desde neurônios sensores de glicose são acreditados para jogar um papel nestas doenças, desenvolvemos uma metodologia para cultivar com sucesso adultos VMH neurônios saudáveis para uso em exp imagem MPDeriments.
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Protocol
1. Animais
- Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey.
- Casa grupo masculino camundongos C57BL / 6 em uma programação escuro light/12 hr 12 hr e permitir o acesso ad libitum à água e comida. Sacrifício em 4-5 meses de idade. A eutanásia dos ratos foi realizada por meio do plano cirúrgico de anestesia e uma forma secundária de eutanásia (ou seja penetrando incisão na cavidade torácica, através da membrana). Isto é consistente com as Diretrizes AVMA sobre eutanásia.
2. Preparação da solução de perfusão, Lamelas, pipetas de vidro, e Mídia
- Adicione uma solução de perfusão que consiste em 1L de KCl 2,5 mM, 7 mM de MgCl2, 1,25 mM NaH 2 PO 4, 28 mM NaHCO3, 0,5 mM de CaCl2, 7 mM de glucose, 1 mM de ácido ascórbico, e 3 mM de piruvato em destilada dH2O Ajustar a osmolaridade para ~ 300 mOsm usando cerca de 80 g / L de sacarose. Oxigenar por borbulhamento com 95% de O2 / 5% de CO 2 e ajustar o pH para 7,4. Cada experiência requer aproximadamente 200 ml de solução de perfusão. As aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C durante até 2 meses.
- Adicione 250 ml de caldo contendo meio Neurobasal Neurobasal sem glicose, glicose 2,5 mM, e 100 U / ml de penicilina estreptomicina. Ajuste a osmolaridade do estoque Neurobasal a 280 mOsm usando sacarose. Fazer 500 ml Hibernate estoque contendo Hibernate-A mídia sem glicose, glicose 2,5 mM, e 100 U / ml de penicilina estreptomicina.
- Mexa bem e ambas as ações filtro de esterilizar utilizando Stericup unidades de filtro de vácuo. Tenha cuidado para não introduzir a glicose ou outros contaminantes através das barras de vidro ou agitar. Envolva as garrafas em papel alumínio para proteger a mídia da luz e armazenar a 4 ° C por até 2 meses.
- Inflamar as pontas dos 4 pipetas de vidro autoclavados (9) na forma que as pontas não são lodiâmetros nger afiadas e a abertura é grande (~ 0,9 milímetros), médio grande (~ 0,7 mm) em, meio (~ 0,5 mM), e pequeno (~ 0,3 mm),. O maior deve ser mal polido eo menor deve ser de cerca de um terço do que o diâmetro.
- No dia antes de neurônios de colheita, limpo quatro 25 milímetros lamínulas utilizando etanol 70% e que passam sobre um queimador de chama de Bunsen. Coloque cada lamela em um estéril 35 milímetros prato de cultura e adicionar 2 ml estéril 1% de poli-D-lisina em dH 2 O. Colocar os pratos em uma incubadora (37 ° C) durante a noite. No dia seguinte, lava-se com dH 2 O estéril 3x e permitir lamelas para secar completamente.
- Faça 75 mL alíquotas de 1 M de ácido láctico e 200 mL alíquotas de GlutaMAX; armazenar a -20 ° C. Totalmente descongelar alíquotas de ácido láctico e GlutaMAX antes da utilização para assegurar a homogeneidade.
- No dia da colheita de neurônios, fazer 30 ml de meio de cultura fresco que consistem em Hibernate-A estoque contendo ácido láctico 1 mM, 0,5 mM GlutaMAX, e 2% B27 sem insulina. VoRTEx e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 N.
- Coloque 10 ml de meio de cultura em uma placa de Petri 60 milímetros de vidro no gelo, colocar 2 ml em um tubo de 15 ml no gelo e manter a mídia restante à temperatura ambiente.
- No dia da colheita de neurónios, fazer 25 ml de meio de crescimento fresco consistindo de estoque Neurobasal que contém uma mM de ácido láctico, Glutamax 0,5 mM, e 2% B27 sem insulina. Vortex e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 N. Permitir que o meio de crescimento fresco para equilibrar numa incubadora (37 ° C, 5% CO 2) durante pelo menos 30 min.
