Summary
تشكل الأورام الدبقية الخبيثة مجموعة غير متجانسة من الأورام الدبقية عالية التسلل ذات السمات السريرية والجزيئية المتميزة. الزينوغرافتات التقويمية الأولية تلخص السمات النسيجية والجزيئية للأنواع الفرعية الخبيثة من الورم الدبقي في نماذج الحيوانات قبل السريرية.
Abstract
تشكل الأورام الدبقية الخبيثة مجموعة غير متجانسة من الأورام الدبقية عالية التسلل ذات السمات السريرية والجزيئية المتميزة. الزينوغرافتات التقويمية الأولية تلخص السمات النسيجية والجزيئية للأنواع الفرعية الخبيثة من الورم الدبقي في نماذج الحيوانات قبل السريرية. ولنمذجة الأورام الدبقية الخبيثة من الدرجتين الثالثة والرابعة لمنظمة الصحة العالمية في مقايسات الزرع، يتم نقل الخلايا السرطانية البشرية إلى موقع تقويم العظام، الدماغ، للفئران المنافضة للمناعة. على النقيض من xenografts الثانوية التي تستخدم الخلايا السرطانية المستزرعة ، يتم فصل خلايا الورم الدبقي البشري عن العينات المستئصالة وزرعها دون مرور مسبق في زراعة الأنسجة لتوليد xenografts الأولية. الإجراء في هذا التقرير تفاصيل إعداد عينة الورم، وزرع داخل الجمجمة في الفئران منقوصة المناعة، ورصد لengraftment الورم وحصاد الورم لتمرير لاحقة إلى الحيوانات المتلقية أو التحليل. يتطلب إعداد الخلايا السرطانية ساعتين وتتطلب العملية الجراحية 20 دقيقة /.
Introduction
الأورام الدبقية الخبيثة هي أورام الدبقية الأولية في الجهاز العصبي المركزي التي تحدث في الدماغ وأحيانا في الحبل الشوكي. تصنف منظمة الصحة العالمية الأورام الدبقية وفقا للتشابه النسيجي مع الخلايا الفلكية أو أوليغودندروسيتوس أو الخلايا النعجلية ثم يتم تصنيفها رقميا (من الأول إلى الرابع) للسمات المرضية للأورام الخبيثة. الأنواع الفرعية الهسولوجية الأكثر شيوعا هي السيتوسيتوماس، الأورام الأوليغوديندروغليوماس والقلة المختلطة. وتتميز الأورام الدبقية الخبيثة التي تشمل الصفوف من الثاني إلى الرابع لمنظمة الصحة العالمية بالنمو الغازي والتكسير إلى العلاجات الحالية. في كل عام في الولايات المتحدة ، يتم تشخيص ما يقرب من 15750 شخصا بورم جلي خبيث ويستسلم ما يقدر ب 12740 مريضا لهذا المرض. وتسلط هذه الإحصاءات الضوء على الطبيعة الفتاكة بشكل خاص للأورام الدبقية الخبيثة والحاجة الهامة إلى تعزيز الفعالية العلاجية.
نماذج السرطان ضرورية للتحقيق في بيولوجيا الورم والعلاجات. خطوط الخلايا السرطانية البشرية تمثل خطوة أولى هامة للتلاعب في المختبر وفي دراسات فيفو xenografting (xenografts الثانوية)1. ومع ذلك, الثقافات الخلايا السرطانية القياسية الخضوع التحول phenotypic وجنوتيبيك2-4 التي قد لا تكون استعادة في xenografts الثانوية5. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تضيع التغيرات الجينية مثل إيزوقراطيات ديهيدروجيناز(IDH)الطفرات6،مجموعات الخلايا الجذعية متميزة7 والاعتماد على مسارات الإشارات الرئيسية8 في ثقافات الخلايا السرطانية. يمكن الحفاظ على ملامح الجينوم إلى حد أفضل في ثقافة مجال السرطان، على الرغم من أنها لا تزال تفشل في مرآة تماما النمط الجيني للأورام الأولية2،3. زرع العظام المباشر ينفي تأثيرات الثقافة في المختبر ، ويوفر بيئة دقيقة مناسبة ، ويحافظ على سلامة الخلايا التي تبدأ الورم9،10. لذلك، xenografts الأولية تمثل نموذجا قويا ووثيقة الصلة قبل السريرية لاختبار دقيق العوامل المستهدفة للمساعدة في التصميم العقلاني للتجارب السريرية في المستقبل5،11،12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد تعليق الخلايا السرطانية
ملاحظة: مطلوب موافقات مؤسسية مناسبة لاستخدام مواد المريض والحيوانات لإنشاء وصيانة الأورام الدبقية العظام الأولية xenografts. في المركز الطبي لجامعة فاندربيلت، يتم جمع مواد الورم التي تم استئصالها التي تتجاوز تلك المطلوبة لأغراض التشخيص بموافقة المريض على مستودع أنسجة البحث. يتم تسمية العينات برقم قاعدة بيانات REDcap عشوائي مكون من 5 أرقام ويتم إزالة جميع المعرفات الخاصة بالمرضى. تحتوي قاعدة بيانات REDcap على بيانات سريرية غير محددة لكل عينة في مستودع الأنسجة تشمل الجنس والعمر (بالسنوات) والعرق وحالة البقاء على قيد الحياة وعلم الأمراض وعلاجات السرطان وسنة استئصال الأنسجة ووقت التقدم. للحفاظ على العقم وتحسين نجاح الطريقة xenograft الأولية، وينبغي تجميع جميع الكواشف، والأدوات الجراحية البخار autoclaved، وموقع الجراحية أو إعدادها مقدما.
