Summary
Yetişkin-yaşlı farelerin tek nöronların aktivitesi belirli beyin bölgelerinde nöronları dissociating ve floresan membran potansiyeli boya görüntüleme kullanılarak incelenebilir. Glikoz değişikliklere test yanıtlar olarak, bu teknik, yetişkin ventromedial hipotalamus nöronları glikoz duyarlılığını belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Nöronal aktivite çalışmaları nedeniyle sık sık artan bağ dokusu ile ilgili teknik zorluklar kemirgenler yaş en az 2 ay nöronları kullanılarak gerçekleştirildi ve yaş ile oluşan nöronal canlılığı azalmıştır. Burada, yetişkin yaşlı farelerin sağlıklı hipotalamik nöronların ayrışma için bir metodoloji tarif eder. Yetişkin-yaşlı farelerin nöronların çalışma yeteneği daha geç bir yaşta tezahür ve bazı çalışmalar için daha fazla gelişimsel doğru olabilir hastalık modellerinin kullanımına izin verir. Tek bir nöron çalışma elektrofizyoloji kullanarak karşıt olarak ayrışmış nöron Floresan Görüntüleme, nöronların nüfusu aktivitesini incelemek için kullanılabilir. Istenen nöronal tipi, hipotalamik glikoz algılama nöronlar için nadir olan bir heterojen popülasyonu nöronal okuyan bu özellikle yararlıdır. Biz cha onların yanıtları incelemek için yetişkin ventromedial hipotalamik nöronların membran potansiyeli boya görüntüleme kullanılmaktadırhücre dışı glükoz nges. Glikoz algılama nöronlar enerji dengesi düzenlenmesinde merkezi bir rol oynadığına inanılmaktadır. Yetişkin kemirgenler glikoz algılamayı çalışma yeteneği işlevsiz enerji dengesi (örn.. Obezite) yaşla birlikte artış ile ilişkili hastalıkların baskın beri özellikle yararlıdır.
Introduction
Beyin nöroendokrin ve otonom sinir sistemleri ile enerji homeostazisini düzenler. Ventromedial hypothalamus (VMH), ventromedial çekirdeği (VMN) ve kavisli çekirdek (ARC) oluşan, enerji homeostazının düzenlenmesinde merkezi için önemlidir. İhtisas glikoz algılama nöronlar, VMH içinde, nöron aktivitesi ve periferik glukoz homeostazını 1. bağlantı. Glikoz heyecanlı (GE) glikoz (GI) nöronlar dışı glikoz arttıkça onların aktivitesini azaltmak inhibe ederken nöronlar artırmak; nöronların algılama glikoz iki türü vardır. VMH glukoz algılama nöronlar genellikle elektrofizyoloji veya kalsiyum / zar potansiyeli duyarlı boya görüntüleme kullanılarak incelenmiştir.
Elektrofizyolojik yama kenetleme tekniği ex vivo nöronal aktivitenin çalışmaya altın standart olarak kabul edilir. Bu teknikte, bir cam mikropipet elektrot yüksek direnç üzerinden hücre membranına bağlı olduğu(GΩ) mühür. Yama kelepçe elektrotlar aksiyon potansiyeli frekansı (akım kelepçe) veya iyon iletkenlik (gerilim kelepçe) gerçek zamanlı kayıt, tek bir nöronun içinde değişir sağlar. Yama kenetleme tekniği spesifik bir iyon kanal iletkenliklerini değişiklikler ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar birlikte, önemli bir dezavantajı, sadece bir nöron, bir süre gözlendi olmasıdır. Hatta, belirli bir deneysel tedavi başlamadan önce bir glikoz algılama nöron o bir kayıt olduğunu doğrulamak için kayıt yaklaşık 30-45 dakika sürer. Ayrıca, GI ve GE nöronlar <toplam VMH nöronal nüfusun% 20'sini oluşturmaktadır. Bu sorunu Bileşik bu nöronlar için tanımlayıcı bir hücre işaretleyici birçok durumda eksikliği vardır. Böylece, çok açıktır ki, diğer teknikler, yama kelepçe analiz zahmetli değil ki değerli elektrikli bilgiler, zaman alıcı ve düşük verim sağlayan rağmen.
Ayrışmış VMH nöronların floresan görüntülemenin hu çalışma sağlareş zamanlı olarak nöronların ndreds. Kalsiyum duyarlı boyalar dolaylı olarak nöronal aktivitenin değişikliklere ilişkili hücre içi kalsiyum değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir. Membran potansiyeli duyarlı boyalar zar potansiyel değişiklikleri izlemek için kullanılır. Hücre membran potansiyelinin ölçülmesi, hücre içi kalsiyum seviyelerinde değişiklik ile karşılaştırıldığında nöronal aktivitenin daha doğrudan bir endeksidir. Ayrıca, membran potansiyeli boya (MPD) görüntüleme potansiyel aksiyon potansiyeli ateşleme değişmiş değildir ve hücre içi kalsiyum düzeyleri değişiklik olmayabilir membran potansiyeli küçük değişiklikleri algılar. Bu flüoresan görüntüleme teknikleri Hem genç farelerde 2-7 dan VMH glikoz algılama nöronlar incelemek için kullanılmıştır. Sonuçlar yama klempi elektrofizyoloji ile elde edilenden daha az ayrıntılı olarak olsa da, görüntüleme deneylerin kuvveti, aynı anda, kaçınılmaz olarak glikoz algılama nöronların önemli bir sayısını içerir hücrelerin geniş bir popülasyonu değerlendirmek olmasıdır. MPD görüntüleme idaha düzgün olarak VMH boyunca lokalize GI nöronlar çalışmak için özellikle kullanışlıdır, böylece ayrışmış VMH (~ 15% GI) olarak çalışmak üzere yeterli bir popülasyonu sağlanır. GE nöronlar yoğun ventrolateral-VMN ve ARC ve VMN arasında hücre zayıf bölgede lokalize ise aksine, bunlar VMH içinde nöronların önemli sayıda (<% 1 GE) temsil etmemektedir. Ayrıca, izole nöronların inceleyerek, Astrositik ve presinaptik etkileri ortadan kalkar. Fizyolojik bağlantılar ve işlemler kaybolur beri bu ilk sipariş nöron etkilerini inceleyerek bir avantaj, hem de dezavantaj olabilir.
