Summary
Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen.
Abstract
Kwaadaardige gliomen vormen een heterogene groep van zeer infiltratieve gliane neoplasmata met duidelijke klinische en moleculaire kenmerken. Primaire orthotopische xenograften heroveren de histopathologische en moleculaire kenmerken van kwaadaardige glioomsubtypes in preklinische diermodellen. Om who-graad III en IV kwaadaardige gliomen te modelleren in transplantatietesten, worden menselijke tumorcellen ge xenografeerd in een orthotopische plaats, de hersenen, van immuungecompromitteerde muizen. In tegenstelling tot secundaire xenograften die gekweekte tumorcellen gebruiken, worden menselijke glioomcellen gescheiden van gereseceerde monsters en getransplanteerd zonder voorafgaande passage in weefselkweek om primaire xenograften te genereren. De procedure in dit rapport beschrijft de voorbereiding van tumormonsters, intracraniële transplantatie in immuungecompromitteerde muizen, monitoring op tumorengraftment en tumoroogst voor latere passage in ontvangende dieren of analyse. Tumorcelvoorbereiding vereist 2 uur en chirurgische procedure vereist 20 minuten / dier.
Introduction
Kwaadaardige gliomen zijn primaire gliatumoren van het centrale zenuwstelsel die voorkomen in de hersenen en af en toe het ruggenmerg. Gliomen worden door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) geclassificeerd op basis van histologische gelijkenis met astrocyten, oligodendrocyten of ependymale cellen en vervolgens numeriek ingedeeld (I tot IV) voor pathologische kenmerken van maligniteit. De meest voorkomende histologische subtypes zijn astrocytomen, oligodendrogliomen en gemengde oligoastrocytomen. Kwaadaardige gliomen die WHO-klassen II tot IV omvatten, worden gekenmerkt door invasieve groei en recalcitrance voor de huidige therapieën. Elk jaar worden in de Verenigde Staten ongeveer 15.750 personen gediagnosticeerd met een kwaadaardig glioom en naar schatting 12.740 patiënten bezwijken aan deze ziekte. Deze statistieken benadrukken de bijzonder dodelijke aard van kwaadaardige gliomen en de belangrijke behoefte aan verbeterde therapeutische werkzaamheid.
Kankermodellen zijn essentieel voor het onderzoeken van tumorbiologie en therapieën. Menselijke kankercellijnen vormen een belangrijke eerste stap voor in vitro manipulaties en in vivo xenografting studies (secundaire xenograften)1. Standaard kankercelculturen ondergaan echter fenotypische en genotypische transformatie2-4 die mogelijk niet wordt hersteld in secundaire xenograften5. Bovendien kunnen genetische veranderingen zoals isocitraatdehydrogenase(IDH)mutaties6, verschillende stamcelpopulaties7 en afhankelijkheid van belangrijke signaleringsroutes8 verloren gaan in kankercelculturen. Genomische profielen kunnen in betere mate worden gehandhaafd in de kankersfeercultuur, maar weerspiegelen nog steeds niet volledig het genotype van primaire tumoren2,3. Directe orthotopische transplantatie ontkent de invloeden van in vitro kweek, zorgt voor een goede micro-omgeving en behoudt de integriteit van tumorinitiërende cellen9,10. Daarom vormen primaire xenograften een krachtig en relevant preklinisch model voor het rigoureus testen van doelgerichte middelen om te helpen bij het rationele ontwerp van toekomstige klinische proeven5,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van tumorcelsuspensie
Opmerking: Voor het vaststellen en onderhouden van primaire orthotopische glioom xenograften zijn passende institutionele goedkeuringen voor het gebruik van patiëntenmateriaal en dieren vereist. In het Vanderbilt Universitair Medisch Centrum wordt gereseceerd tumormateriaal verzameld dat hoger is dan het materiaal dat nodig is voor diagnostische doeleinden, met toestemming van de patiënt voor een onderzoeksweefselopslagplaats. Specimens worden gelabeld met een gerandomiseerd 5-cijferig REDcap-databasenummer en alle patiëntspecifieke id's worden verwijderd. De REDcap-database bevat gedeïdentificeerde klinische gegevens voor elk specimen in de weefselopslagplaats die geslacht, leeftijd (in jaren), ras, overlevingsstatus, pathologie, kankerbehandelingen, jaar van resectie en tijd tot progressie omvat. Om de steriliteit te behouden en het succes van de primaire xenograftmethode te optimaliseren, moeten alle reagentia, stoomautoclaved chirurgische instrumenten en de chirurgische site van tevoren worden geassembleerd of voorbereid.
