Summary
Maligne gliomer udgør en heterogen gruppe af stærkt infiltrerende glial neoplasmer med forskellige kliniske og molekylære træk. Primære ortopiske xenografter opsummerer de histopatologiske og molekylære træk ved ondartede gliomundertyper i prækliniske dyremodeller.
Abstract
Maligne gliomer udgør en heterogen gruppe af stærkt infiltrerende glial neoplasmer med forskellige kliniske og molekylære træk. Primære ortopiske xenografter opsummerer de histopatologiske og molekylære træk ved ondartede gliomundertyper i prækliniske dyremodeller. Til model WHO kvaliteter III og IV ondartede gliomer i transplantation assays, menneskelige tumorceller er xenografted i en orthotopic site, hjernen, af immunkompromitterede mus. I modsætning til sekundære xenografts, der bruger dyrkede tumorceller, er humane glioma celler dissociated fra resected prøver og transplanteret uden forudgående passage i vævskultur til at generere primære xenografts. Proceduren i denne rapport detaljer tumor prøve forberedelse, intrakraniel transplantation i immunkompromitterede mus, overvågning for tumor engraftment og tumor høst for efterfølgende passage i recipient dyr eller analyse. Tumor celle forberedelse kræver 2 timer og kirurgisk procedure kræver 20 min / dyr.
Introduction
Maligne gliomer er primære glia tumorer i centralnervesystemet, der forekommer i hjernen og lejlighedsvis rygmarven. Gliomer er klassificeret af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) i henhold til histologiske lighed med astrocytter, oligodendrocytter eller ependymale celler og derefter numerisk klassificeret (I til IV) for patologiske træk ved malignitet. De mest almindelige histologiske undertyper er astrocytomas, oligodendrogliomas og blandede oligoastrocytomas. Maligne gliomer, der omfatter WHO-kvaliteter II til IV, er kendetegnet ved invasiv vækst og genstridige til nuværende behandlingsformer. Hvert år i USA, ca 15.750 personer er diagnosticeret med en ondartet gliom og en anslået 12.740 patienter bukke under for denne sygdom. Disse statistikker fremhæver den særligt dødelige karakter af ondartede gliomer og det vigtige behov for øget terapeutisk effekt.
Kræft modeller er afgørende for at undersøge tumor biologi og behandlinger. Humane kræftcellelinjer udgør et vigtigt første skridt for in vitro-manipulationer og in vivo xenograftingstudier (sekundære xenografts)1. Men, standard kræft cellekulturer gennemgå fænotypiske og genotypiske transformation2-4, der ikke kan genoprettes i sekundære xenografts5. Desuden kan genetiske ændringer såsom isocitrat dehydrogenase (IDH) mutationer6, forskellige stamcellepopulationer7 og afhængighed af centrale signalveje8 gå tabt i kræftcellekulturer. Genomiske profiler kan opretholdes i bedre grad i kræft sfære kultur, men stadig undlader at spejle fuldt ud genotype af primære tumorer2,3. Direkte ortopisk transplantation negerer indflydelsen fra in vitro-kulturen, giver et ordentligt mikromiljø og bevarer integriteten af tumorinitierende celler9,10. Derfor udgør primære xenografter en kraftfuld og relevant præklinisk model til streng test af målrettede midler for at hjælpe med at designe fremtidige kliniske forsøg5,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af tumorcelle suspension
Bemærk: Der kræves passende institutionelle godkendelser til brug af patientmateriale og -dyr for at etablere og vedligeholde primære ortopiske gliom xenografter. På Vanderbilt University Medical Center indsamles resected tumormateriale, der overstiger det, der kræves til diagnostiske formål, med patientens samtykke til et forskningsvævslager. Prøverne er mærket med et randomiseret 5-cifret REDcap-databasenummer, og alle patientspecifikke identifikatorer fjernes. REDcap-databasen indeholderidentificerede kliniske data for hver prøve i vævsdepotet, der omfatter køn, alder (i år), race, overlevelsesstatus, patologi, kræftbehandlinger, resektionsår og tid til progression. For at opretholde steriliteten og optimere succesen af den primære xenograftmetode skal alle reagenser, damp autoklaverede kirurgiske instrumenter og det kirurgiske sted samles eller fremstilles på forhånd.