3. Perfusão cardíaca
- Descongelar completamente 200 ml de solução de perfusão e oxigenado com 95% O2 / 5% de CO 2 em gelo durante pelo menos 15 min.
- Lavar uma lâmina vibratome com acetona, etanol a 70%, e dH2O Posicione a lâmina no vibratome.
- Lave a câmara de resfriamento vibratome e tubos de perfusão com dH 2 O. Encher a câmara de refrigeração (4 ° C) Com solução de perfusão e continuar a oxigenar.
- Anestesiar um rato com pentobarbital de sódio 50 mg / ml, diluído 1:1 com água estéril, injectado por via intraperitoneal. Verifique se o mouse é totalmente anestesiado por beliscar a cauda e observando nenhuma resposta.
- Despeje solução de perfusão fria no reservatório de perfusão e tubos pouco antes da dissecção. Salve 20-30 ml para dissecação do cérebro e continuar a oxigenar no gelo. Fluxo por gravidade a partir de uma seringa de 60 ml elevada através de uma tubagem e uma agulha G 20 proporciona um fluxo suficiente. Permita que a solução para executar até que as bolhas de ar são lavadas. Continue para oxigenar.
- Cortar a pele acima da caixa torácica do mouse. Levante a caixa torácica e, cuidadosamente, fazer um corte horizontal através do diafragma. Faça dois cortes laterais através da caixa torácica para cima em direção aos braços para expor o coração. Use uma pinça para segurar a caixa torácica.
- Faça um pequeno corte 2 milímetros no átrio direito para fornecer um ponto de saída de sangue para ser lavada para fora do vascusistema lar.
- Perfurar o ventrículo esquerdo com a agulha de perfusão, apenas o suficiente para inserir a abertura da agulha. Segurar a agulha no lugar com uma mão e iniciar o fluxo de solução de perfusão com a outra mão. Depois de 10-15 ml de solução de perfusão, o sangue deve ser lavado para fora e o efluente irá limpar.
4. Cérebro corte e Dissection
- Após a perfusão cardíaca, transferência oxigenado solução de perfusão a frio para uma placa de Petri em gelo imediatamente antes da utilização.
- Decapitar Rapidamente, remover o cérebro do crânio e colocar o cérebro em solução de perfusão. Para remover o cérebro: puxe a pele para a frente, faça um corte na linha média no crânio em direção às órbitas, fazer 2 cortes laterais em direção a cada um dos olhos, use uma pinça para puxar para trás de cada lado do crânio, fazer um corte coronal entre as órbitas dos olhos, e use uma espátula para persuadir suavemente o cérebro para fora em solução de perfusão. Use a tesoura para cortar as vias ópticas, se necessário. Não tocar o hipotálamoc área e não puxe as vias ópticas, porque isso coloca muita pressão sobre a eminência mediana e tecido hipotalâmico subjacente.
- Use uma lâmina de barbear e agulha lateralmente cortar o tecido cerebral de aproximadamente 3 mm posterior e anterior ao hipotálamo, enquanto o tecido está submerso (bregma -3,52 mm). É especialmente importante para o corte lateral anterior a ser de nível, de modo que o cérebro vai se sentar em frente a chuck vibratome.
- Remover o tecido cerebral restante da solução e usar papel de filtro para afastar solução da seção cérebro montado.
- Coloque um pouco de super-cola em um mandril vibratome e espalhar a cola com o tamanho do cérebro. Colocar o tecido cerebral em cima da cola com a face anterior virada para baixo e de frente para o hipotálamo da lâmina. Wick o excesso de cola e coloque a bucha na câmara de resfriamento vibratome. Tenha cuidado para não deixar muito cola, pois bolha em torno do cérebro, quando colocado em uma solução.
- Com o Vibratome ajustado para uma velocidade lenta (nível 2) e alta amplitude (nível 9), fazer 300-500 mM fatias até chegar à área do hipotálamo. Agora faça finas fatias de corte 100 mm a partir do posterior ao anterior. As pistas visuais são como se segue. Posterior ao hipotálamo do terceiro ventrículo será muito pequeno (-2,70 para -2,30 bregma mm). No bregma -2,30 mm, o terceiro ventrículo é separado em dorsal e ventral em secções o corte coronal.