Opmerking: Glioma-exemplaren bevatten vaak grote hoeveelheden myeline en puin. Afhankelijk van de grootte van het monster kan het nodig zijn om meer dan 4 discontinue gradiëntbuizen te gebruiken voor een adequate verwijdering van myeline en vuil.
Opmerking: Het proces wordt voltooid wanneer er geen of weinig duidelijk zichtbaar niet-gedissocieerd weefsel overblijft. Vermijd de introductie van bubbels tijdens het trituratieproces.
Opmerking: De levensvatbaarheid van cellen na dissociatie is meestal >90%. Lagere viabilities kunnen vele variabelen weerspiegelen met inbegrip van suboptimale weefselbehandeling of transporttijd van de werkende ruimte, cryopreservatiemethode, of papain dissociatietechniek. Lagere cellulaire viabilities kunnen echter nog steeds voldoende zijn, zolang een voldoende aantal levensvatbare in het juiste volume kan worden getransplanteerd. Voor elke muis worden 50.000-200.000 levensvatbare cellen geïmplanteerd in een volume van 2 μl. Vanwege de afgeschuinde punt van de spuitnaald moet een extra 5 μl celsuspensie in het uiteindelijke volume worden opgenomen om ervoor te zorgen dat voor elke injectie voldoende materiaal in de spuit kan worden getrokken. Om bijvoorbeeld 2 μl/muis voor 5 muizen te injecteren, moet het uiteindelijke volume 15 μl (15 μl = (5 x 2 μl) + 5 μl zijn.
- Plaats vers ontleed, gedeïdentificeerd patiëntmateriaal in een steriele, afgedekte container op ijs voor transport naar het laboratorium. Verwerk het monster rechtstreeks voor transplantatie of cryopreserve het monster in vloeibare stikstof (zie hieronder) voor opslag in vloeibare stikstof en later gebruik.
- Bereid de papaïnedissociatieoplossingen (papaïneoplossing, was-/proteaseremmeroplossing en discontinue gradiëntoplossing) in een steriele kap met de door de fabrikant meegeleverde kitcomponenten en instructies. Etiketeer steriele 15 ml polystyreen conische buizen en verdeel de oplossingen als volgt:
- Tube 1: 5 ml papaïneoplossing
- Tube 2: 3 ml was/proteaseremmer oplossing
- Tubes 3-6: 5 ml elk van discontinue gradiëntoplossing
- Plaats het glioommonster in buis 1 met 5 ml papaïneoplossing en trituraat met een pipet van 5 ml gedurende een periode van 10-20 minuten.
- Pipetteer het materiaal 10 keer op en neer en incubeer het materiaal vervolgens gedurende 2-3 minuten bij kamertemperatuur voordat u de volgende cyclus van trituratie start.
- Plaats de punt van de pipet van 5 ml dichter bij de onderkant van de conische buis met elke trituratiecyclus zodanig dat de punt de laatste 2 cycli de onderkant van de buis raakt.
- Centrifugeer 5 min bij kamertemperatuur op 300 x g. Verwijder het supernatant en pipetteer de pellet 10x op en neer in 3 ml van de was-/proteaseremmeroplossing.
- Leg voorzichtig een gelijk volume van de suspensie over elk van de discontinue gradiëntoplossingen van 5 ml (buizen 3-6), met een pipettor ingesteld op de "zwaartekracht" doseersnelheid.
- Plaats de buizen in een centrifuge uitgerust met een zwenkbakrotor, waarbij de acceleratiesnelheid wordt verlaagd tot de laagste stand en de rem wordt uitgeschakeld. Centrifugeer 12 min bij kamertemperatuur op 76 x g. Als de rem is uitgeschakeld, wordt de centrifugeren over het algemeen na 20 minuten voltooid.