Bemærk: Glioma prøver indeholder ofte store mængder myelin og snavs. Afhængigt af prøvestørrelsen kan det være nødvendigt at bruge mere end 4 diskontinuerlige gradientrør for at fjerne myelin og snavs tilstrækkeligt.
Bemærk: Processen er afsluttet, når der ikke er nogen, eller lidt, tydeligt synligt uopdelt væv tilbage. Undgå indførelsen af bobler under tritureringsprocessen.
Bemærk: Celle levedygtighed efter dissociation er typisk >90%. Lavere viabilities kan afspejle mange variabler, herunder suboptimal væv håndtering eller transport tid fra operationsstuen, kryopræservering metode, eller papain dissociation teknik. Lavere cellulære viabilities kan dog stadig være tilstrækkelige, så længe et tilstrækkeligt antal levedygtige kan transplanteres i det relevante volumen. For hver mus implanteres 50.000-200.000 levedygtige celler i volumen på 2 μl. På grund af sprøjtenålens skrå spids bør der i det endelige volumen indgå yderligere 5 μl celleaffjedring for at sikre, at der kan trækkes tilstrækkeligt materiale ind i sprøjten til hver injektion. For eksempel skal det endelige volumen være 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl) for at injicere 2 μl/mus for 5 mus.
- Placer frisk resected, deidentificeret patient materiale i en steril, udjævnet beholder på is til transport til laboratoriet. Prøveemnet behandles direkte til transplantation eller kryopræserver prøven i flydende nitrogen (se nedenfor) til opbevaring i flydende nitrogen og senere brug.
- Papain-dissociationsopløsningerne (papainopløsning, vask/proteasehæmmeropløsning og diskontinuerlig gradientopløsning) fremstilles i en steril emhætte med de kitkomponenter og instruktioner, som producenten har leveret. Sterile 15 ml polystyrenkoniske rør mærkes, og opløsningerne fordeles således:
- Rør 1: 5 ml papainopløsning
- Rør 2: 3 ml vask/proteasehæmmeropløsning
- Rør 3-6: 5 ml hver af diskontinuerlig gradientopløsning
- Gliomprøven anbringes i tube 1 med 5 ml papainopløsning og triturat med en 5 ml pipette over en periode på 10-20 minutter.
- Pipetter materialet op og ned 10 gange og inkuber derefter materialet i 2-3 minutter ved stuetemperatur, før du starter den næste cyklus af trituration.
- Spidsen af 5 ml pipetten placeres tættere på bunden af konisk rør med hver triturationscyklus, således at spidsen rører bunden af røret i de sidste 2 cyklusser.
- Centrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og pelletlen pipetteres op og ned 10x i 3 ml af vaske-/proteasehæmmeropløsningen.
- Der lag forsigtigt et lige stort volumen af suspensionen over hver af de 5 ml diskontinuerlige gradientopløsninger (rør 3-6), med en pipetor indstillet til "tyngdekraften" dispenserhastighed.
- Placer rørene i en centrifuge udstyret med en svingende skovlrotor, hvor accelerationshastigheden reduceres til den laveste indstilling, og bremsen slukkes. Centrifuge ved 76 x g i 12 minutter ved stuetemperatur. Når bremsen er slukket, er centrifugering generelt afsluttet efter 20 minutter.
- Supernatanten fjernes, genbruges, og hver pellet kombineres i 5 ml steril afbalanceret saltopløsning, og cellerne anbringes på is.
- Fjern en del (10-100 μl) af celleophænget og bestemme tætheden af levedygtige celler ved trypan blå udelukkelse med et hæmocytometer.
- Centrifuge ved 300 x g i 5 min. Det supernatanten fjernes, og cellepillen genbruges med en densitet på 25.000-125.000 levedygtige celler pr. μl.