- Uma vez que as seções do terceiro ventrículo fusível, faça dois 500 mm fatias que contêm a região correta do VMH (-2,18 para -1,22 bregma mm). Anterior à VMH, o terceiro ventrículo já não se estende para o chão ventral do cérebro (bregma -1.06 a -0.82) 8.
- Transferir essas fatias para a placa de Petri, em gelo, contendo os meios de cultura. Dissecar VMH (VMN + ARC), como mostrado na Figura 1. Usar uma pipeta para transferir suavemente as peças VMH em 2 ml de meio de cultura sobre gelo.
5. Dissociação e Cultura
- Remover o VMH de gelo e colocar à temperatura ambiente. Adicionar 20 U / ml de papaína a 4 ml de meio de cultura. Inverter para misturar e coloque em um banho de água 34 C °. Verifique e misturar por inversão a cada minuto até que a mídia digestão não é mais nublado. Filtro (0,22 mM) em um frasco estéril e transferir o tecido para os meios de digestão.
- Digerir o tecido, por agitação a 100 rpm a 34 ° C durante 30 min.
- Prepare 1 ml de meio contendo 8% de albumina de soro bovino (BSA) durante a digestão. Dissolve-se 80 mg de BSA em 1 ml de meio de cultura e do filtro (0,22 mM) num tubo cónico.
- Lavar o tecido através da transferência para 5 ml de meio de cultura num tubo cónico e, lentamente, invertendo uma vez.
- Adicionar enzima DNase 30 mL de 6 ml de meio de cultura e misture para fazer mídia trituração. Aspirar a mídia de lavagem e adicionar 3 ml de mídia trituração.
- Use as pipetas de vidro para triturar na ordem de largest para o menor. Gentilmente triturar 10x e aguarde 4 min para peças maiores para resolver. Utilizar a segunda pipeta para transferir o topo 2 ml contendo uma suspensão de células dissociadas de um novo tubo cónico. Adicionar 2 ml de mídia trituração, triturar 10x e esperar 3 min. Utilizar o terceiro pipeta para transferir os melhores 2 ml de suspensão de células. Adicionar 1 ml de mídia trituração, 5x triturar e esperar 2 min. Utilizar a quarta pipeta para transferir o topo 2 ml da suspensão de células.
- A camada de suspensão de células dissociadas em cima da BSA 8%, tomando cuidado para não misturar. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min.
- Coloque autoclavado de 6 mm x 8 milímetros clonagem cilindros no centro de cada lamela. Lamelas deve estar completamente seca. Aspirar e ressuspender o sedimento em 440 mL de mídia crescimento quente. Preencha clonagem de cilindros com a suspensão neuronal e lugar na incubadora por 20 min.
- Retire os cilindros de clonagem e muito gentilmente lavar detritos. Encha cada wi pratopo de 2 ml de meio de crescimento. Permitir que as células recuperar durante pelo menos 1 hr antes de quaisquer ensaios são realizados.
6. Preparação para o MPD imagem
- Adicione solução de gravação consiste de NaCl 121 mM, KCl 4,7 mM, CaCl2 2 mM, 0,1 mM de MgCl2, 1,2 mM de MgSO4, 0,97 mM de K 2 HPO 4, 0,23 mM, KH 2 PO 4, 5 mM de NaHCO3, e 25 mM HEPES. Ajustar o pH para 7,4.
- Adicionar glucose para tornar a solução de teste de glicose baixo desejado (0,1-2,0 mM de glucose). Misturar bem e reservar 400 ml baixo solução de gravação de glicose. Adicionar glicose para os restantes 600 ml para fazer solução de gravação de glicose 2,5 mM e misture bem.
- Proteger corante da luz tanto quanto possível. Adicionar 4 ml de temperatura ambiente de buffer para um frasco azul MPD. Misture bem e adicione 5 mL de corante por solução de gravação ml. Mantenha solução homogénea misturando com pipeta entre soluções. O corante fluorescente contém molecules, que entram células com despolarização, e supressor moléculas, que não podem atravessar a membrana celular. As aliquotas podem ser guardadas a -20 ° C e utilizado dentro de 4 dias. Não congelamento-descongelamento mais do que uma vez.
- Incubar as células em 2 ml de 2,5 mM de solução de gravação de glicose mais corante a 34 ° C durante 30 min. Um bloco de aquecimento pode ser utilizado. Proteger da luz.