- Verwijder het supernatant, resuspend en combineer elke pellet in 5 ml steriele uitgebalanceerde zoutoplossing en plaats de cellen op ijs.
- Verwijder een deel (10-100 μl) van de celsuspensie en bepaal de dichtheid van levensvatbare cellen door trypanblauwe uitsluiting met een hemocytometer.
- Centrifugeer gedurende 5 min. op 300 x g. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel met een dichtheid van 25.000-125.000 levensvatbare cellen per μl.
- Breng een voldoende volume van de celsuspensie over naar een microcentrifugebuis van 200 μl (PCR-buis) en plaats deze op ijs.
2. Voorbereiding van chirurgische site en instrumenten
Opmerking: Steriele chirurgische handschoenen worden gedragen tijdens de procedure. Afhankelijk van de vereisten van elke instelling kunnen chirurgische toga's, petten en gezichtsbeschermers vereist zijn.
- Bereid een gedesinfecteerde benchtop voor knaagdierchirurgie met gescheiden aangrenzende gebieden voor dierlijke voorbereiding, werkveld en dierherstel.
- Steriliseer chirurgische instrumenten in een stoomautoclaaf. Gebruik vervolgens een hete kraalsterilisator om instrumenten te flashsteriliseren bij de overgang van het ene dier naar het andere.
3. Inductie, anesthesie en analgesie
Opmerking: Operaties van meer dan 15 minuten vanaf het moment dat de muizen worden verdoofd, vereisen een contactwarmtebron. Om onderkoeling te voorkomen, worden de muizen tijdens de pre- en postoperatieve periode voorzien van een warmtebron (circulerende warmwaterdeken).
- Bereid ketamine/xylazinecocktail voor inductie-anesthesie zodat elke muis ketamine 100 mg/kg en xylazine 10 mg/kg ontvangt door 10 μl van de cocktail per gram lichaamsgewicht te injecteren.
-
Tabel 1. Anesthesie cocktail.
Voorraadconcentratie Volume om voor te bereiden één muis vijf muizen tien muizen Ketamine 100 mg/ml 25 μl 125 μl 250 μl Xylazine 100 mg/ml 2,5 μl 12,5 μl 25 μl Isotone zoutoplossing 223 μl 1.113 μl 2.225 μl totaal 250 ul 1.250 μl 2.500 μl - Bereid ketoprofenoplossing voor analgesie door de stamoplossing (10 mg/ml) 1:20 in steriel, pygeenvrij water te verdunnen, zodat elke muis een dosis van 5 mg/kg krijgt door 10 μl van de oplossing per gram lichaamsgewicht te injecteren.
- Weeg en noteer het prechirurgische gewicht. Individuele muisgewichten variëren, maar variëren over het algemeen van 18-22 g.
- Injecteer 10 μl ketamine/xylazinecocktail per gram lichaamsgewicht van de muis in de intraperitoneale ruimte met een insulinespuit. Injecteer bijvoorbeeld 200 μl voor een muis van 20 g.
- Bepaal of de muis volledig wordt verdoofd door teensnufje van het achterbeen. Het duurt over het algemeen 3-5 minuten voordat de muis zich niet meer terugtrekt uit de snuif.
- Injecteer 10 μl van de ketoprofen-oplossing per gram lichaamsgewicht van de muis subcutaan in de losse huid van de flank met een insulinespuit. Injecteer bijvoorbeeld 200 μl voor een muis van 20 g.
- Scheer haar over de schedel met tondeuses, schrob de blootgestelde hoofdhuid met povidon-jodium met behulp van een wattenstaafje applicator en veeg vervolgens een alcoholpad af. Herhaal deze stappen, povidone-jodium scrub en alcohol vegen, nog twee keer.
- Breng oogzalf aan op de ogen van de muis.
- Maak een 1 cm middellijnincisie die zich uitstrekt van achter de oren tot vlak voor de ogen met een steriel scalpelmesje.
- Plaats de muis onder een ontleedbereik en stel de schedel bloot om de hechtlijnen te identificeren. Centreer met behulp van cirkelvormige bewegingen met een boor een braamgat 2,5 mm zijdelings op de bregma en 1 mm achterste op de coronale hechting.