Yama kelepçe elektrofizyoloji ve MPD / kalsiyum boya görüntülemede hem de sınırlayıcı faktör, daha küçük hayvanların (örneğin,. Fareler veya sıçanlar <yaşı 8 hafta) kullanmak için ihtiyaç vardır. Bunun nedeni, yaşla birlikte ortaya çıkar azalma nöronal canlılığı ile bir arada artan bağ dokusu için ağırlıklı olarak. Beyin dilim elektrofizyoloji saplamaler, artan bağlayıcı doku daha zor nöronlar görselleştirmek için yapar. Artan bağ dokusu da zor görüntüleme çalışmaları için sağlıklı nöron çok sayıda ayırmak için yapar. Ayrıca, genç hayvanların nöronlar yama kelepçe kayıt veya görüntüleme sırasında da uzun süre hayatta. Ancak genç farelerin kullanımı, önemli bir sınırlama olabilir. Nöronal etkinliği ve / veya nörotransmiterler ya da dolaşım besin tepkiler yaş ile değiştirin. Enerji dengesi yakından üreme durumuna bağlı olduğundan Örneğin, enerji dengesini düzenleyen hipotalamik nöronlar postpubescent hayvanların öncesi vs farklı yanıt verebilir. Ayrıca, birçok hastalıkların uzun süreli tedavi gerektiren ya da yetişkinliğe kadar tezahür yok. Bu tür hastalıkların Başbakanı örnekleri beslenme obezite ve Tip 2 Diabetes Mellitus vardır. Glikoz algılama nöronlar, bu hastalıklarda bir rol oynadığına inanılmaktadır beri başarıyla MPD görüntüleme exp kullanılmak için sağlıklı yetişkin VMH nöronların kültür için bir yöntem geliştirdieriments.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hayvanlar
- Tüm prosedürler New Jersey Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Tıp Üniversitesi'nde Komitesi ve Diş Hekimliği tarafından onaylanmıştır.
- Ev grup erkek C57BL / 6, 12 saat aydınlık/12 saat karanlık programına fareler ve su ve gıda ad libitum erişim sağlar. 4-5 aylıkken kurban. Farelerin Ötenazi anestezi cerrahi düzlemi ve ötenazi ikinci bir formu (örneğin, diyafram üzerinden göğüs boşluğuna nüfuz kesi) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu Ötenazi üzerine AVMA Yönergeleri ile tutarlıdır.
2. Perfüzyon Çözüm, Lameller, Cam Pipetler ve Medya hazırlanması
- 2.5 mM KCl, 7 mM MgCl2, 1.25 mM NaH 2 PO 4, 28 mM NaHCO 3, 0.5 mM CaCl2 içeren 1 L perfüzyon çözeltisi oluşturunuz, 7 mM glikoz, 1 mM askorbat, ve damıtılmış dH 2 O. 3 mM piruvat Için ~ 30 ozmolaritesini ayarlayınYaklaşık 80 g / L sukroz kullanılarak 0 mOsm. % 95 O 2/5% CO2 kabarcıkları ve pH'ı 7.4 'e ayarlayın ile Oxygenate. Her deney perfüzyon çözeltisi yaklaşık 200 ml gerektirecektir. Bu süspansiyonun tam bölenleri kadar, 2 ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
- Glukoz, 2.5 mM glükoz ve 100 U / ml penisilin streptomisin olmaksızın Neurobasal ortamı içeren 250 ml Neurobasal stokları olun. Sukroz ile 280 mOsm Neurobasal stokunun ozmolaritesini ayarlayın. 500 ml glükoz, 2.5 mM glükoz ve 100 U / ml penisilin streptomisin olmaksızın hazırda-A ortamı içeren stok hazırda bekleme olun.
- Stericup vakum filtre birimleri kullanarak iyi hisse senetleri ve filtre sterilize hem karıştırın. Cam veya karıştırma çubukları ile glikoz veya diğer kirleticileri tanıtmak için dikkatli olun. Işıktan korumak ve ortam kadar, 2 ay boyunca 4 ° C de saklamak için folyo ile şişe sarın.
- Ipuçları no lo böylece 4 otoklavlanmalıdır cam pipetler (9) ve ipuçlarını alevnger keskin ve açıklık çapları olan büyük (~ 0.9 mm), orta-büyük (~ 0.7 mm), orta (~ 0.5 mm) ve küçük (~ 0.3 mm). En büyük zorlukla perdahlanmalı ve en küçük çapının yaklaşık üçte biri olmalıdır.