- Prepare bombas de seringa e sistema de perfusão com 2,5 mM e 0,1 mM de soluções de gravação, mais corante. Tubos de 60 ml de seringas devem ser ligadas a um colector.
- Depois de parar qualquer bomba, espere ~ 10 segundos antes de mudar soluções no colector para evitar o acúmulo de pressão na seringa. A mudança de pressão de distribuição de fluido para alterar a câmara fechada que contém os neurónios, causando alterações no foco do microscópio durante a experiência e distorção de imagens.
- O tubo colector de saída deve ser ligado a um aquecedor em linha e, em seguida, tubo de polietileno, que se liga a uma câmara fechada. Bolhas devem ser apuradas ea taxa de perfusão deve ser ajustada para 0,5 ml / min. Proteger da luz.
- Transferir 25 milímetros lamela com os neurônios aderentes à câmara fechada, tomando cuidado para não permitir que lamela para secar e não introduzir bolhas de ar. O deslizamento é alinhada nas ranhuras da peça de fundo, um par de gotas de solução de gravação é colocado ao longo dos lados, e a parte superior está montada suavemente para segurar a lamela no lugar.
- Usar uma pipeta para encher a câmara com a solução de gravação e, em seguida, colocar uma lamela de 18 milímetros na parte superior. Gentilmente caber anel branco na câmara para manter a lamela menor no lugar. Pressionar para baixo muito lentamente e levemente para evitar as bolhas de ar a ser introduzido no interior da câmara fechada.
- Inicie a bomba de seringa para a solução de gravação de glicose 2,5 mM, pressione o anel branco, e conectar-se à câmara fechada. Solte lentamente a pressão do anel branco e se conectar a tubulação que conduz a um contentor de resíduos.
- Centralize os neurônios utilizando luz baixa de campo claro. Tentar minimizar a quantidade de tempo que as células estão a ser expostos à luz.
- Permitir que o sistema de perfusão de correr por 10 min para permitir a estabilização da temperatura, foco e tingir o equilíbrio.
- Enquanto priming, abra o programa MetaMorph e dar uma imagem de campo claro (10X) dos neurônios. Use a função de Auto-Focus para tomar 3 pilhas de imagens fluorescentes (150 ms, filtro de Cy3 Narrow, 10X) e determinar o foco dentro de 5 mm. No final do período de condicionamento de 10 min, verificar o foco mais uma vez.
- Comece a gravar imagens fluorescentes a cada 30 seg por 40 min. Estabelecer uma linha de base em 2,5 mM de glicose durante 10 minutos, em seguida diminua glicose durante 15 minutos, e finalmente voltar a 2,5 mM de glucose, durante 15 min. Soluções são alteradas, parando uma bomba de seringa, à espera de 10 segundos, voltando-se uma porta no colector, e começar outra bomba de seringa. As mudanças devem ocorrer antes de desejados momentos based sobre a defasagem entre o colector e células.
- Depois de gravar todas as imagens fluorescentes, dê uma imagem de campo claro dos neurônios.
8. Análise MPD imagem
- Use MetaMorph para criar regiões ovais ao redor de cada célula na imagem de campo claro tomada no final do experimento in. Regiões deve ser ligeiramente maior do que cada neurônio e podem ser feitas de 1 pixel fora de borda escura da célula. Não escolha células que são insalubres, sobreposição, ou perto de detritos. Células saudáveis, muitas vezes aparecem escuras. Por fim, criar 5 grandes regiões ovais em áreas com ausência de células ou detritos para as medições de fundo.
- Transfira as regiões para todas as imagens fluorescentes e inspecionar para verificar que nenhum movimento / mudança ocorreu. Use a função de medida para registrar a intensidade de fluorescência de cada região para todas as imagens em um arquivo do Excel. O uso de Revistas em Metamorph é aconselhada.
- No Excel, crie uma média de 5 regiões de fundo para cada fluorescimagem ent. Isto representa o valor médio do fundo em cada ponto de tempo. Para cada ponto de imagem / tempo, subtrair o fundo de todas as medições região. A intensidade de fluorescência subtraído-fundo será chamado de intensidade a seguir.
- Para cada célula, calcular a intensidade média durante 2-8 minutos de gravação. Isso representa a linha de base da célula em glicose 2,5 mM. Um tampão de dois minutos em ambas as extremidades de cada tratamento é utilizado para minimizar o ruído.