4. Intracraniale transplantatie
Opmerking: Injectievolumes van meer dan 2,5 μl kunnen dodelijk zijn voor muizen.
- Plaats de muis op een stereotactisch frame door de bovenste snijtanden over de snijtuitstang te haken en de neusklem aan te brengen, zodat de schedel stevig in een neutrale positie wordt gehouden.
- Trek 5-10 μl van de cellen in een microcentrifugebuis meerdere keren op en neer in een 10 μl Hamilton-spuit die in de sondehouder van de stereotactische manipulator is geklemd om de suspensie te mengen en bellen te elimineren. Druk de zuiger in zodat de spuit met 2 μl wordt geladen (het juiste volume om één dier te injecteren).
- Trek aan de laterale rand van de huidincisie om het braamgat bloot te leggen en introduceer met de micromanipulator de naald in het braamgat, zodat het afgeschuinde gedeelte zich net onder het schedeloppervlak bevindt.
- Schuif de naald 3 mm vooruit en trek vervolgens de naald 0,5 mm terug om een ruimte voor injectie te creëren.
- Schuif de zuiger langzaam op meer dan 30 sec en laat de naald vervolgens nog 2 minuten in de hersenen blijven. Trek de naald geleidelijk terug door 0,5 mm te stijgen en nog eens 30 seconden te wachten voordat u de naald uit de hersenen verwijdert.
- Verwijder de muis uit het stereotactische frame en sluit de wond met een autoclip.
- Plaats de muis op een warmhoudkussen om de lichaamstemperatuur te handhaven en controleer continu het ademhalingspatroon en de kleur van slijmvliezen en blootgestelde weefsels (voetzolen).
- Plaats de muis in een steriele microisolatorkooi zodra deze volledig herstelt van anesthesie (sternaal en ambulant) en breng hem terug naar de dierenverblijven.
5. Na-implantatie Dierverzorging en Observatie
Opmerking: De meest betrouwbare indicatie van tumorengraftment en infiltratieve groei is geleidelijk, aanhoudend gewichtsverlies vergezeld van de ontwikkeling van een gebochelde houding en ruwe haarlaag. In zeldzame gevallen worden neurologische tekorten opgemerkt, waaronder ataxie, parese en aanvallen. Orthotopische primaire xenograften zijn zeer invasief en ontwikkelen zich over een lange periode. Muizen manifesteren meestal symptomen van tumorgroei 3-6 maanden na transplantatie.
- Observeer muizen met orthotopische xenograften dagelijks voor voedsel- en waterinname, gedrag, verzorging en tekenen van infectie op de incisieplaats.
- Ketoprofen toedienen (5 mg/kg subcutaan, 1-2x per dag) als pijn of angst postoperatief wordt waargenomen.
- Verwijder autoclips 8-10 dagen na de operatie.
- Weeg muizen wekelijks.
- Controleer op tekenen en symptomen van tumorengraftment.
6. Tumor oogsten
Opmerking: Door deze methode bevat de eerste coronale plak (#1) het achterste aspect van de olfactorische bollen en het voorste aspect van de frontale kwabben. Engrafted tumor is het meest overvloedig in de rechterhersenhelft van de daaropvolgende 3 coronale plakjes (plak #2, #3 en #4) en het zicht op de injectie is routinematig opgenomen in coronale plak #3. Afhankelijk van de experimentele behoeften kan het materiaal worden gebruikt voor tumorpassage, bevroren weefselsecties, formaline vaste paraffine ingebedde weefselsecties, flowcytometrie van gedissocieerd weefsel, celkweek of lysaten voor DNA-, RNA- of eiwitanalyse. Delen van de tumor kunnen cryopreserved voor toekomstige behoeften met cel levensvatbaarheid variërend van 80-95%.
- Euthanaseer muizen door langdurige blootstelling aan kooldioxide gevolgd door cervicale dislocatie.
- Onthoofd geëuthanaseerde muizen aan de basis van de hersenen (foramen magnum-niveau) met een grotere chirurgische schaar en trek de huid van de incisie naar voren om de schedel volledig bloot te leggen.
- Verwijder de hersenen.