- Hasat nöronlar,% 70 etanol kullanılarak ve bir Bunsen brülör alevi üzerinden geçen temiz, dört adet 25 mm cam kapak slipleri bir gün önce. Steril 35 mm kültür çanağı her bir lamel ve 2 ml dH 2 O'da steril% 1 poli-D-lisin eklemek Gece boyunca bir kuluçka makinesine (37 ° C) 'de yemekler koyun. Ertesi gün, steril dH 2 O 3x ile yıkayın ve lamelleri tamamen kuru izin verir.
- 1 M laktik asit ve Glutamax 200 ul hacimde 75 ul alikotları; -20 ° C'de saklayın Tam homojenliği sağlamak için kullanımdan önce laktik asit ve Glutamax hacimde eritin.
- Hasat nöronların gününde, insülin olmadan 1 mM laktik asit, 0.5 mM Glutamax,% 2 ve B27 içeren hazırda-A stoklar oluşan taze kültür ortamı içinde 30 ml yapmak. Vortex ve 1 N NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın.
- Buz üzerinde 60 mm bir cam Petri kabındaki kültür ortamı 10 ml koyun, buz üzerinde bir 15 ml konik bir tüp içinde 2 ml koymak ve oda sıcaklığında kalan ortamı tutun.
- Hasat nöronların günde, 1 mM laktik asit, 0.5 mM GlutaMAX ve insülin olmadan% 2 B27 içeren Neurobasal stoklar oluşan yeni büyüme ortamı içinde 25 ml yapmak. Vorteks ve 1 N NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın. Taze büyüme ortamı, en az 30 dakika süreyle bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO2) dengelenmeye bırakın.
3. Kardiyak perfüzyon
- Tam% 95 O 2/5, en az 15 dakika boyunca buz üzerinde% CO2 ile birlikte 200 ml perfüzyon çözeltisi ve oksijenatı eritin.
- Aseton,% 70 etanol ve dH 2 O. ile vibratome bıçak yıkayın Vibratome bıçak yerleştirin.
- DH 2 O. ile vibratome soğutma odası ve perfüzyon tüp durulayın Soğutma odası doldurun (4 ° C) Perfüzyon çözeltisi ve oksijen devam etmektedir.
- Sodyum pentobarbital 50 mg olan bir fare anestezi / ml steril su ile 1:1 oranında seyreltildi, intraperitoneal olarak enjekte. Doğrulayın fare tam kuyruk kısma ve hiçbir yanıt gözlemleyerek anestezi.
- Sadece diseksiyon önce perfüzyon rezervuar ve boru içine soğuk perfüzyon solüsyonu dökün. Beyin diseksiyon için 20-30 ml kaydedin ve buz üzerinde oksijen devam ediyor. Tüp yoluyla yüksek 60 ml şırınga gravite akışı ve bir 20 G iğne yeterli akışı sağlar. Hava kabarcıkları dışarı yıkanır kadar çözüm çalıştırmasına izin ver. Oksijen devam ediyor.
- Fare göğüs kafesi üzerinde cilt geri kesti. Göğüs kafesi kaldırın ve dikkatlice diyafram üzerinden yatay bir kesim yapmak. Kalp maruz kollarına doğru göğüs kafesi yukarı doğru iki yan keser. Göğüs kafesi geri tutmak için forseps kullanın.
- Kan vaskülopatili yıkanabilir için bir çıkış noktası sağlamak için sağ atrium küçük 2 mm kesim olunlar sistemi.
- Yeterli iğne açıklığı eklemek için, perfüzyon iğne ile sol ventrikül delin. Tek elle iğneyi yerinde tutun ve diğer el ile perfüzyon çözeltisi akışını başlatmak. Perfüzyon solüsyonu 10-15 ml sonra, kan yıkanmalıdır ve atık temizlemek olacaktır.
4. Beyin Dilimleme ve Diseksiyon
- Kardiyak perfüzyon sonrasında, transfer kullanımdan hemen önce buz üzerinde bir Petri kabı soğuk perfüzyon çözeltisi oksijenli.
- Çabuk, başını kesmek kafatası beyin kaldırmak ve perfüzyon çözeltisi içine beyin yerleştirin. Beyin kaldırmak için: ileri cilt çekme, göz çukurları doğru kafatasında bir orta hat kesim yapmak, her gözün doğru 2 yan keser, geri kafatasının her tarafını çekme göz çukurları arasında koronal kesim yapmak, ve forseps kullanın yavaşça perfüzyon çözeltisi içine beyin dışarı çıkarmasını için bir spatula kullanın. Gerekirse optik yolları kesmek için makas kullanın. Hipotalamuslarmdan dokunmak yokc alanı ve bu medyan eminens ve altta yatan hipotalamik doku üzerinde çok fazla baskı koyar çünkü optik yolları çekmeyin.
- Doku (Bregma -3.52 mm) batık ise yanal hipotalamus beyin dokusunun yaklaşık 3 mm posterior ve anterior kesmek için jilet ve iğne kullanın. Beyin vibratome aynanın düz oturup böylece ön cephesi kesme seviyesi için özellikle önemlidir.