- Para cada célula, calcular a percentagem de alteração a partir da linha de base: (Intensidade-Base) / Base
- Criar um gráfico de linha com a variação percentual da linha de base vs tempo.
- Calcule a variação percentual média da linha de base durante minutos 18-23. Calcule a variação percentual média da linha de base durante 35-40 minutos. Durante o processamento da imagem não é utilizado, o ruído é reduzido por meio do cálculo da média de intensidade dentro de cada região celular, de subtracção do fundo, e a média da intensidade de região, durante 5 minutos or mais.
- Experimentos de controle em que mM solução de gravação de glicose 2,5 mM é trocada com solução de gravação de glicose 2,5 devem ser realizados para determinar o limiar de ruído. Calcule a variação percentual média da linha de base durante 18-23 minutos, para, pelo menos, 6 pratos e 3 ratos. Determine a média e desvio padrão desses valores.
- Definir o limiar de uma resposta positiva de despolarização à média mais dois desvios padrão. A média mais dois desvios padrão corresponde a uma diferença com p <0,05. As experiências de controlo revelou uma alteração de 10% da linha de base como o valor limiar apropriado.
- Para cada célula, avaliar a resposta de despolarização reversível com base em dois critérios. Em primeiro lugar, a alteração percentual média da linha de base durante 18-23 minutos, deve ser maior do que 10%, o limite determinado na etapa anterior. Em segundo lugar, a variação percentual média da linha de base durante 35-40 minutos, deve ser inferior a metade da variação percentual média delinha de base durante minutos 18-23. O segundo critério foi escolhido, uma vez que foi encontrado para ser mais rigoroso do que a estimulação com glutamato ou KCl. Neurônios não saudáveis costumam responder à estimulação com glutamato ou KCl, embora suas respostas a diminuição da glicose não são reversíveis.
- Para cada prato, calcular a% de neurônios despolarizadas. Este valor é utilizado para quantificar a% de neurónios GI entre os diferentes grupos de tratamento.
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Representative Results
A dissecção precisa do VMH longe de outras áreas do hipotálamo é importante para a obtenção de resultados consistentes. A inclusão de outras áreas podem diluir a população neuronal VMH, mudando a% de neurónios despolarizadas calculados. Além disso, os neurónios sensores de glicose foram identificados em outras regiões do hipotálamo, como o hipotálamo lateral, que pode ser diferente funcionalmente e mecanicamente a partir de glicose VMH detecção neurónios. Figura 1 ilustra as localizações anatómicas correcção para a adequada. Na sequência do protocolo anteriormente referido, o tecido cerebral que contém a região correta VMH pode ser dissociado. Mais precisamente dissecção para separar o VMN e ARC, enquanto se mantém a totalidade de cada subpopulação, podem não ser possível. Figura 2 mostra um exemplo de saudável neurónios dissociados VMH. Usando imunocitoquímica, confirmamos que a nossa preparação é> 90% neuronal. Somente neurônios saudáveis deve ser usado para aná dadossis e pratos com muitos neurônios saudáveis deve ser descartada. Os neurônios que são insalubres, muitas vezes têm bordas muito escuras, assumir o MPD, em maior medida, e têm formas irregulares. Além disso, os neurônios devem ser banhados com uma densidade tal que a maioria dos neurônios não se tocam durante a gravação. Neurônios selecionados para análise não deve tocar outras células ou detritos.
Os dados obtidos a partir de registos de um neurónio GI e um neurónio nonGI são mostrados na Figura 3. Após a obtenção de uma linha de base durante 10 min, a glucose extracelular foi diminuída 2,5-0,1 mM. O neurónio GI mostra uma resposta robusta reversível maior do que o limiar pré-determinado de 10% de alteração a partir da linha de base. O aumento de fluorescência reflecte a despolarização. Embora as respostas GE neurônio hiperpolarização também são detectados, a freqüência é muito baixa (<1% neurônios) para o uso bem sucedido dessa técnica sobre este subtipo de glicose neurônio detecção. Uma gama de glucos fisiológicase diminuições foram testadas e a percentagem de neurónios VMH que reversivelmente despolarizado foi calculada para cada prato. Figura 4 mostra que existe uma relação positiva entre a magnitude da redução da glicose e a percentagem de neurónios despolarizante. Isto demonstra que a cultura de neurónios primários de sucesso de murino adulto pode ser usado em conjunção com imagiologia por fluorescência para permitir o estudo de adultos VMH neurónios GI.