ملاحظة: عينات الورم الدبقي غالبا ما تحتوي على كميات كبيرة من المايلين والحطام. اعتمادا على حجم العينة، قد يكون من الضروري استخدام أكثر من 4 أنابيب الانحدار متقطعة لإزالة كافية من المايلين والحطام.
ملاحظة: يتم الانتهاء من العملية عندما لا يكون هناك، أو القليل، واضحة للعيان الأنسجة غير المرتبطة المتبقية. تجنب إدخال فقاعات أثناء عملية التحويم.
ملاحظة: قابلية البقاء على قيد الخلية بعد الانفصال عادة ما تكون >90٪. قد تعكس القدرات السفلية العديد من المتغيرات بما في ذلك مناولة الأنسجة دون المستوى الأمثل أو وقت النقل من غرفة العمليات ، أو طريقة حفظ التبريد ، أو تقنية انفصال الباباين. ومع ذلك، قد تظل القدرات الخلوية المنخفضة كافية، طالما أنه قد يتم زرع عدد كاف من القدرات القابلة للحياة في الحجم المناسب. لكل فأر، يتم زرع 50،000-200،000 خلايا قابلة للحياة في حجم 2 ميكرولتر. بسبب طرف مشطوف من إبرة المحاقن, إضافية 5 ميكرولتر تعليق الخلية ينبغي أن تدرج في المجلد النهائي لضمان أن المواد الكافية يمكن استخلاصها إلى حقنة لكل حقنة. على سبيل المثال، لحقن 2 ميكرولتر/فأرة ل 5 فئران، يجب أن يكون الحجم النهائي 15 ميكرولتر (15 ميكرولتر = (5 × 2 ميكرولتر) + 5 ميكرولتر).
- ضع مواد المريض التي تم إعادة تحديدها حديثا في حاوية معقمة مغطاة على الجليد لنقلها إلى المختبر. معالجة العينة مباشرة لزرع أو cryopreserve العينة في النيتروجين السائل (انظر أدناه) لتخزينها في النيتروجين السائل والاستخدام في وقت لاحق.
- إعداد حلول الفصام papain (محلول papain، غسل / محلول مثبطات البروتيز ومحلول التدرج متقطعة) في غطاء محرك السيارة معقمة مع مكونات عدة والتعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. تسمية عقيمة 15 مل أنابيب البوليسترين المخروطية وتوزيع الحلول على النحو التالي:
- أنبوب 1: 5 مل من محلول الباباين
- أنبوب 2: 3 مل من محلول مثبط الغسيل / البروتيز
- أنابيب 3-6: 5 مل كل من محلول التدرج متقطعة
- ضع عينة الورم الدبقي في الأنبوب 1 مع 5 مل من محلول الباباين والتريتورات مع ماصة 5 مل على مدى فترة زمنية تتراوح بين 10 و 20 دقيقة.
- ماصة المواد صعودا وهبوطا 10 مرات ومن ثم احتضان المواد لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة قبل بدء الدورة التالية من التحيب.
- ضع طرف ماصة 5 مل أقرب إلى الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي مع كل دورة من التريتوريشن بحيث يقوم الطرف بلمس الجزء السفلي من الأنبوب للدورتين الأخيرتين.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × غرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة supernatant وماصة بيليه صعودا وهبوطا 10x في 3 مل من محلول مثبط غسل / بروتياز.
- طبقة بعناية حجم متساو من التعليق على كل من حلول التدرج 5 مل متقطعة (أنابيب 3-6)، مع مجموعة ماصة في "الجاذبية" الاستغناء عن السرعة.
- ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي مجهز بدوار دلو متأرجح، مع تقليل سرعة التسارع إلى أدنى إعداد وإيقاف تشغيل الفرامل. جهاز طرد مركزي عند 76 x g لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. مع إيقاف تشغيل الفرامل، يتم الانتهاء من الطرد المركزي بشكل عام بعد 20 دقيقة.
- إزالة supernatant، resuspend والجمع بين كل بيليه في 5 مل من محلول الملح المتوازن العقيم ووضع الخلايا على الجليد.
- إزالة جزء (10-100 ميكرولتر) من تعليق الخلية وتحديد كثافة الخلايا القابلة للحياة عن طريق استبعاد الأزرق تريبان مع مقياس الدم.