- Çözeltisinden kalan beyin dokusu çıkarmak ve monte beyin bölümünden çözüm fitil filtre kağıdı kullanın.
- Bir vibratome üzerinde ayna süper yapıştırıcı bir DAB yerleştirin ve beyin boyutuna tutkalı yaymak. Ön tarafı aşağı bakacak ve hipotalamus bıçak bakacak tutkal üstüne beyin dokusu koydu. Fitil uzak fazla tutkal ve vibratome soğutma odasına aynasını yerleştirin. Bu çözüm içine beyin çevresinde kabarcık kadar yerleştirilir zaman kadar tutkal bırakmamaya dikkatli kullanın.
- Vibratom ileE yavaş hızda (düzey 2) ve yüksek genlik (level 9) ayarlanabilir, hipotalamik alan ulaşana kadar 300-500 mikron dilim olun. Şimdi anterior posterior kesim ince 100 mikron dilim olun. Aşağıdaki gibi görsel işaretler vardır. Üçüncü ventrikül (-2.70 -2.30 mm Bregma) çok küçük olacaktır hipotalamus Posterior. Bregma -2.30 mm anda, üçüncü ventrikül koronal dilim dorsal ve ventral bölümlere ayrılır.
- Üçüncü ventrikül sigortanın bölümleri, (-2.18 -1.22 mm Bregma) VMH doğru bölgeyi içerecek iki 500 mikron dilim yaptıktan sonra. Anterior VMH için, üçüncü karıncık artık 8 (-1,06 -0,82 için bregma) beynin ventral yere kadar uzanır.
- Buz ihtiva eden kültür ortamı üzerinde Petri kabına bu dilimleri aktarın. Şekil 1 'de gösterildiği gibi VMH (VMN + ARC) ayır. Yavaşça buz üzerinde kültür ortamı içinde 2 ml VMH parçaları aktarmak için bir pipet kullanın.
5. Ayrışma ve Kültür
- Buz VMH çıkarın ve oda sıcaklığında yerleştirin. Kültür ortamının 4 ml 20 U / ml papain ekleyin. 34 ° C su banyosunda karıştırmak ve yer için ters. Sindirim medyası artık bulutlu kadar her dakika kontrol ve tersine çevirerek karıştırın. Steril şişe içine (0.22 um) ile filtre sindirim ortama doku aktarın.
- 30 dakika boyunca 34 ° C'de 100 rpm'de çalkalanarak doku Digest.
- Sindirim sırasında 8% sığır serum albümini (BSA) ihtiva eden ortam içinde 1 ml hazırlayın. Konik tüp içine kültür ortamı ve filtrenin 1 ml (0.22 um) 80 mg BSA çözülür.
- Konik bir tüp içinde kültür ortamı içinde, 5 ml aktarılması ve yavaş yavaş bir kez ters çevrilerek doku yıkayın.
- Kültür ortamı, 6 ml, 30 ul enzim DNase ilave edin ve toz haline getirme ortam yapmak için karıştırın. Yıkama ortamı aspire ve toz haline getirme ortam 3 ml ekleyin.
- L sırayla çiğnemek için cam pipetler kullanarakargest küçüğüne. Yavaşça 10x çiğnemek ve sonra yerleşmek için büyük parçalar için 4 dakika bekleyin. Yeni bir konik tüp ayrışık hücre süspansiyonu ihtiva eden 2 ml En iyi aktarmak için ikinci bir pipet kullanın. , Tritürasyon medyanın 2 ml ekleyin 10x çiğnemek ve 3 dakika bekleyin. Hücre süspansiyonuna 2 ml En iyi aktarmak için üçüncü pipet kullanın. Tritürasyon medya, çiğnemek 5x 1 ml ekleyin ve 2 dakika bekleyin. Hücre süspansiyonuna 2ml iyi aktarmak için dördüncü pipet kullanın.
- Karıştırmak için dikkatli olmak,% 8 BSA üstüne ayrışmış hücre süspansiyonu Katman. 5 dakika 1.000 rpm'de santrifüj.
- Her bir lamel merkezinde silindir klonlama otoklav 6 mm x 8 mm yerleştirin. Lameller tamamen kuru olmalıdır. Aspire ve 440 ul sıcak büyüme ortamı pelletini. 20 dakika boyunca inkübatör nöronal süspansiyon ve yer ile silindirler klonlama doldurun.
- Klonlama silindirleri kaldırmak ve çok nazikçe enkaz silsin. Her yemeğin wi doldurunbüyüme ortamı, 2 ml th. Herhangi bir tahlilleri gerçekleştirilir önce hücreler, en az 1 saat boyunca geri izin verin.
6. MPD Görüntüleme için hazırlık
- 121 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 2 mM CaCI2, 0.1 mM MgCI2, 1.2 mM MgSO 4, 0.97 mM K 2 HPO 4, 0.23 mM KH 2 PO 4, 5 mM NaHCO 3 ve 25 mM kapsayan kayıt çözüm olun hepes. PH'ı 7.4 'e ayarlayın.
- Istenilen düşük glukoz test solüsyonu (0.1-2.0 mM glikoz) yapmak için glikoz eklenmektedir. İyice karıştırın ve 400 ml düşük glukoz kayıt çözümü saklıdır. 2.5 mM glükoz çözeltisi kayıt yapmak ve iyice karıştırmak için geri kalan 600 ml glikoz eklenmektedir.