Figura 1. Secção coronal com marcadores para correta dissecção VMH. Dissecada O tecido contém a VMN e ARC com contaminação mínima de outras áreas do hipotálamo. Cortes diagonais deve ser feita a partir de ~ 25-30% abaixo do topo do terceiro ventrículo de ~ 25-30% entre o ponto onde o córtex satisfaz a área hipotalâmica (azul *) e o terceiro ventrículo(3V). Adaptado de bregma -2,8 mm Paxinos e Watson 1998 9, correspondendo a Rato Cérebro-bregma 1,7 milímetros. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 2. Imagem de campo claro de neurónios VMH saudáveis de um rato adulto. Esta imagem foi tirada 24 horas após a dissociação e tem sido utilizada para imagiologia MPD. Alguns exemplos de neurônios que seria (azul *) ou não (vermelho x) ser utilizado para a análise são marcados. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 3. Vestígios MPD de fluorescência representativos de um neurónio GI (linha verde) e um neurónio nonGI (linha laranja). Células foram perfundidos com 2,5 mM de glucose (G), solução de gravação, durante 10 min, seguido de um decréscimo de 0,1 mM de L, durante 15 min e uma voltar a 2,5 mM L durante 15 min. No neurônio GI, a variação percentual da linha de base aumentou para mais de 10% durante o período de perfusão mM G 0,1 (40% da média 20-25 min) e diminuiu para menos de metade deste aumento no período de reversão mM G 2.5 (15 % média 35-40 min). Clique aqui para ver a imagem ampliada .
Figura 4. A porcentagem de adultos VMH neurônios que reversível despolarizar em resposta à diminuição da glicose detectada usando imagens MPD fluorescente. Umexiste relação positiva entre a magnitude da diminuição da glicose e do percentual de despolarização de neurônios. Clique aqui para ver a imagem ampliada .
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Discussion
A chave para ser capaz de estudar a atividade dos neurônios de camundongos adultos é a capacidade de dissociar os neurônios saudáveis. A dissociação dos neurônios do hipotálamo de camundongos adultos é mais difícil em vários passos-chave no protocolo em comparação com neurônios de ratos juvenis. Temos superar este problema de várias formas. Fazendo grossas fatias de 500 mm do cérebro minimiza danos mecânicos aos neurônios, em comparação com os habituais 250-350 mM fatias utilizados para o tecido cerebral de ratos mais jovens. No entanto, cortes mais finos requerem maior atenção à perfusão cardíaca e digestão com papaína de tecido cerebral. Se o sangue é vista em tecido cerebral, avaliar a precisão e da colocação do corte na aurícula direita e da agulha colocado no ventrículo esquerdo. A taxa e a quantidade de solução de perfusão de fluxo pode também ser ajustado. Uma perfusão completa é imperativo vez que o sangue é tóxico para os neurónios e irá resultar num rendimento mais baixo de neurónios saudáveis. A digestão com papaína deve ser suficientemente eficaz para permitirpara trituração suave e fácil liberação de células isoladas do tecido cerebral. Haja suspeita de uma digestão com papaína ineficiente quando o tecido VMH afunda rapidamente no fim da digestão e quando pedaços de tecido maiores estão presentes durante a segunda trituração. Com uma boa digestão, pedaços de tecido são apenas detectadas a olho nu durante a terceira trituração. Se a trituração não é suave, saúde neuronal sofrerá. Se se suspeitar de uma digestão com papaína ineficiente, a concentração da papaína pode ser aumentada em 5 U / ml, ou um novo frasco de papaína pode ser usado. No entanto, a concentração de papaína não deve ser aumentada acima de 30 U / ml uma vez que este pode prejudicar a saúde neuronal.