- Steek een punt van een fijne chirurgische schaar in het laterale aspect van het foramen magnum om het linker uitwendige auditieve meatus te egalen om het achterhoofdsbeen langs de linkerkant van de schedel te snijden. Voer dezelfde snede uit aan de rechterkant.
- Snijd het achterhoofdsbeen langs een coronaal vlak van het ene uitwendige gehoorvlees naar het andere en verwijder het bot om het cerebellum bloot te leggen.
- Snijd de neusbotplaten tussen de ogen.
- Snijd de sagittale hechting door achterstes langs de sagittale hechting van de neusbotplaten naar het bregma te snijden. Voltooi de middenlijnincisie langs de sagittale hechting door voorste van de lambda naar de bregma te snijden.
- Steek voorzichtig de punt van een fijne tang langs de sagittale opening aan elke kant om eventuele durale hechting van de schedel aan de hersenen te scheuren en pel vervolgens de twee schedelhelften lateraal om de hersenen en reukbollen dorsaal bloot te stellen.
- Schuif de tang tussen het ventrale aspect van de olfactorische bollen en de schedel om eventuele verklevingen te bevrijden.
- Kantel de schedel naar achteren zodat de hersenen kunnen worden ingetrokken, zodat de optische en andere hersenzenuwen worden blootgesteld. Snijd de hersenzenuwen door om de hersenen vrij te maken in een schaal met steriel PBS.
- Breng de hersenen over met een weegspatel naar een matrixsnijmachine en genereer 2 mm coronale plakjes met scheermesjes.
- Schik de coronale plakjes in een schaal met steriel PBS voor verdere visuele inspectie en verdere weefselverwerking.
7. Tumor Cryopreservatie
- Bereid een voorraadoplossing van cryopreservatiemedium voor.
- Voeg 50 ml proliferatiesupplement, 5 ml 100x penicilline en streptomycineoplossing en 450 μl 0,2% heparine toe aan 450 ml basaal medium.
- Bewaar de voorraadoplossing bij 4 °C beschermd tegen licht.
- Bereid een werkoplossing van cryopreservatiemedium voor.
- Combineer 47,5 ml cryopreservatiemedium en 2,5 ml steriel DMSO in een 50 ml polypropyleen conische buis en meng goed.
- Aliquot 1,0 ml werkoplossing voor elke cryoviale en bewaren bij 4 °C beschermd tegen licht.
- Plaats een 2 mm coronaal plakje xenografted hersenen in een cryovial bevattend cryopreservatiemedium op ijs.
- Sluit de flacon goed af en plaats deze in een vriescontainer bij -80 °C. Breng de cryovial de volgende dag over in een vloeibare stikstoftank voor langere opslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gedissocieerde glioomcellen worden rechtstreeks in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen getransplanteerd om primaire orthotopische xenograftlijnen te verkrijgen. Elk tumormonster krijgt voorafgaand aan de transplantatie een gerandomiseerd nummer toegewezen, als onderdeel van het deidentificatieproces om beschermde gezondheidsinformatie te verwijderen. Hiervoor gebruiken we een 5-cijferig REDcap databasenummer. Figuur 1 illustreert het proces en de nomenclatuur voor het vaststellen van een xenograftlijn van een glioblastoom (GBM 17182) met isocitraatdehydrogenase 1 (IDH1) mutatie arginine 132 tot histidine (R132H). Na transplantatie wordt een "X" toegevoegd aan het tumoridentificatienummer om xenografted tumor aan te duiden, gevolgd door een "P" om het passagenummer te volgen. P0 wijst de eerste transplantatieontvanger aan en P1 wijst ontvangende muizen van de eerste xenograftpassage aan. Meestal worden 3-5 muizen in eerste instantie getransplanteerd om een lijn vast te stellen en wordt de xenografted tumor vervolgens overgestoken naar muizen met 10 ontvangers (P1) om de lijn uit te breiden voor toekomstige studies.