- Der overføres et tilstrækkeligt volumen af celleaffjedringen til et mikrocentrifugerør på 200 μl (PCR-rør) og anbringes på is.
2. Forberedelse af kirurgiske site og instrumenter
Bemærk: Sterile kirurgiske handsker bæres under proceduren. Afhængigt af kravene fra hver institution, kirurgiske kjoler, hætter og ansigtsbeskyttere kan være påkrævet.
- Forbered en desinficeret bordplade til gnaverkirurgi med adskilte tilstødende områder til dyreforberedelse, operationsfelt og genopretning af dyr.
- Steriliser kirurgiske instrumenter i en damp autoklave. Brug derefter en varm perlesterilisator til at flashsterilisere instrumenter, når du skifter fra et dyr, der er underlagt det næste.
3. Induktion, anæstesi og smertestillende midler
Bemærk: Operationer, der overstiger 15 minutter fra det tidspunkt, hvor musene bedøves, kræver en kontaktvarmekilde. For at undgå hypotermi er musene forsynet med en varmekilde (cirkulerende varmtvandstæppe) i præ- og postoperative perioder.
- Forbered ketamin/xylazincocktail til induktionsbedøvelse, således at hver mus modtager ketamin 100 mg/kg og xylazin 10 mg/kg ved at injicere 10 μl cocktail pr. gram kropsvægt.
-
Tabel 1. Anæstesicocktail.
Koncentration af bestanden Lydstyrke, der skal forberedes til en mus fem mus ti mus Ketamin 100 mg/ml 25 μl 125 μl 250 μl Xylazin 100 mg/ml 2,5 μl 12,5 μl 25 μl Isotonic saltvand 223 μl 1.113 μl 2.225 μl total 250 ul 1.250 μl 2.500 μl - Der fremstilles ketoprofenopløsning til analgesi ved at fortynde stamopløsningen (10 mg/ml) 1:20 i sterilt, pyogenfrit vand, således at hver mus får en dosis på 5 mg/kg ved at injicere 10 μl af opløsningen pr. gram kropsvægt.
- Veje og optage presurgisk vægt. Individuelle musevægte varierer, men varierer generelt fra 18-22 g.
- Der injiceres 10 μl af ketamin/xylazincocktailen pr. gram musekropsvægt i intraperitonealrummet med en insulinsprøjte. For eksempel injicere 200 μl for en 20 g mus.
- Bestem, om musen er helt bedøvet af tå knivspids af bagbenet. Det tager normalt 3-5 minutter for musen ikke længere at trække sig ud af klemmen.
- Der injiceres 10 μl af ketoprofenopløsningen pr. gram musekropsvægt subkutant i flankens løse hud med en insulinsprøjte. For eksempel injicere 200 μl for en 20 g mus.
- Barber hår over kraniet med klippere, skrub den udsatte hovedbund med povidone-jod ved hjælp af en bomuldsspidsapplikator og tør derefter en alkoholpude af. Gentag disse trin, povidone-jod krat og alkohol tørre, to gange mere.
- Påfør oftalmisk salve på musens øjne.
- Lav et 1 cm midterlinjeindsnit, der strækker sig fra bag ørerne til lige foran øjnene med et sterilt skalpelblad.
- Placer musen under en dissekering omfang og udsætte kraniet til at identificere sutur linjer. Brug cirkulære bevægelser med en boremaskine, centrer et burrhul 2,5 mm lateralt til bregma og 1 mm posterior til koronar suturen.
4. Intrakraniel transplantation
Bemærk: Injektionsvolumener på over 2,5 μl kan være dødelige for mus.
- Placer musen på en stereotaktisk ramme ved at tilslutte de øverste fortænder over fortænderstangen og anvende næseklemmen, så kraniet holdes fast i en neutral position.
- Træk 5-10 μl af cellerne i et mikrocentrifugerør op og ned flere gange i en 10 μl Hamilton sprøjte fastspændt i sondeholderen på den stereotaktiske manipulator for at blande suspensionen og eliminere bobler. Tryk stemplet, så sprøjten er fyldt med 2 μl (tilstrækkeligt volumen til at injicere et dyr).