- Mümkün olduğunca ışıktan boya koruyun. Mavi MPD şişeye oda sıcaklığında 4 ml tampon ekleyin. İyice karıştırın ve ml kayıt çözümü başına 5 ul boya ekleyin. Çözeltilerin arasında pipet ile karıştırılarak homojen bir çözelti tutun. Floresan boya m içermektedirdepolarizasyon ile hücreleri girin ve moleküllerin söndürücü, hangi hücre zarı geçemez olecules. Alikotlar -20 ° C'de saklanır ve 4 gün içinde kullanılabilmektedir. Donma-çözülme etmeyin kereden fazla.
- 30 dakika boyunca 34 ° C 'de 2.5 mM glukoz kayıt çözeltisi artı boyanın 2 ml hücreleri inkübe edin. Kuru bir ısıtma bloğu kullanılabilir. Işıktan koruyun.
- 2.5 mM ve 0.1 mM kayıt çözümleri artı boya ile şırınga pompaları ve perfüzyon sistemi hazırlayın. 60 ml şırınga Boru bir manifolda bağlı olmalıdır.
- Manifoldunda anahtarlama çözümleri önce 10 sn şırınga basınç birikmesini önlemek için ~ herhangi bir pompa durdurulduktan sonra, bekle. Basınç değişiklikleri görüntülerin deney ve bozulma sırasında mikroskop odak değişikliklere neden olan, nöron içeren kapalı bölmeye akışkan teslim değiştirebilir.
- Manifold çıkış boru, bir hat-içi ısıtıcı ve bir kapalı bölmeye bağlanır sonra polietilen boru, bağlı olmalıdır. Kabarcıklar temizlenmiş olmalıdır ve perfüzyon hızı 0.5 ml / dk 'olarak ayarlanmalıdır. Işıktan koruyun.
- Lamel hava kabarcıkları tanıtmak için kuru ve değil izin vermemek için dikkatli olmak, kapalı odasına yapışık nöronlar ile 25 mm lamel aktarın. Kayma alt parça oluklarından hizalanır, kayıt çözeltisinin bir kaç damla tarafına yerleştirilir, ve üst parça nazikçe yerinde tutmak için lamel yerleştirilmiştir.
- Kayıt solüsyonu ile bölmeyi doldurmak ve daha sonra üstünde bir 18 mm lamel yerleştirmek için bir damlalığı kullanarak. Nazikçe yerinde tutmak için küçük bir lamel haznesine beyaz bir halka uygun. Kapalı odasına girmiş olmaktan hava kabarcıklarını engellemek için çok yavaş ve hafifçe bastırın.
- 2.5 mM glükoz kayıt çözeltisi aşağı beyaz halkası üzerinde pres için şırınga pompası başlatın ve kapalı bölmeye bağlanır. Yavaş yavaş beyaz halkadan basıncı bırakın ve bir çöp konteynerine giden boruya bağlayın.
- Düşük parlak bir alan ışık kullanılarak nöronlar Merkezlenmesi. Hücreleri ışığa maruz edilmektedir süreyi en aza indirmek için deneyin.
- Perfüzyon sistem sıcaklığı, odak stabilizasyonu için izin vermek için 10 dakika boyunca çalışması ve denge boya izin verin.
- Emişli ederken, MetaMorph programı açmak ve nöronların parlak bir alan görüntüsü (10X) alır. Floresan görüntülerin 3 yığınlarını (150 msn'den, Dar Cy3 filtresi, 10X) almak ve 5 mikron içinde odak belirlemek için Otomatik Odaklama işlevini kullanın. 10 dk hazırlama süresinin sonunda, bir kez daha odağı kontrol.
- 40 dakika boyunca floresan görüntüleri her 30 sn kayıt başlar. 10 dakika süre ile 2.5 mM glukoz ile bir taban çizgisi oluşturulması, daha sonra 15 dakika boyunca glikoz azaltmak ve son olarak 15 dakika boyunca 2.5 mM glikoz geri dönün. Çözümler, bir şırınga pompası durdurma 10 sn bekliyor, manifoldu üzerinde bir port dönüm, ve başka bir şırınga pompası başlayarak değiştirilir. Değişiklikler öncesinde istenilen zaman puan ba gerçekleşmesi gerektiğinimanifoldu ve hücreler arasındaki gecikme üzerine sed.
- Tüm floresan görüntüleri kaydettikten sonra, nöronların parlak bir alan görüntü almak.
8. MPD Görüntü Analizi
- Deneyin sonunda alınan parlak saha görüntüdeki her hücrede yaklaşık oval bölgeleri oluşturmak için MetaMorph kullanın. Bölgeler her bir nöron biraz daha büyük olması ve hücrenin karanlık kenarının dışında 1 piksel yapılabilir. , Sağlıksız örtüşen veya enkaz yakın hücreleri seçmeyin. Sağlıksız hücreler genellikle koyu görünür. Son olarak, arka plan ölçümleri için hiçbir hücreleri veya enkaz olan yerlerde 5 büyük oval bölgeler oluşturmak.
- Tüm floresan görüntüleri bölgeleri aktarın ve hiçbir hareket / vardiya oluştu doğrulamak için inceleyin. Excel dosyasındaki tüm görüntüler için her bölgenin floresan yoğunluğu kaydetmek için Tedbir işlevini kullanın. Metamorph Dergilerin kullanılması tavsiye edilir.