Na orthotopische transplantatie worden ontvangende muizen gecontroleerd op tekenen en symptomen van tumorengraftatie en groei. De meest gevoelige indicatie van tumor engraftment is significant en langdurig gewichtsverlies. Aangezien muizen op jonge leeftijd worden getransplanteerd, wordt postoperatieve gewichtstoename verwacht. Muisgewichten kunnen van week tot week op schijnbaar dramatische wijze fluctueren, maar aanhoudend verlies van meer dan 3 g is over het algemeen een goede indicatie van tumorengraftment. Meestal ontwikkelen de meeste muizen in een xenograftcohort gewichtsverlies over een vergelijkbare periode, variërend van 60 dagen tot zo lang als 350 dagen, afhankelijk van de tumor. Mediane overlevingstijden voor een bepaalde tumor zijn over het algemeen vergelijkbaar van passage tot passage wanneer elke keer hetzelfde aantal tumorcellen wordt getransplanteerd. Geïllustreerd in figuur 2 is een cohort van 5 muizen getransplanteerd met een GBM (17182XP2) die eerder was getransplanteerd en een keer eerder was gepasseerd. Vier van de vijf 17182XP2 muizen vertoonden significant gewichtsverlies 17 weken na transplantatie. De resterende muis (muis 3) vertoonde geen gewichtsverlies en er werd geen tumor gedetecteerd bij postmortemonderzoek, wat wijst op tumorengraftment bij slechts 80% van de ontvangers.
Wanneer de hersenen van een symptomatische muis worden geoogst, is een hersensnijmatrix een uiterst waardevol hulpmiddel voor weefselverwerking. De generatie van meerdere, anatomisch gedefinieerde secties uit elke hersenen maakt meerdere analysemodi mogelijk met sommige porties en cryopreservatie van andere delen van het weefsel. De mutatiestatus van IDH1 kan bijvoorbeeld worden beoordeeld door Sanger-sequencing met materiaal uit het ene deel of immunohistochistry met een ander (Figuur 3). Tumorengraftatie kan gemakkelijk zichtbaar zijn door visuele inspectie van de coronale secties, maar histologie met immunohistochologie kan nodig zijn voor sommige xenograften (figuren 4 en 5). Bij het ontkoppelen van een xenograft voor seriële passage of andere studies is het belangrijk om te beginnen met een klein en gedefinieerd deel van het materiaal, zodat myeline en vuil voldoende kunnen worden verwijderd (figuur 6). De discontinue gradiënt van het Papain Dissociatie Systeem is het meest geschikt voor het verwerken van kleine delen van een volwassen muizenbrein. We raden aan om elk coronaal gedeelte langs de middellijn te snijden en voor elke helft twee discontinue gradiënten te gebruiken.
Figuur 1. Primaire orthotopische xenograftlijnen worden vastgesteld door gedissocieerde glioomcellen rechtstreeks in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen te transplanteren en vervolgens uit te breiden door seriële transplantatie. Heterozygote somatische mutaties in arginine 132 van het IDH1-gen komen voor in meer dan 70% van de diffuse astrocytomen, oligodendrogliomen, oligoastrocytomen en secundaire glioblastomen, en minder dan 7% van de primaire glioblastomen. GBM 17182 bevat de meest voorkomende IDH1-mutatie, arginine 132 tot histidine (R132H). Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Groeicurves van seriële transplantatieontvangers van GBM 17182XP1 tonen significant gewichtsverlies 130-150 dagen na de operatie bij 4 van de 5 GBM 17182XP2 muizen. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Heterozygote, somatische IDH1 R132H-mutatie in de patiëntentumor (GBM 17182) en primair xenograft (17182XP0) kan worden gedetecteerd door Sanger-sequencing of antilichaamkleuring. Immunohistochie met een IDH1 R132H-specifiek antilichaam toont mutante glioomcellen aan die dicht geclusterd zijn rond bloedvaten of in meer diffuus geïnfiltreerde gebieden van het patiëntmonster en de muishersenen. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Primaire orthotopische xenograften vertonen een zeer infiltratieve groei die moeilijk volledig te waarderen is door hematoxyline en eosine (H & E) vlekken alleen. Immunohistochie met een mensspecifiek antilichaam is een bijzonder nuttige methode voor het identificeren van geïmgrafeerde menselijke cellen. Anti-menselijke vimentinekleuring van een anaalplastisch oligoastrocytoom xenograft (14175XP2) onthult typische kenmerken van een infiltratief glioom met een diffuse tumormassa in de geïnjecteerde rechterhersenhelft en invasieve groei langs myelinekanalen van het corpus callosum (sterretjes) en de striatopallidale vezels (zwarte pijlpunten) en leptomeningeale verspreiding (zwarte pijl). Niet gewaardeerd bij deze vergroting (1,25X) is clustering van menselijke tumorcellen rond muisneuronen (perineuronale satellitose) in de binnengevallen cortex. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Analyse van anaalplastisch oligoastrocytoom 14175XP2 coronale secties met een hoger vermogen (40X) in verpakte gebieden A-C onthult IDH mutante menselijke cellen rond bloedvaten (regio A), in striatopallidale tractus ("potloodvezels;" regio B) en het corpus callosum (regio C). Net als bij GBM 17182XP2 toont IDH1 R132H-kleuring van anaplastisch oligoastrocytoom 14175XP2 aan dat IDH-mutatie wordt gehandhaafd in een primair orthotopisch xenograft na seriële passages bij ontvangende muizen. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 6. Menselijke tumorcellen kunnen worden onderscheiden van muiscellen in gedissocieerde xenograften op basis van grootte. Om menselijke tumorcellen in een gedissocieerd xenograft te kwantificeren voor seriële passage, worden menselijke cellen in een hemocytometer onder lichte microscopie geïdentificeerd door hun grote grootte en donkergroene luminescentie (pijlpunten). Door flow cytometrie hebben menselijke cellen verschillende scatter-eigenschappen van muismateriaal en kunnen ze worden gated voor verdere analyse. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gekweekte cellijnen, xenografts en genetisch gemanipuleerde muizen zijn de meest voorkomende methoden voor het modelleren van gliomen, en er zijn verschillende voordelen en beperkingen voor elk modelsysteem3,13,14. Relevante voordelen van primaire orthotopische glioom xenograften zijn infiltratieve groei die diffuse gliomen typeert en het behoud van genetische veranderingen en belangrijke signaleringsmechanismen die buitengewoon moeilijk te onderhouden kunnen zijn in gekweekte glioomcellen. Bijvoorbeeld, isocitraat dehydrogenase mutaties en Sonic egel ligand productie kan worden gehandhaafd in primaire orthotopische xenograften15,16 maar slechts zelden in gekweekte glioomcellen14,17-19. Het is echter belangrijk om significante nadelen van primaire orthotopische xenograften te overwegen, afhankelijk van experimentele behoeften. Ondanks de toegang tot voldoende patiëntmateriaal, is het moeilijker om de groei van glioom in de loop van de tijd in de hersenen te meten dan op een heterotopic site. Bovendien groeien primaire orthotopische xenograften aanzienlijk langzamer dan heterotopic xenografts. Zo kunnen onderzoekers er de voorkeur aan geven cellen in de flank van een immuungecompromitteerde muis te transplanteren, waar belangrijke histologische en moleculaire kenmerken ook kunnen worden behouden4.
Twee belangrijke overwegingen voor het vaststellen van primaire orthotopische xenograften zijn het type immuungecompromitteerde muisontvanger en de graad van glioommaligniteit. We hebben ernstig beperkt succes gehad met het vaststellen van primaire xenograften bij athymische (nu-nu) muizen en even goed succes met NOD / SCID en NSG(NOD /SCID / Interleukin-2 receptor gamma keten deficiënte) muizen. NSG-muizen hebben de voorkeur vanwege een verhoogde engraftmentsnelheid van tumorogene cellen en een langere levensduur in vergelijking met NOD/SCID-muizen20,21. Met betrekking tot de tumorgraad van de WHO hebben we glioom engraftment van graad III- en IV-tumoren waargenomen, maar niet de klassen I en II.