- Træk den laterale kant af hudens snit for at eksponere burrhullet, og med mikromanipulatoren skal du introducere nålen i burrhullet, så den skrå del er lige under kraniets overflade.
- Fremrykke nålen 3 mm og derefter trække nålen 0,5 mm for at skabe plads til injektion.
- Fremryk stemplet langsomt over 30 sek og lad derefter nålen forblive i hjernen i yderligere 2 minutter. Træk nålen gradvist tilbage ved at stige op 0,5 mm og vente på yderligere 30 sek., før du fjerner nålen fra hjernen.
- Fjern musen fra den stereotaktiske ramme, og luk såret med en autoclip.
- Placer musen på en opvarmning pad til at opretholde kropstemperaturen og overvåge kontinuerligt åndedrætsmønster og farve slimhinder og eksponerede væv (fodsåler).
- Placer musen i et sterilt mikroisolatorbur, når den kommer sig helt fra anæstesi (sternal og ambulant), og returnere den til dyrehusfaciliteten.
5. Dyrepleje og -observation efter implantation
Bemærk: Den mest pålidelige indikation af tumor engraftment og infiltrerende vækst er gradvis, vedvarende vægttab ledsaget af udvikling af krumme kropsholdning og ru hår pels. I sjældne tilfælde bemærkes neurologiske underskud, der omfatter ataksi, parese og anfald. Ortopiske primære xenografts er meget invasive og udvikler sig over en lang periode. Mus manifesterer typisk symptomer på tumorvækst 3-6 måneder efter transplantation.
- Overhold mus med orthotopic xenografts dagligt til mad- og vandindtag, adfærd, pleje og tegn på infektion på indsnitsstedet.
- Administrere ketoprofen (5 mg/kg subkutalt, 1-2x om dagen), hvis smerte eller angst observeres postoperativt.
- Fjern autoclips 8-10 dage efter operationen.
- Vejer mus ugentligt.
- Monitor for tegn og symptomer på tumor engraftment.
6. Tumor høst
Bemærk: Ved denne metode indeholder den første korona skive (#1) det bageste aspekt af de olfaktoriske pærer og det forreste aspekt af frontallapperne. Engrafted tumor er mest rigelige i højre halvkugle af de efterfølgende 3 koronar skiver (skive #2, #3, og #4), og injektionen synet er rutinemæssigt indeholdt i koronar skive #3. Afhængigt af eksperimentelle behov, materialet kan anvendes til tumor passage, frosne væv sektioner, formalin fast paraffin indlejret væv sektioner, flow cytometri af dissociated væv, cellekultur eller lysater for DNA, RNA, eller protein analyse. Dele af tumoren kan være kryopreserveret til fremtidige behov med celle levedygtighed spænder fra 80-95%.
- Aflive mus ved langvarig udsættelse for kuldioxid efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation.
- Halshugge aflivede mus i bunden af hjernen (foramen magnum niveau) med et større par kirurgisk saks, og trække huden fra snit frem til fuldt ud at udsætte kraniet.
- Fjern hjernen.
- Indsæt en spids af par fine kirurgiske saks i lateral aspekt af foramen magnum til niveauet for venstre eksterne auditive meatus at skære occipital knogle langs venstre side af kraniet. Udfør det samme snit på højre side.
- Skær nakkebenet langs et koronaplan fra den ene eksterne auditive meatus til den anden og fjern knoglen for at udsætte lillehjernen.
- Skær næsebenspladerne mellem øjnene.
- Skær sagittal sutur ved at skære posteriorly langs sagittal sutur fra næseben plader til bregma. Komplet midterlinjen snit langs sagittal sutur ved at skære forreste fra lambda til bregma.
- Sæt forsigtigt spidsen af et fint par pincet langs sagittalåbningen på hver side for at rive enhver dural vedhæftning af kraniet til hjernen og derefter skrælle de to kraniehalvdele sideværts for at udsætte hjernen og olfaktoriske pærer dorsalt.