- جهاز طرد مركزي عند 300 × ز لمدة 5 دقائق. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في كثافة 25،000-125،000 خلايا قابلة للحياة لكل ميكرولتر.
- نقل حجم كاف من تعليق الخلية إلى أنبوب 200 ميكرولتر من أجهزة الطرد المركزي (أنبوب PCR) ووضعه على الجليد.
2. إعداد موقع الجراحة والأدوات
ملاحظة: يتم ارتداء قفازات جراحية معقمة أثناء العملية. اعتمادا على متطلبات كل مؤسسة، قد تكون هناك حاجة إلى العباءات الجراحية والقبعات وحراس الوجه.
- إعداد مقاعد البدلاء تطهيرها لجراحة القوارض مع المناطق المجاورة منفصلة لإعداد الحيوانات، ومجال التشغيل واستعادة الحيوانات.
- تعقيم الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف البخار. في وقت لاحق، استخدم معقم حبة ساخنة لأدوات فلاش تعقيم عند الانتقال من واحد يخضع إلى آخر.
3. التعريفي، التخدير، والتسكين
ملاحظة: تتطلب العمليات الجراحية التي تتجاوز 15 دقيقة من وقت تخدير الفئران مصدرا للحرارة. لمنع انخفاض حرارة الجسم ، يتم تزويد الفئران بمصدر حراري (بطانية الماء الساخن المتداولة) خلال فترات ما قبل وبعد الجراحة.
- إعداد كوكتيل الكيتامين / xylazine للتخدير التعريفي بحيث يتلقى كل فأر الكيتامين 100 ملغ / كغ وإكسيلازين 10 ملغ / كغ عن طريق حقن 10 ميكرولتر من الكوكتيل لكل غرام من وزن الجسم.
-
الجدول 1 - الجداول كوكتيل التخدير.
تركيز المخزون حجم التحضير ل فأرة واحدة خمسة فئران عشرة فئران الكيتامين 100 ملغم/مل 25 ميكرولتر 125 ميكرولتر 250 ميكرولتر زيلازين 100 ملغم/مل 2.5 ميكرولتر 12.5 ميكرولتر 25 ميكرولتر ملحية متساوية 223 ميكرولتر 1,113 ميكرولتر 2,225 ميكرولتر مجموع 250 أول 1250 ميكرولتر 2500 ميكرولتر - إعداد محلول الكيتوبروفين للتسكين عن طريق تمييع محلول المخزون (10 ملغم / مل) 1:20 في الماء العقيم الخالي من البيوجين بحيث يتلقى كل فأر جرعة من 5 ملغم / كجم عن طريق حقن 10 ميكرولتر من المحلول لكل غرام من وزن الجسم.
- وزن وتسجيل الوزن قبل الجراحة. تختلف أوزان الماوس الفردية، ولكن تتراوح عموما من 18-22 غرام.
- حقن 10 ميكرولتر من كوكتيل الكيتامين / xylazine لكل غرام من وزن جسم الماوس في الفضاء داخل الصفاق مع حقنة الأنسولين. على سبيل المثال، حقن 200 ميكرولتر ل 20 غرام الماوس.
- تحديد ما إذا كان يتم تخدير الماوس بالكامل عن طريق قرصة إصبع القدم من الساق الخلفية. يستغرق عموما 3-5 دقيقة للفأرة لم يعد الانسحاب من قرصة.
- حقن 10 ميكرولتر من محلول الكيتوبروفين لكل غرام من وزن جسم الماوس تحت الجلد في الجلد فضفاضة من الجناح مع حقنة الأنسولين. على سبيل المثال، حقن 200 ميكرولتر ل 20 غرام الماوس.
- حلق الشعر على الجمجمة مع المقصات، فرك فروة الرأس المكشوفة مع بوفيدوني اليود باستخدام قضيب طرف القطن ومن ثم مسح لوحة الكحول. كرر هذه الخطوات، فرك بوفيدوني اليود ومسح الكحول، مرتين أخريين.
- تطبيق مرهم العيون على عيون الماوس.
- جعل شق خط الوسط 1 سم تمتد من وراء الأذنين إلى فقط أمام العينين مع شفرة مشرط معقمة.
- ضع الماوس تحت نطاق تشريح وكشف الجمجمة لتحديد خطوط خياطة. باستخدام حركات دائرية مع الحفر، مركز حفرة بور 2.5 ملم الجانبي إلى bregma و 1 مم الخلفي إلى خياطة التاجية.
4. زرع داخل الجمجمة
ملاحظة: قد تكون أحجام الحقن التي تتجاوز 2.5 ميكرولتر قاتلة للفئران.
- ضع الماوس على إطار مجسم عن طريق ربط القواطع العلوية فوق شريط القواطع وتطبيق مشبك الأنف بحيث يتم تثبيت الجمجمة بقوة في وضع محايد.