- Excel'de, her fluoresc için 5 plan bölgelerin ortalama oluşturmakKBB görüntü. Bu, her bir zaman noktasında ortalama arka zemin değerini temsil eder. Her resim / zaman noktası için, tüm bölge ölçümlerden arka plan çıkarmak. Arka plan çıkarılır bundan sonra flüoresan yoğunluğu Yoğunluk olarak adlandırılacaktır.
- Her bir hücre için, kayıt 2-8 dakika boyunca ortalama yoğunluk hesaplanır. Bu, 2.5 mM glikoz hücrenin Temeli temsil eder. Her tedavi her iki ucuna bir 2 dakika tampon gürültüyü en aza indirmek için kullanılır.
- Her bir hücre için, başlangıçtan itibaren yüzde değişimi hesaplamak: (Yoğunluk-Baseline) / Baseline
- Zamana karşı başlangıca göre yüzde değişikliği ile bir çizgi grafiği oluşturur.
- Dakika 18-23 esnasında başlangıca ortalama değişim yüzde hesaplayın. Dakika 35-40 esnasında başlangıca ortalama değişim yüzde hesaplayın. Görüntü işleme kullanılmaz birlikte, gürültü her bir hücre bölge içinde yoğunluğunun ortalama alma, arka plan çıkarma, ve 5 dakika boyunca o bölge yoğunluk değerleri ortalaması yoluyla indirgenirr artık.
- 2.5 mM glükoz kayıt solüsyonu 2.5 mM glukoz kayıt çözeltisi ile değiş tokuş edildiği Kontrol deneyleri gürültü eşiğini belirlemek için gerçekleştirilmelidir. En az 6 yemekler ve 3 farelerde dakika 18-23 esnasında başlangıca ortalama değişim yüzde hesaplayın. Bu değerlerin ortalama ve standart sapma belirleyin.
- Ortalama artı 2 standart sapma olumlu depolarizasyon yanıt eşik ayarlayın. Ortalama + 2 standart sapma, p <0.05 olan bir farka karşılık gelir. Bizim kontrol deneyleri, uygun eşik değer olarak başlangıca% 10 değişim gösterdi.
- Her bir hücre için, 2 kriterlere dayalı olarak tersinir depolarizasyon yanıtını değerlendirmek. İlk olarak, 18-23 dakika boyunca taban hattından ortalama yüzde değişiklik,% 10'dan daha fazla, daha önceki adımda belirlenen eşik olmalıdır. İkinci olarak, 35-40 dakika boyunca taban hattından ortalama yüzde değişiklik daha az olan ortalama yüzde değişikliği yarısından olmalıdır18-23 dakika boyunca bazal. Bu glutamat veya KCl ile uyarılması daha sıkı olduğu saptandı beri ikinci kriter seçildi. Azalmış glikoz verdikleri yanıtlara geri dönüşümlü olmasa bile sağlıksız nöronlar genellikle glutamat veya KCl ile uyarılmaya cevap.
- Her yemeğin, depolarize nöronların% hesaplamak. Bu değer, farklı tedavi grupları arasında GI nöronların% ölçmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hipotalamik uzak diğer alanlardan VMH kesin diseksiyon tutarlı sonuçlar elde etmek için önemlidir. Diğer alanların dahil hesaplanan depolarize nöronların% değişen VMH nöron popülasyonu seyreltik olabilir. Ayrıca, glikoz algılama nöronlar gibi VMH glikoz algılama nöronlardan işlevsel ve mekanistik farklılıklar olabilir yan hipotalamus, hipotalamik ve diğer bölgelerde belirlenmiştir. 1 Uygun diseksiyon için doğru anatomik konumlarını göstermektedir Şekil. Yukarıdaki protokol izlenerek, doğru VMH bölgesini içeren beyin dokusu ayrışmış edilebilir. Her subpopülasyonu tamamını korurken hassas, vmn ve ARC ayırmak için daha fazla diseksiyon, mümkün olmayabilir. Şekil 2. Sağlıklı bir örnek VMH nöronlar ayrışmış gösterir. İmmunositokimyayı kullanarak, bizim hazırlık>% 90 nöronal olduğunu doğruladı. Sadece sağlıklı nöronlar veri Analy için kullanılmalıdırçok sağlıksız nöronlar ile sis ve yemekleri atılmalıdır. Sağlıksız Nöronlar sık sık, çok koyu kenarlara sahip büyük ölçüde MPD'yi sürebilir ve düzensiz şekiller var. Buna ek olarak, nöronlar en nöronlar kayıt sırasında birbirine değmeyen böyle bir yoğunlukta kaplama olmalıdır. Analiz için seçilen nöronlar diğer hücreleri veya artıkları temas edilmemelidir.