- Skub tangen mellem det ventrale aspekt af de olfaktoriske pærer og kraniet for at frigøre eventuelle vedhæftninger.
- Vip kraniet tilbage, så hjernen kan trækkes tilbage, så syns- og andre kranienerver udsættes. Skær kranienervene over for at slippe hjernen ud i en skål, der indeholder steril PBS.
- Overfør hjernen med en vejespatel til en matrix slicer og generere 2 mm korona skiver med barberblade.
- Arranger koronaskiverne i en skål, der indeholder steril PBS, til yderligere visuel inspektion og yderligere vævsbehandling.
7. Tumor Cryopreservation
- Forbered en lageropløsning af kryopræserveringsmedie.
- Der tilsættes 50 ml spredningstilskud, 5 ml penicillin- og streptomycinopløsning på 100x og streptomycin og 450 μl på 0,2% heparin til 450 ml basalt medium.
- Lageropløsning ved 4 °C beskyttet mod lys.
- Forbered en arbejdsopløsning af kryopræserveringsmedie.
- 47,5 ml kryopræserveringsmedium og 2,5 ml steril DMSO kombineres i et 50 ml polypropylenkonisk rør, og der blandes godt.
- Aliquot 1,0 ml arbejdsopløsning til hvert kryoovial og opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys.
- Placer en 2 mm korona skive xenografted hjerne i et kryokin indeholdende kryopræservering medium på is.
- Hætteglasset tæt og læg det i en frysebeholder ved -80 °C. Overfør kryoglen den følgende dag til en flydende nitrogentank til længere opbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dissociated glioma celler transplanteres direkte ind i hjernen hos immunkompromitterede mus for at opnå primære ortopiske xenograft linjer. Hver tumorprøve tildeles et randomiseret tal før transplantation som en del af afidentifikationsprocessen for at fjerne beskyttede sundhedsoplysninger. Vi bruger et 5-cifret REDcap-databasenummer til dette formål. Figur 1 illustrerer processen og nomenklaturen for etablering af en xenograftlinje fra et glioblastoma (GBM 17182) med isocitratdehydrogenase 1 (IDH1) mutation arginin 132 til histidin (R132H). Efter transplantation tilføjes et "X" til tumoridentifikationsnummeret for at betegne xenografted tumor, efterfulgt af et "P" for at spore passagenummeret. P0 betegner den første transplantationsmodtager, og P1 udpeger modtagermus fra den første xenograft-passage. Typisk transplanteres 3-5 mus i første omgang for at etablere en linje, og xenografted tumor sendes derefter ind i 10 modtagermus (P1) for at udvide linjen til fremtidige undersøgelser.
Efter ortopisk transplantation overvåges recipientmus for tegn og symptomer på tumor engraftment og vækst. Den mest følsomme indikation af tumor engraftment er betydelig og vedvarende vægttab. Da mus transplanteres i en ung alder, forventes postoperativ vægtforøgelse. Mus vægte kan svinge i tilsyneladende dramatisk måde fra uge til uge, men vedvarende tab på mere end 3 g er generelt en god indikation af tumor engraftment. Typisk, de fleste af musene i en xenograft kohorte udvikle vægttab over en lignende periode, der spænder fra så kort som 60 dage til så længe som 350 dage afhængigt af tumor. Median overlevelsestider for en given tumor er generelt ens fra passage til passage, når det samme antal tumorceller transplanteres hver gang. Illustreret i figur 2 er en kohorte af 5 mus transplanteret med en GBM (17182XP2), der tidligere var blevet engrafted og passeret en gang før. Fire af de fem 17182XP2 mus udviste betydeligt vægttab 17 uger efter transplantationen. Den resterende mus (mus 3) udviste ikke vægttab, og der blev ikke opdaget tumor ved obduktion, hvilket indikerer tumorindskrivning hos kun 80% af modtagerne.