- رسم 5-10 ميكرولتر من الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق صعودا وهبوطا عدة مرات في حقنة هاملتون 10 ميكرولتر فرضت في حامل التحقيق من المتلاعب مجسمة لخلط التعليق والقضاء على فقاعات. الاكتئاب المكبس بحيث يتم تحميل المحقنة مع 2 ميكرولتر (حجم كاف لحقن واحد).
- اسحب الحافة الجانبية لشق الجلد لكشف ثقب التجشؤ ، ومع المايكرومانيبولاتور ، أدخل الإبرة في ثقب التجشؤ بحيث يكون الجزء المشمل أسفل سطح الجمجمة مباشرة.
- تقدم الإبرة 3 مم ثم سحب الإبرة 0.5 ملم لخلق مساحة للحقن.
- تقدم المكبس ببطء أكثر من 30 ثانية ثم السماح للإبرة بالبقاء في الدماغ لمدة 2 دقيقة إضافية. سحب الإبرة تدريجيا عن طريق الصعود 0.5 ملم والانتظار لمدة 30 ثانية إضافية قبل إزالة الإبرة من الدماغ.
- قم بإزالة الماوس من الإطار المجسم وإغلاق الجرح باستخدام مشبك تلقائي.
- ضع الماوس على لوحة الاحترار للحفاظ على درجة حرارة الجسم ورصد مستمر لنمط التنفس ولون الأغشية المخاطية والأنسجة المكشوفة (باطن القدمين).
- ضع الماوس في قفص معقم للميكروسولاتور بمجرد تعافيه بالكامل من التخدير (القص والمسكن) ، وإعادته إلى منشأة سكن الحيوانات.
5. رعاية الحيوان بعد الزرع والمراقبة
ملاحظة: المؤشر الأكثر موثوقية من ورم الحرمان والنمو المتسلل هو تدريجي, فقدان الوزن المستمر يرافقه تطوير الموقف حدب ومعطف الشعر الخام. في حالات نادرة ، لوحظ العجز العصبي التي تشمل ترنح ، عسر القراءة ، والنوبات. xenografts الأولية Orthotopic الغازية للغاية وتتطور على مدى فترة طويلة من الزمن. الفئران عادة ما تظهر أعراض نمو الورم 3-6 أشهر بعد زرع.
- مراقبة الفئران مع xenografts orthotopic يوميا لتناول الطعام والماء، والسلوك، والاستمالة، وعلامات العدوى في موقع شق.
- إعطاء الكيتوبروفين (5 ملغم/كغ تحت الجلد، 1-2x في اليوم) إذا لوحظ الألم أو الضيق بعد الجراحة.
- إزالة القطع التلقائية بعد 8-10 أيام من الجراحة.
- وزن الفئران أسبوعيا.
- مراقبة علامات وأعراض ورم النغر.
6. حصاد الورم
ملاحظة: بهذه الطريقة، تحتوي الشريحة التاجية الأولى (#1) على الجانب الخلفي من المصابيح الشمية والجانب الأمامي من الفصوص الأمامية. الورم المحتقن هو الأكثر وفرة في نصف الكرة الأيمن من الشرائح التاجية 3 اللاحقة (شريحة #2، #3، #4) ويتم احتواء مشهد الحقن بشكل روتيني في شريحة تاجية #3. اعتمادا على الاحتياجات التجريبية، يمكن استخدام المواد لمرور الورم، وأقسام الأنسجة المجمدة، والفورماتين الثابتة البارافين أقسام الأنسجة المضمنة، وتدفق قياس الخلايا من الأنسجة المفككة، وزراعة الخلايا أو ال ليسات للحمض النووي، الحمض النووي الريبي، أو تحليل البروتين. أجزاء من الورم قد تكون cryopreserved للاحتياجات المستقبلية مع صلاحية الخلية تتراوح بين 80-95٪.
- قتل الفئران عن طريق التعرض لفترات طويلة لثاني أكسيد الكربون تليها خلع عنق الرحم.
- قطع رأس الفئران القتل الرحيم في قاعدة الدماغ (مستوى ماغنوم foramen) مع زوج أكبر من مقص الجراحية، وسحب الجلد من شق إلى الأمام لفضح الجمجمة تماما.
- أزل الدماغ
- إدراج طرف واحد من زوج من مقص الجراحية الجميلة في الجانب الجانبي من ماغنوم foramen إلى مستوى اللحم السمعي الخارجي الأيسر لقطع العظام القذالي على طول الجانب الأيسر من الجمجمة. تنفيذ نفس القطع على الجانب الأيمن.
- قطع العظام القذالي على طول الطائرة التاجية من واحد اللحم السمعي الخارجي إلى الآخر وإزالة العظام لفضح المخيخ.
- قطع لوحات العظام الأنفية بين العينين.
- قطع خياطة القوس عن طريق قطع الخلفي على طول خياطة القوس من لوحات العظام الأنفية إلى bregma. إكمال شق خط الوسط على طول خياطة القوس عن طريق قطع الأمامي من لامبدا إلى bregma.