A exposição a BSA é um passo crítico no protocolo. Depois de as células terem sido centrifugados triturado no gradiente de BSA, tanto a quantidade de tempo neurónios são expostos a BSA e a quantidade de BSA permitido permanecer com o sedimento deve ser minimizada. O sobrenadante e o gradiente de BSAdeve ser aspirado imediatamente a seguir ao período de centrifugação. Sucção a vácuo pode ser utilizado para remover a maioria do sobrenadante, mas a última ~ 100 mL devem ser removidos manualmente, com uma pipeta, de modo que o sedimento de células não é interrompido. Outro aspecto importante a obtenção de neurónios saudáveis é para optimizar a densidade celular. Neurônios banhados muito pouco não são tão saudáveis. Uma vez que alguns neurônios são obtidos a partir de cada cérebro do rato, não é prático para contar as células antes do plaqueamento. Durante o tempo que seria gasto de contagem, um número significativo de células que aderem ao plástico e seria perdida. Utilizando quatro pratos por rato (~ 1 x 10 4 células / ml) como um ponto de partida, a determinação empírica do número de pratos é o método mais prático para a obtenção da densidade óptima neurónio. O rendimento de neurónios de ratos mais velhos VMH pode ser esperado para ser cerca de metade do rendimento a partir de ratos jovens. Além disso resolução de problemas para melhorar o rendimento neurônio envolve a quantificação de neurônios remanescentesem cada etapa do protocolo de dissociação para identificar as etapas de desgaste neuronal pesado.
Usando o nosso protocolo, os neurônios dissociados saudáveis pode sobreviver na cultura até 2-3 dias. No entanto, o uso de meios de crescimento filtrada condicionado astrocyte permite que os neurônios de sobreviver até 2 semanas em cultura. Meios de crescimento pode ser condicionada pela incubação em astrócitos primários confluentes durante a noite. Devem ser utilizados os astrócitos da mesma estirpe de roedores, o sexo, e a região do cérebro. Embora a utilização de meios condicionados-astrócitos introduz outra variável, esta modificação pode ser necessário para experiências alternativas requerem mais tempo em cultura. Além disso, por razões que não são claras, verificou-se que a capacidade de detectar a glicose é facilmente perdido com a saúde neuronal sub-óptima, apesar de a manutenção de respostas a outros estímulos, tais como o glutamato. Assim, deve-se tomar cuidado adicional. Para observar as respostas neuronais a diminuição da glicose, é imperativo evitar contaminatipor bactérias, fungos, sais, sabão, e glicose. Todos os vidros e plásticos não estéreis devem ser cuidadosamente lavados com dH 2 O. Além de contaminantes vivo, detergentes e sais afetaria a integridade ea atividade neuronal. Pequenas quantidades de glicose pode alterar significativamente as concentrações de glicose. Isso iria atrapalhar resultados desde neurônios sensores de glicose são muito sensíveis a pequenas alterações na glicose extracelular dentro da faixa fisiológica nonhyperglycemic de 0,1-2,5 mM 10,11.
Ao utilizar imagens MPD, consistência e experimentação lado-a-lado entre os grupos de tratamento são vitais para resultados significativos. Diferentes grupos de tratamento devem ser testados no mesmo dia, se possível, ou pelo menos em dias alternados. Isso minimiza possíveis variações nas preparações de cultura ou alíquotas MPD. Além disso, verificou-se a menor variação ocorre quando imagens é realizada dentro de 24 horas de neurônio dissociação, por motivos mencionados acima. Como os resultadossão analisados como um% da despolarização de neurônios, precisão e consistência na VMH dissecação e preparação neuronal também é essencial. A população em geral neuronal VMH colhida deve ser constante e não deve conter neurônios de outras regiões. Assim, o protocolo acima devem ser seguidos de perto e com precisão. No entanto, se as experiências alternativas devem ser executadas e manutenção da população não é uma preocupação, socos de tecido pode ser feito para isolar VMN ou ARC neurônios.
Os métodos descritos aqui estabelecer como colher neurônios VMH saudáveis de um rato adulto e como usar MPD imagem para estudar glicose sentindo neurônios. Em vez disso, os experimentos poderiam ser projetados para examinar as respostas neuronais VMH a estímulos que não sejam alterações de glicose. Em alternativa, o protocolo de dissociação podem ser extrapolados para os neurónios de colheita a partir de outras regiões do cérebro. Usando neurônios de camundongos adultos, os estudos já pode ser realizada utilizando modelos de doenças murino que se desenvolvem ou o progresso com a idade. Moreover, os neurônios adultos saudáveis pode ser estudado mais do que usando outras imagens MPD técnicas como o imageamento de cálcio, eletrofisiologia, de uma única célula PCR, imunocitoquímica ou uma combinação destas técnicas.
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Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI | used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
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