Når hjernen hos en symptomatisk mus høstes, er en hjerneskærermatrix et ekstremt værdifuldt værktøj til vævsbehandling. Generering af flere, anatomisk definerede sektioner fra hver hjerne giver mulighed for flere former for analyse med nogle portioner og kryopræservering af andre dele af vævet. For eksempel kan mutationsstatus for IDH1 vurderes ved Sanger sekventering med materiale fra en portion eller immunohistochemistry med en anden (Figur 3). Tumor engraftment kan være let synlige ved visuel inspektion af koronar sektioner, men histologi med immunohistochemistry kan være påkrævet for nogle xenografts (Figur 4 og 5). Når du tager afstand fra en xenograft til seriel passage eller andre undersøgelser, er det vigtigt at starte med en lille og defineret del af materialet, så myelin og snavs kan fjernes tilstrækkeligt (Figur 6). Den diskontinuerlige gradient af Papain Dissociation System er bedst egnet til behandling af små portioner af en voksen musehjerne. Vi anbefaler at skære hver koronasektion langs midterlinjen og bruge to diskontinuerlige stigninger for hver halvdel.
Figur 1. Primære ortopiske xenograftlinjer etableres ved at transplantere dissociated glioma celler direkte ind i hjernen hos immunkompromitterede mus og derefter udvidet ved seriel transplantation. Heterozygotiske somatiske mutationer ved arginin 132 af IDH1-genet forekommer i mere end 70% af diffuse astrocytomer, oligodendrogliomer, oligoastrocytomas og sekundære glioblastomas og mindre end 7% af primære glioblastomer. GBM 17182 indeholder den mest almindelige IDH1 mutation, arginin 132 til histidin (R132H). Klik her for at se større billede.
Figur 2. Vækstkurver af seriel transplantation modtagere af GBM 17182XP1 demonstrere betydelige vægttab 130-150 dage efter operationen i 4 af 5 GBM 17182XP2 mus. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Heterozygotiske, somatiske IDH1 R132H mutation i patienten tumor (GBM 17182) og primære xenograft (17182XP0) kan påvises ved Sanger sekventering eller antistof farvning. Immunhisokemi med et IDH1 R132H-specifikt antistof demonstrerer mutante gliomceller tæt grupperet omkring blodkar eller i mere diffust infiltrerede områder af patientprøven og musehjernen. Klik her for at se større billede.
Figur 4. Primære ortopiske xenografter udviser meget infiltrerende vækst, som kan være vanskelig at fuldt ud at forstå ved hematoxylin og eosin (H &E) farvning alene. Immunhisokemi med et menneskespecifikt antistof er en særlig nyttig metode til at identificere engraferede menneskelige celler. Anti-human vimentin farvning af en analplastisk oligoastrocytoma xenograft (14175XP2) afslører typiske træk ved en infiltrerende gliom med en diffus tumormasse i den injicerede højre halvkugle og invasiv vækst langs myelinerede skrifter af corpus callosum (stjerner) og striatopallidal fibre (sorte pilespidser) og leptomeningeal formidling (sort pil). Ikke værdsat på denne forstørrelse (1.25X) er klyngedannelse af menneskelige tumorceller omkring mus neuroner (perineuronal satellitose) i den invaderede cortex. Klik her for at se større billede.
Figur 5. Analyse af analplastiske oligoastrocytoma 14175XP2 koronar sektioner ved højere effekt (40X) i boxed regioner A-C afslører IDH mutant menneskelige celler omkring blodkar (region A), i striatopallidal skrifter ("blyant fibre;" region B) og corpus callosum (region C). Som med GBM 17182XP2 viser IDH1 R132H farvning af anaplastisk oligoastrocytoma 14175XP2, at IDH-mutation opretholdes i en primær ortopisk xenograft efter serielle passager hos recipientmus. Klik her for at se større billede.