Bir GI nöron ve nonGI nöronun kayıtları elde edilen veriler, Şekil 3 'de gösterilmiştir. 10 dakika boyunca bir taban çizgisi elde edildikten sonra, hücre dışı glükoz 2.5-0.1 mM düşürülmüştür. GI nöron taban hattından% 10 değişim, önceden belirlenmiş eşik değerinden daha büyük olan bir sağlam tersinir tepkisini gösterir. Floresanstaki artış, depolarizasyon yansıtır. GE nöron hiperpolarizasyon tepkileri ayrıca tespit edilir ise, frekans glikoz algılama nöronun bu alt tip üzerinde bu tekniğin başarıyla kullanımı için (<% 1 nöronlar) çok düşüktür. Fizyolojik glucos bir dizie düşüş test edildi ve geri çevrilebilir şekilde depolarize VMH nöronların yüzdesi, her bir tabak için hesaplandı. Şekil 4, bir pozitif ilişki glikoz azalma ve nöronlar depolarize yüzdesinin büyüklüğü arasında mevcut olduğunu gösterir. Bu yetişkin murin nöronların başarılı bir primer kültür yetişkin VMH GI nöronların çalışmaya olanak sağlamak için floresan görüntüleme ile bağlantılı olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 1. Doğru VMH diseksiyon için işaretleri ile koronal bölümünde. Disseke doku diğer hipotalamus alanlarda minimal kirlenme ile vmn ve ARC içerir. Çapraz kesimler ~ 25-30% üçüncü ventrikül üst altında yapılmalıdır için ~ korteks hipotalamik alan (mavi *) buluştuğu nokta ve üçüncü ventrikül arasında% 25-30(3V). Fare Beyin Bregma-1.7mm karşılık -2.8 mm Paxinos ve Watson 1998 9. Bregmadan uyarlanmış büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Bir yetişkin fare sağlıklı VMH nöronların aydınlık görüntü. Bu görüntü ayrışma 24 saat sonra alındı ve MPD görüntüleme için kullanılmıştır. Olur (mavi *) veya (kırmızı x) analizi için kullanılacak olmaz işaretlenmiş nöronların birkaç örnek. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
FŞEKIL 3. Bir GI nöronun (yeşil hat) ve bir nonGI nöron (turuncu hat) Temsilcisi MPD floresan izleri. Hücreler 15 dakika ve bir 0.1 mm G için bir düşüş ardından 10 dakika süreyle 2.5 mM glikoz (G) kayıt çözümü ile perfüze edildi 15 dakika boyunca 2.5 mM G dönün. GI nöron, başlangıca yüzde değişim 0.1 mM G perfüzyon süre (20-25 dk% 40 ortalama) döneminde% 10'dan fazla artmış ve daha az 2.5 mM G ters döneminde (15 bu artışın yarısından düşmüştür 35-40 dk% ortalama). resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Tersine çevrilebilir floresan MPD görüntülemesi kullanılarak taranabilir azalmış glikoz cevap olarak depolarize VMH yetişkin nöronların yüzdesi. Apozitif bir ilişki glikoz azalması ve nöronlar depolarizan yüzdesi büyüklüğü arasında var. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetişkin farelerden alınan nöronların aktivitesini incelemek mümkün olmanın anahtarı sağlıklı nöronlar ayırmak için yeteneğidir. Yetişkin farelerden hipotalamus nöronları ayrışması, çocuk farelerden nöronların kıyasla protokolde çeşitli önemli adımlardan daha zordur. Biz, bir dizi yolla, bu sorunun üstesinden gelmiştir. 500 um kalınlığında Beyin dilimleri yapmak küçük farelerden alınan beyin dokusu için kullanılan olağan 250-350 um dilimleri ile karşılaştırıldığında nöronlara mekanik hasarı en aza indirir. Ancak, daha kalın dilimler kardiyak perfüzyon ve beyin dokusunun papain sindirimi daha fazla dikkat gerektirir. Kan beyin dokusu üzerinde görülürse, sağ atrium kesim ve sol ventrikül yerleştirilen iğne hassasiyet ve yerleştirme değerlendirir. Akış oranı ve perfüzyon çözeltisi miktarı da ayarlanabilir. Kan nöronlar için zehirlidir ve sağlıklı nöron daha düşük bir verimi ile sonuçlanır çünkü ayrıntılı bir perfüzyon şarttır. Papain sindirim izin vermek için yeterince verimli olmalıdıryumuşak bir toz haline getirme ve beyin dokusundan tek hücreler kolayca serbest bırakılması için. Büyük doku parçaları ikinci triturasyonun sırasında mevcut olduğunda VMH doku sindirim sonunda hızla lavabolar ve zaman verimsiz papain sindirim şüpheleniliyor. Iyi bir sindirim ile, doku parçaları ancak üçüncü toz haline getirme esnasında çıplak gözle tespit edilir. Tritürasyon yumuşak değilse, nöronal sağlık yaşayacaktır. Verimsiz bir papain sindirim şüphelenildiğinde, papain konsantrasyonu, 5 U / ml ile arttırılabilir ya da papain yeni bir şişe kullanılabilir. Bu nöronal sağlığını bozabilir Bununla beraber, papain konsantrasyon 30 U / ml 'nin üzerinde yüksek olmamalıdır.