- إدراج بعناية غيض من زوج من ملقط غرامة على طول فتحة القوس على كل جانب لتمزيق أي التصاق دورال الجمجمة إلى الدماغ ومن ثم قشر نصفي الجمجمة أفقيا لفضح الدماغ والمصابيح الشمية الظهرية.
- الشريحة ملقط بين الجانب البطيني من المصابيح الشمية والجمجمة لتحرير أي التصاقات.
- إمالة الجمجمة مرة أخرى للسماح للدماغ أن يتراجع بحيث يتم الكشف عن الأعصاب البصرية وغيرها من الجمجمة. قطع الأعصاب القحفية لإطلاق الدماغ في طبق يحتوي على برنامج تلفزيوني معقم.
- نقل الدماغ مع ملعقة وزنها إلى تقطيع مصفوفة وتوليد شرائح تاجية 2 ملم مع شفرات الحلاقة.
- ترتيب شرائح التاجية في طبق يحتوي على برنامج تلفزيوني عقيم لمزيد من التفتيش البصري ومعالجة الأنسجة مزيد من.
7. إعادة تثبيت التبريد الورم
- إعداد حل المخزون من متوسطة التبريد.
- إضافة 50 مل من الملحق الانتشار, 5 مل من 100x البنسلين والعقدية الحل, و 450 ميكرولتر من 0.2٪ الهيبارين إلى 450 مل من المتوسط القاعدي.
- تخزين الأسهم الحل في 4 °C محمية من الضوء.
- إعداد حل عملي للوسط التبريد.
- الجمع بين 47.5 مل من متوسط التبريد و 2.5 مل من DMSO معقمة في أنبوب مخروطي البولي بروبلين 50 مل وتخلط جيدا.
- Aliquot 1.0 مل من حل العمل لكل cryovial وتخزينها في 4 درجة مئوية محمية من الضوء.
- ضع شريحة إكليلية واحدة مقاس 2 مم من الدماغ الزينوغرافت في وسط التبريد الذي يحتوي على التبريد على الجليد.
- غطاء بإحكام القارورة ووضعها في حاوية تجميد في -80 درجة مئوية. نقل cryovial في اليوم التالي إلى خزان النيتروجين السائل لتخزين أطول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم زرع خلايا الورم الدبقي المفككة مباشرة في أدمغة الفئران المنافرة المناعية للحصول على خطوط زينوغرافت تقويم العظام الأولية. يتم تعيين كل عينة ورم عدد عشوائي قبل زرعها، كجزء من عملية إلغاء تحديد هوية لإزالة المعلومات الصحية المحمية. نحن نستخدم رقم قاعدة بيانات REDcap مكون من 5 أرقام لهذا الغرض. يوضح الشكل 1 العملية والتسميات لإنشاء خط xenograft من الورم الأرومي الدبقي (GBM 17182) مع إيزوسيترات ديهيدروجيناز 1 (IDH1) طفرة أرجينين 132 إلى الهستيدين (R132H). بعد زرع يتم إضافة "X" إلى رقم تحديد الورم للدلالة على الورم xenografted، تليها "P" لتتبع رقم المرور. P0 يعين المتلقي زرع الأولية وP1 يعين الفئران المتلقية من مرور xenograft الأولى. عادة ، يتم زرع 3-5 فئران في البداية لإنشاء خط ثم يتم تمرير الورم xenografted إلى 10 فئران متلقية (P1) لتوسيع الخط للدراسات المستقبلية.
بعد زرع العظام، يتم مراقبة الفئران المتلقية لعلامات وأعراض زراعة الورم والنمو. المؤشر الأكثر حساسية من ورم الحرمان هو فقدان الوزن كبيرة ومستمرة. كما يتم زرع الفئران في سن مبكرة، ومن المتوقع زيادة الوزن بعد الجراحة. قد تتقلب أوزان الماوس بطريقة مثيرة على ما يبدو من أسبوع إلى أسبوع ، ولكن الخسارة المستمرة لأكثر من 3 غرام هي عموما مؤشر جيد على إصابة الورم. عادة، معظم الفئران في فوج xenograft تطوير فقدان الوزن على مدى فترة مماثلة من الزمن تتراوح بين قصيرة مثل 60 يوما إلى ما يصل إلى 350 يوما اعتمادا على الورم. متوسط أوقات البقاء على قيد الحياة لورم معين هي عموما مماثلة من مرور إلى مرور عندما يتم زرع نفس العدد من الخلايا السرطانية في كل مرة. يتضح في الشكل 2 هو مجموعة من 5 فئران زرعها مع GBM (17182XP2) التي كانت قد تم سابقا engrafted ومرور مرة واحدة من قبل. أظهرت أربعة من الفئران الخمسة 17182XP2 فقدان الوزن كبيرة بعد 17 أسبوعا من زرع. الماوس المتبقي (الماوس 3) لم يحمل فقدان الوزن ولم يتم الكشف عن أي ورم في فحص ما بعد الوفاة، مما يشير إلى رعي الورم في 80٪ فقط من المتلقين.