Figur 6. Human tumorceller kan skelnes fra museceller i dissociated xenografts baseret på størrelse. For at kvantificere menneskelige tumorceller i en dissociated xenograft til seriel passage identificeres menneskelige celler i et hæmocytometer under lysmikroskopi ved deres store størrelse og mørkegrønne luminescens (pilespidser). Ved flow cytometry, menneskelige celler har forskellige scatter egenskaber fra musemateriale og kan gated til yderligere analyse. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dyrkede cellelinjer, xenografts og genetisk manipulerede mus er de mest almindelige metoder til modellering af gliomer, og der er forskellige fordele og begrænsninger for hvert modelsystem3,13,14. Relevante fordele ved primære ortopiske glioma xenografts omfatter infiltrerende vækst, der kendetegner diffuse gliomer og fastholdelse af genetiske ændringer og vigtige signalmekanismer, der kan være overordentlig vanskeligt at opretholde i dyrkede gliomceller. For eksempel kan isocitrat dehydrogenase mutationer og Sonic hedgehog ligand produktion opretholdes i primær orthotopic xenografts15,16, men kun sjældent i dyrkede gliom celler14,17-19. Det er vigtigt at overveje betydelige ulemper ved primære ortopiske xenografts, dog afhængigt af eksperimentelle behov. Uanset adgang til tilstrækkeligt patientmateriale er det vanskeligere at måle gliomvækst over tid i hjernen end på et heterotopisk sted. Derudover vokser primære ortopiske xenografter i et betydeligt langsommere tempo end heterotopiske xenografter. Efterforskere kan således foretrække at transplantere celler i flanken af en immunkompromitteret mus, hvor vigtige histologiske og molekylære træk også kan bevares4.
To vigtige overvejelser for etablering af primære ortopiske xenografter er typen af immunkompromitteret musemodtager og karakteren af glioma malignitet. Vi har haft stærkt begrænset succes med at etablere primære xenografts i athymiske (nu-nu) mus og lige så god succes med NOD / SCID og NSG(NOD /SCID / Interleukin-2 receptor gamma kæde mangelfuld) mus. NSG mus er at foretrække modtagere på grund af øget engraftment sats af tumorigenic celler og længere levetid i forhold til NOD / SCID mus20,21. Med hensyn til WHO tumor kvalitet, vi har observeret glioma engraftment af grade III og IV tumorer, men ikke kvaliteter I og II.
For primære ortopiske glioma xenografts kan dissociated tumorceller transplanteres direkte ind i hjernen hos immunkompromitterede mus9 eller tumor-initierende celler kan være fremadrettet isoleret (for eksempel ved at vælge CD133-udtrykkende celler) til transplantation22. Enten kilde til celler er egnet til en vellykket tumor engraftment i vores erfaring15,16, selv om brugen af CD133-berigede celler kræver mere udgangsmateriale. Uanset om du forbereder sorterede eller usorterede celler til transplantation, er det vigtigt at fjerne myelin og snavs fra dissocierede gliomprøver. Manglende tilstrækkelig fjernelse myelin og snavs markant hæmmer evnen til at trække suspensionen i en Hamilton sprøjte og transplantation et ensartet antal celler i hver modtager. Efter papain dissociation, er det nyttigt at evaluere en lille aliquot ved hjælp af en hæmocytometer med henblik på at bestemme antallet af diskontinuerlige gradient rør, der vil være forpligtet til tilstrækkeligt at fjerne myelin og snavs. Fuldstændig fjernelse er ikke mulig, men man kan få en forståelse for vanskeligheden ved at kvantificere celler i en dissociated prøve forud for myelin fjernelse og den relative lethed efter fjernelse med diskontinuerlige stigninger.