BSA için maruz protokolde başka önemli adımdır. Sonra hücreler, toz haline zaman nöronların miktarı BSA maruz kalan ve BSA pelet ile en aza düşürülmesi gerekmektedir kalmasına izin miktarı, hem BSA gradyanı üzerinde santrifüj edilmiştir. Süpernatan ve BSA gradyansantrifüj döneminden sonra hemen aspire edilmelidir. Vakumlu emme yüzer çoğunluğu kaldırmak için kullanılabilir, ancak hücre topağı kesintiye değildir, böylece, son ~ 100 ul bir pipetle manuel temizlenmelidir. Sağlıklı nöronlar elde diğer önemli yönü hücre yoğunluğunu optimize etmektir. Kaplama Nöronlar çok seyrek olarak sağlıklı değildir. Bu kadar az nöronlar her fare beyninden elde edilen bu yana, kaplama önce hücreleri saymak için pratik değildir. Sayma harcanacak süre boyunca, hücrelerin önemli bir bölümü plastik bağlı olacaktır ve kayıp olacaktır. Bir başlangıç noktası olarak, fare başına 4 yemekler (1 x 10 ~ 4 hücre / ml) kullanarak, yemekler sayısı deneysel tespiti en iyi nöron yoğunluğu elde etmek için en pratik bir yaklaşımdır. Büyük farelerden VMH nöronların verimi genç farelerde olan verimin yaklaşık yarısı olması beklenebilir. Nöron verimi artırmak için daha fazla sorun giderme kalan nöronların miktarının içerirayrışma protokolün her adımında ağır nöronal yıpratma adımları belirlemekte.
Bizim protokolü kullanarak, sağlıklı ayrışmış nöronlar 2-3 güne kadar kültür yaşayabilir. Ancak, süzülmüş astrosit klimalı büyüme medya kullanımı nöronlar kültür 2 hafta kadar hayatta kalmak için izin verir. Büyüme medya gecede birleşen birincil astrositlerde üzerinde kuluçkaya tarafından şartlandırılmış olabilir. Aynı kemirgen soyu, cinsiyet, ve beyin bölgesinden Astrositler kullanılmalıdır. Astrosit koşullu ortamın kullanımı bir değişkeni devreye sokabilir birlikte, bu değişiklik kültürde daha fazla zaman gerektiren başka uygulamalar için gerekli olabilir. Ayrıca, net değil nedenlerden dolayı, biz glikoz anlamda yeteneği kolayca glutamat gibi diğer uyaranlara tepkiler bakım rağmen, optimal nöronal sağlığı ile kayıp olduğunu bulduk. Böylece, ek dikkat edilmelidir. Azalmış glikoz nöronal tepkiler gözlemlemek için, contaminati önlemek için zorunludurilgili bakteriler tarafından, kalıp, tuzları, sabun, ve glukoz yer alır. Tüm cam ve steril olmayan plastikler iyice dH 2 O. ile yıkanmalıdır Kirleticiler yaşayan Ayrıca, deterjanlar ve tuzları nöronal bütünlüğünü ve etkinliğini etkileyecek. Glikoz Küçük miktarlarda önemli glukoz konsantrasyonları değişebilir. Glikoz algılama nöronlar 0.1-2.5 mM 10,11 nonhyperglycemic fizyolojik aralığında dışı glikoz küçük değişikliklere çok duyarlı olduğu için bu sonuçlar bozacaktır.
Tedavi grupları arasında MPD görüntüleme, tutarlılık ve yan-yana deneyler kullanarak zaman anlamlı sonuçlar için hayati önem taşımaktadır. Mümkün olan ya da en azından on gün alternatif ise farklı tedavi grupları aynı gün içinde test edilmelidir. Bu kültür, preparasyonlar ya da MPD alikolar içinde olası varyasyonları en aza indirir. Ayrıca, yukarıda belirtilen görüntüleme nedenlerle nöron ayrıştırma 24 saat içinde gerçekleştirilir zaman meydana gelir, en az bir varyasyon bulundu. Sonuçlar yanaVMH diseksiyon ve nöronal hazırlık nöronlar, doğruluk ve tutarlılık depolarizan bir% olarak incelendiğinde de önemlidir. Hasat genel VMH nöronal nüfus sabit olmalı ve diğer bölgelerden nöronlar içermemelidir. Bu nedenle, yukarıdaki protokol yakın ve hassas takip edilmelidir. Alternatif deneyler yapılması ve nüfus bakım bir endişe değil, ancak doku yumruklama VMN veya ARC nöronların izole etmek için yapılabilir.
Burada açıklanan yöntemler bir yetişkin fare ve nasıl glukoz algılama nöronların çalışma MPD görüntüleme kullanmak sağlıklı VMH nöronlar nasıl hasat kurmak. Bunun yerine, deneyler glukoz değişiklikleri dışındaki uyaranlara VMH nöronal yanıtları incelemek için tasarlanmış olabilir. Alternatif olarak, ayrıştırma protokolü diğer beyin bölgelerinde hasat nöronların ekstrapole edilebilir. Erişkin farelerden elde edilen nöronlar kullanarak, çalışmalar artık yaş ya da ilerleme geliştirmek kemirgen hastalık modellerinin kullanılması ile gerçekleştirilebilir. Moreover, sağlıklı yetişkin nöronların, bundan başka, kalsiyum görüntüleme, elektrofizyoloji, tek hücreli PCR, immunositokimya veya bu tekniklerin bir kombinasyonu gibi MPD görüntüleme başka teknikleri kullanılarak incelenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
| Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
| Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
| Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
| 25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
| 18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Razor blade | VWR | 55411 | |
| Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
| Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
| Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
| DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
| cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
| In-line heater | Warner | SF-28 | |
| Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
| Closed chamber | Warner | RC-43C | |
| Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
| Microscope | Olympus | BX61 WI | used with 10X objective |
| Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
References
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
- Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
- Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
- Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
- Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
- Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th edn, Academic Press. (1998).
- Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
- Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).