عندما يتم حصاد دماغ فأر أعراض ، مصفوفة تقطيع الدماغ هي أداة قيمة للغاية لمعالجة الأنسجة. يسمح توليد أقسام متعددة ومحددة تشريحيا من كل دماغ بأنماط متعددة من التحليل مع بعض الأجزاء والتبريد لأجزاء أخرى من الأنسجة. على سبيل المثال، يمكن تقييم الحالة الطفرية ل IDH1 من خلال تسلسل سانجر بمواد من جزء أو كيمياء مناعية مع جزء آخر(الشكل 3). قد يكون من الواضح بسهولة ورم عن طريق الفحص البصري للأقسام التاجية، ومع ذلك، قد تكون هناك حاجة الأنسجة مع الكيمياء المناعية لبعض xenografts (الشكلين 4 و 5). عند فصل xenograft للمرور التسلسلي أو دراسات أخرى، فمن المهم أن تبدأ مع جزء صغير ومحدد من المواد بحيث المايلين والحطام قد تكون إزالة كافية(الشكل 6). التدرج المتقطع لنظام فصل باباين هو الأنسب لمعالجة أجزاء صغيرة من دماغ فأر بالغ. نوصي بقطع كل قسم إكليلي على طول خط الوسط واستخدام تدرجين متقطعين لكل نصف.
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 يتم إنشاء خطوط xenograft تقويم العظام الأولية عن طريق زرع خلايا الورم الدبقي المفككة مباشرة في أدمغة الفئران المنافرة المناعية ومن ثم توسيعها عن طريق زرع المسلسل. تحدث الطفرات الجسدية Heterozygous في أرجينين 132 من جين IDH1 في أكثر من 70٪ من الخلايا الفلكية المنتشرة ، وoligodendrogliomas ، والأوليجوستروستوما والأورام الأرومية الثانوية ، وأقل من 7٪ من الأورام الأرومية الدبقية الأولية. GBM 17182 يحتوي على طفرة IDH1 الأكثر شيوعا، أرجينين 132 إلى الهستيدين (R132H). انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم تظهر منحنيات النمو لمستلمي زراعة الأعضاء المتسلسلين من GBM 17182XP1 فقدان الوزن بشكل كبير بعد 130-150 يوما من الجراحة في 4 من فئران GBM 17182XP2 5. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن Heterozygous، الجسدية IDH1 R132H طفرة في ورم المريض (GBM 17182) وxenograft الأولية (17182XP0) يمكن الكشف عنها عن طريق تسلسل سانجر أو تلطيخ الأجسام المضادة. الكيمياء المناعية مع الأجسام المضادة IDH1 R132H محددة يدل على خلايا الورم الدبقي متحولة تتجمع بكثافة حول الأوعية الدموية أو في مناطق أكثر تسللت منتشر من عينة المريض والدماغ الماوس. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال xenografts orthotopic الأولية عرض النمو المتسلل للغاية التي قد يكون من الصعب أن نقدر تماما من قبل hematoxylin وeosin (H &؛ E) تلطيخ وحدها. الكيمياء المناعية مع الأجسام المضادة الخاصة بالإنسان هي طريقة مفيدة بشكل خاص لتحديد الخلايا البشرية المحدقة. تلطيخ الفيمنتين المضاد للإنسان من أوليغوستروسيتوما الشرج (14175XP2) يكشف عن ملامح نموذجية من الورم الدبقي المتسلل مع كتلة الورم المنتشر في نصف الكرة الأيمن المحقون والنمو الغازي على طول مساحات myelinated من كالوسوم الجسم (النجمة) والألياف striatopallidal (رؤوس الأسهم السوداء) ونشر leptomeningeal (السهم الأسود). لا يقدر في هذا التكبير (1.25X) هو تجميع الخلايا السرطانية البشرية حول الخلايا العصبية الماوس (الساتيلية الغشاء البولي) في القشرة الغازية. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم تحليل الأقسام الإكليلية 14175XP2 الشرج في قوة أعلى (40X) في المناطق محاصر A-C يكشف IDH الخلايا البشرية المتحولة حول الأوعية الدموية (المنطقة A)، في مساحات striatopallidal ("ألياف قلم رصاص؛" المنطقة B) و كالوسوم الجسم (المنطقة C). كما هو الحال مع GBM 17182XP2، IDH1 R132H تلطيخ أوليغوستروسيتوما اللاتنسجي 14175XP2 يدل على أن يتم الحفاظ على طفرة IDH في xenograft orthotopic الأولية بعد مقاطع تسلسلية في الفئران المتلقية. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 يمكن تمييز الخلايا السرطانية البشرية عن خلايا الماوس في الزينوغرافتات المفككة بناء على الحجم. لقياس الخلايا السرطانية البشرية في xenograft فصل للمرور التسلسلي، يتم تحديد الخلايا البشرية في مقياس الدم تحت المجهر الخفيف من حجمها الكبير والتلألؤ الأخضر الداكن (رؤوس الأسهم). بواسطة قياس التدفق الخلوي، الخلايا البشرية لها خصائص مبعثرة متميزة من مواد الماوس ويمكن بوابات لمزيد من التحليل. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوط الخلايا المستزرعة، xenografts والفئران المعدلة وراثيا هي الطرق الأكثر شيوعا لنمذجة الأورام الدبقية، وهناك فوائد والقيود المتميزة لكل نظام نموذج3،13،14. وتشمل الفوائد ذات الصلة من الأورام الدبقية العظام الأولية xenografts النمو المتسلل الذي يطبع الأورام الدبقية المنتشرة والاحتفاظ بالتغيرات الوراثية وآليات الإشارات الهامة التي يمكن أن يكون من الصعب للغاية للحفاظ على في خلايا الورم الدبقي المستزرعة. على سبيل المثال، أناsocitrate dehydrogenase الطفرات وسونيك القنفذ ليغاند الإنتاج يمكن الحفاظ عليها في xenografts orthotopicالأولية 15،16 ولكن نادرا ما في خلايا الورم الدبقي المستزرعة14،17-19. من المهم النظر في عيوب كبيرة من xenografts تقويم العظام الأولية، ومع ذلك، اعتمادا على الاحتياجات التجريبية. على الرغم من الوصول إلى المواد الكافية للمريض، فمن الأصعب قياس نمو الورم الدبقي مع مرور الوقت في الدماغ مما هو عليه في موقع النظائر. بالإضافة إلى ذلك، تنمو xenografts تقويم العظام الأولية بمعدل أبطأ بكثير من xenografts النظائرية. وبالتالي قد يفضل المحققون زرع الخلايا في جناح فأر مناعي ، حيث يمكن أيضا الاحتفاظ بالميزات النسيجية والجزيئية الهامة4.
اثنين من الاعتبارات الهامة لإنشاء xenografts تقويم العظام الأولية هي نوع من المتلقي الماوس منقوص المناعة ودرجة الورم الدبقي الخبيث. كان لدينا نجاح محدود للغاية إنشاء xenografts الأولية في الفئران اللامائية (nu-nu) ونجاح جيد على قدم المساواة مع NOD / SCID وNSG(NOD /SCID / Interleukin-2 مستقبلات gmmaسلسلة ناقصة) الفئران. فئران NSG هي أفضل المتلقين بسبب زيادة معدل الحرمان من الخلايا السرطانية وعمر أطول بالمقارنة مع الفئران NOD / SCID20,21. وفيما يتعلق بدرجة الأورام في منظمة الصحة العالمية، لاحظنا ورما دبقيا في أورام الصفين الثالث والرابع ولكن ليس الصفين الأول والثاني.
بالنسبة للأورام الدبقية التقويمية الأولية ، يمكن زرع الخلايا السرطانية المنفصلة مباشرة في أدمغة الفئران المناقبة9 أو قد تكون الخلايا التي تبدأ الورم معزولة في المستقبل (على سبيل المثال عن طريق اختيار الخلايا المعبرة عن CD133)لزرعها 22. أي مصدر من الخلايا هو مناسبة لنجاح ورم engraftment في تجربتنا15,16, على الرغم من أن استخدام الخلايا CD133 المخصب يتطلب المزيد من المواد بدءا. سواء كان إعداد خلايا مفروزة أو غير مفروزة لزرعها ، فمن المهم إزالة المايلين والحطام بشكل كاف من عينات الورم الدبقي المفككة. الفشل في إزالة المايلين والحطام بشكل كاف يعوق بشكل ملحوظ القدرة على سحب التعليق إلى حقنة هاملتون وزرع عدد موحد من الخلايا في كل متلقي. بعد انفصال الباباين، من المفيد تقييم اليكوت صغير باستخدام مقياس الدم من أجل تحديد عدد أنابيب الانحدار المتقطعة التي ستكون مطلوبة للقضاء على المايلين والحطام بما فيه الكفاية. الإزالة الكاملة غير ممكنة ، ولكن يمكن للمرء أن يكتسب تقديرا لصعوبة تحديد الخلايا في عينة مفككة قبل إزالة المايلين والسهولة النسبية بعد الإزالة مع التدرجات الانقطاعية.