Udbyttet af levedygtige celler fra dissociated patientprøver kan være meget varierende. Optimalt transplanteres 105 celler i hver af fem recipientmus, selvom vi har fået engraftment med så få som 3.000 celler/dyr. Omkring halvdelen af de primære ondartede gliomprøver (WHO-kvaliteter III og IV), som vi har transplanteret, har indkapslet i 40-100% af de oprindelige recipientmus. Efter ortopisk transplantation skal recipientmus vejes ugentligt og overvåges regelmæssigt for tegn og symptomer på tumor engraftment og vækst. Primære ortopiske xenografter demonstrerer diffus, infiltrerende vækst og fokale neurologiske symptomer som hemiparese eller anfald observeres kun i sjældne tilfælde. Den mest følsomme indikation af tumor engraftment er betydelig og vedvarende vægttab, der kan være ledsaget af udvikling af krumme kropsholdning, ru hår pels eller kuppel kraniet. Den hastighed, hvormed mus udvikler vedvarende vægttab, er meget varierende afhængigt af patientprøven og kan variere fra 60-350 dage. NSG mus vejer typisk 18-25 g ved transplantation og opnår postoperativt voksne vægte på 28-33 g. Strøelsesmateriale bør ændres regelmæssigt, da burforholdene i betydelig grad kan ændre dyrenes vægt. Et dyrs vægte kan svinge med så meget som et gram fra den ene uge til den næste, og afgøre, om dette repræsenterer tumor engraftment kan være svært. En god indikation af tumor engraftment i NSG mus, der har opnået voksne vægte er vedvarende vægttab på mere end 3 g. Selvom engrafted mus typisk udvikler gradvist vægttab, der kan måles over en flere ugers periode, kan lejlighedsvis et dyrs helbred falde hurtigt på grund af tumorvækst, efter udviklingen af hydrocephalus for eksempel eller fra ikke-relaterede årsager som infektion.
Efter aktiv dødshjælp, tumor engraftment kan ikke umiddelbart fremgår af grov inspektion af hjernen og histologiske bekræftelse er afgørende. For indledende tumor modtagere, behandler vi hver hjerne på samme måde, således at en del evalueres histologisk og andre portioner er cryopreserved for efterfølgende tumor passage, hvis engraftment er verificeret. Som beskrevet ovenfor placeres hjernen i en matrix slicer for at generere 2 mm koronarskiver med hver skive, der repræsenterer en defineret region i hjernen langs den forreste til bageste akse. Korona skive #3, som rutinemæssigt indeholder injektionsstedet, er fastgjort i formalin og hver af de resterende skiver er placeret i en separat, mærket kryokin, der indeholder 1 ml kryopræservering medium. Formalin fast paraffin indlejret (FFPE) dias er farvet med hematoxylin og eosin at evaluere histologi og med antistoffer mod Ki67 og menneskelige vimentin at visualisere engrafted celler.
Når engraftment er verificeret, tumoren kan være passage og engraftment satser i sekundære modtagere er typisk højere på 80-100%. Vi anbefaler at passere en tumor første gang i et større antal recipientmus, så der kan genereres tilstrækkeligt kryopreserveret materiale til at opretholde en given tumorlinje ved lav passage (2-5) til fremtidige undersøgelser. Median overlevelsestider for en given tumor er generelt ens fra passage til passage, når det samme antal tumorceller transplanteres hver gang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi står især i gæld til patienter på Vanderbilt University Medical Center, der leverede uvurderligt forskningsmateriale til Molecular Neurosurgical Tissue Bank. Vi takker dem, der etablerede og vedligeholder Tissue Bank, Reid C. Thompson MD (principal investigator), Cherryl Kinnard RN (forskningssygeplejerske) og Larry A. Pierce MS (manager). Histologiske tjenester blev delvist udført af Vanderbilt University Medical Center (VUMC) Translational Pathology Shared Resource (støttet af tildeling 5P30 CA068485 til Vanderbilt-Ingram Cancer Center). Dette arbejde blev støttet af tilskud til MKC fra NINDS (1R21NS070139), Burroughs Wellcome Fund og VMC udviklingsmidler. MKC er støttet af Department of Veterans Anliggender, Veterans Health Administration, Office of Research and Development, Biomedical Laboratory Research and Development gennem tilskud 1 I01 BX000744-01. Indholdet repræsenterer ikke synspunkter Department of Veterans Anliggender eller den amerikanske regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nat. Rev. 6, 425-436 (2006).
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