يمكن أن يكون العائد من الخلايا القابلة للحياة من عينات المريض فصل متغير للغاية. على النحو الأمثل، يتم زرع10 5 خلايا في كل من الفئران المتلقية الخمسة على الرغم من أننا قد حصلت على engraftment مع عدد قليل من الخلايا / الحيوان 3000. وقد عانى ما يقرب من نصف عينات الورم الدبقي الخبيثة الأولية (الصفان الثالث والرابع من منظمة الصحة العالمية) التي زرعناها في 40-100٪ من الفئران المتلقية الأولية. بعد زرع العظام، يجب وزن الفئران المتلقية أسبوعيا ومراقبتها بانتظام بحثا عن علامات وأعراض إصابة الورم ونموه. تظهر xenografts التقويمية الأولية نموا منتشرا وتسلليا ، ولا يلاحظ وجود أعراض عصبية بؤرية مثل التهاب الهيميباريسي أو النوبات إلا في مناسبات نادرة. المؤشر الأكثر حساسية من ورم engraftment هو فقدان الوزن كبيرة ومستمرة التي قد تكون مصحوبة بتطوير الموقف حدب، معطف الشعر الخام أو الجمجمة القبة. معدل الفئران التي تتطور فقدان الوزن المستمر متغير للغاية اعتمادا على عينة المريض ويمكن أن تتراوح بين 60-350 يوما. فئران NSG تزن عادة 18-25 غرام في زرع وتحقيق أوزان الكبار بعد الجراحة من 28-33 غرام. وينبغي تغيير مواد الفراش بانتظام لأن ظروف القفص قد تغير الأوزان الحيوانية إلى حد كبير. قد تتقلب أوزان الحيوان بمقدار غرام من أسبوع إلى آخر ، وتحديد ما إذا كان هذا يمثل رعي الورم يمكن أن يكون صعبا. مؤشر جيد على ورم في الفئران NSG التي حققت أوزان الكبار هو فقدان الوزن المستمر من أكبر من 3 غرام. على الرغم من أن الفئران المحفورة عادة ما تتطور فقدان الوزن التدريجي الذي يمكن قياسه على مدى فترة عدة أسابيع ، في بعض الأحيان قد تنخفض صحة الحيوان بسرعة بسبب نمو الورم ، بعد تطور استسقاء الرأس على سبيل المثال ، أو لأسباب لا علاقة لها مثل العدوى.
بعد القتل الرحيم ، قد لا يكون رعي الورم واضحا بسهولة من خلال الفحص الإجمالي للدماغ وتأكيد الهسهولوجي ضروري. بالنسبة لمتلقي الورم الأوليين ، نعالج كل دماغ بنفس الطريقة بحيث يتم تقييم جزء واحد من الناحية النسيجية ويتم تقديم أجزاء أخرى لمرور الورم اللاحق إذا تم التحقق من الحرمان. كما هو موضح أعلاه، يتم وضع الدماغ في مقسم شرائح مصفوفة لتوليد شرائح تاجية 2 مم مع كل شريحة تمثل منطقة محددة من الدماغ على طول المحور الأمامي إلى الخلفي. يتم إصلاح شريحة #3 التاجية ، والتي تحتوي بشكل روتيني على موقع الحقن ، في الفورمالين ويتم وضع كل من الشرائح المتبقية في وسيلة منفصلة ، وصفت بالتبريد تحتوي على 1 مل من وسط التبريد. فالشرائح المثبتة بالبارافين (FFPE) ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوسين لتقييم الأنسجة والأجسام المضادة ضد Ki67 والفيمنتين البشري لتصور الخلايا المحفورة.
بمجرد التحقق من الإصابة بالورم ، قد يتم تمرير الورم ومعدلات الحرمان في المتلقين الثانويين عادة ما تكون أعلى بنسبة 80-100٪. نوصي بتمرير ورم في المرة الأولى في عدد أكبر من الفئران المتلقية بحيث يمكن توليد مواد كافية للكريوبريفي للحفاظ على خط ورم معين عند الممر المنخفض (2-5) للدراسات المستقبلية. متوسط أوقات البقاء على قيد الحياة لورم معين هي عموما مماثلة من مرور إلى مرور عندما يتم زرع نفس العدد من الخلايا السرطانية في كل مرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
نحن مدينون بشكل خاص للمرضى في المركز الطبي لجامعة فاندربيلت الذين قدموا مواد بحثية لا تقدر بثمن لبنك الأنسجة العصبية الجزيئية. نشكر أولئك الذين أنشأوا وحافظوا على بنك الأنسجة، وريد C. طومسون MD (المحقق الرئيسي)، تشيريل كينارد RN (ممرضة أبحاث) ولاري أ. بيرس MS (مدير). تم تنفيذ الخدمات النسيجية ، جزئيا ، من قبل المركز الطبي لجامعة فاندربيلت (VUMC) الموارد المشتركة في علم الأمراض الترجمي (بدعم من الجائزة 5P30 CA068485 لمركز فاندربيلت إنغرام للسرطان). وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح قدمت إلى MKC من صناديق التنمية NINDS (1R21NS070139) وصندوق بوروز ويلكوم وصناديق التنمية VMC. ويدعم MKC من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى، إدارة صحة المحاربين القدامى، مكتب البحث والتطوير، البحوث والتطوير مختبر الطب الحيوي من خلال منحة 1 I01 BX000744-01. ولا تمثل المحتويات آراء وزارة شؤون المحاربين القدماء أو حكومة الولايات المتحدة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nat. Rev. 6, 425-436 (2006).
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