Voor primaire orthotopische glioom xenograften kunnen gedissocieerde tumorcellen rechtstreeks in de hersenen van immuungecompromitteerde muizen worden getransplanteerd9 of tumorinitierende cellen kunnen prospectief worden geïsoleerd (bijvoorbeeld door CD133-uitdrukkende cellen te selecteren) voortransplantatie 22. Beide bronnen van cellen zijn geschikt voor succesvolle tumorengraftment in onze ervaring15,16, hoewel het gebruik van CD133-verrijkte cellen meer uitgangsmateriaal vereist. Of het nu gaat om het voorbereiden van gesorteerde of ongesorteerde cellen voor transplantatie, het is belangrijk om myeline en vuil van gedissocieerde glioommonsters adequaat te verwijderen. Het niet adequaat verwijderen van myeline en vuil belemmert duidelijk het vermogen om de suspensie in een Hamilton-spuit te trekken en een uniform aantal cellen in elke ontvanger te transplanteren. Na papaïnedissociatie is het nuttig om een kleine aliquot te evalueren met behulp van een hemocytometer om het aantal discontinue gradiëntbuizen te bepalen dat nodig is om myeline en puin voldoende te elimineren. Volledige verwijdering is niet haalbaar, maar men kan een waardering krijgen voor de moeilijkheid om cellen in een gedissocieerd monster te kwantificeren voorafgaand aan myelineverwijdering en het relatieve gemak na verwijdering met discontinue gradiënten.
De opbrengst van levensvatbare cellen uit gedissocieerde patiëntmonsters kan zeer variabel zijn. Optimaal worden 105 cellen getransplanteerd in elk van de vijf ontvangende muizen, hoewel we engraftment hebben verkregen met slechts 3.000 cellen / dier. Ongeveer de helft van de primaire kwaadaardige glioommonsters (WHO-graad III en IV) die we hebben getransplanteerd, is getransplanteerd in 40-100% van de eerste ontvangende muizen. Na orthotopische transplantatie moeten ontvangende muizen wekelijks worden gewogen en regelmatig worden gecontroleerd op tekenen en symptomen van tumorengraftatie en groei. Primaire orthotopische xenograften vertonen diffuse, infiltratieve groei en focale neurologische symptomen zoals hemiparese of epileptische aanvallen worden slechts in zeldzame gevallen waargenomen. De meest gevoelige indicatie van tumor engraftment is significant en langdurig gewichtsverlies dat gepaard kan gaan met de ontwikkeling van een gebochelde houding, ruwe haarlaag of koepelvormige schedel. De snelheid waarmee muizen aanhoudend gewichtsverlies ontwikkelen is zeer variabel, afhankelijk van het patiëntmonster en kan variëren van 60-350 dagen. NSG-muizen wegen meestal 18-25 g bij transplantatie en bereiken postoperatief volwassen gewichten van 28-33 g. Strooiselmateriaal moet regelmatig worden vervangen, omdat de omstandigheden in de kooi het gewicht van dieren aanzienlijk kunnen veranderen. Het gewicht van een dier kan van de ene week op de andere met wel een gram schommelen en het kan moeilijk zijn om te bepalen of dit tumorengraftment vertegenwoordigt. Een goede indicatie van tumorengraftment bij NSG-muizen die volwassen gewichten hebben bereikt, is aanhoudend gewichtsverlies van meer dan 3 g. Hoewel geënte muizen meestal geleidelijk gewichtsverlies ontwikkelen dat over een periode van enkele weken kan worden gemeten, kan de gezondheid van een dier soms snel afnemen als gevolg van tumorgroei, na de ontwikkeling van hydrocefalie bijvoorbeeld, of van niet-gerelateerde oorzaken zoals infectie.
Na euthanasie kan tumorengraftment niet gemakkelijk zichtbaar zijn door grove inspectie van de hersenen en histologische bevestiging is essentieel. Voor initiële tumorontvangers verwerken we elk brein op dezelfde manier, zodat één deel histologisch wordt geëvalueerd en andere delen cryopreserved zijn voor daaropvolgende tumorpassage als engraftment wordt geverifieerd. Zoals hierboven besproken, worden de hersenen in een matrixsnijmachine geplaatst om 2 mm coronale plakjes te genereren waarbij elk segment een bepaald gebied van de hersenen langs de voorste tot achterste as vertegenwoordigt. Coronale plak #3, die routinematig de injectieplaats bevat, wordt gefixeerd in formaline en elk van de resterende plakjes wordt in een apart, gelabeld cryovial geplaatst dat 1 ml cryopreservatiemedium bevat. Formaline fixed paraffine embedded (FFPE) dia's zijn gekleurd met hematoxyline en eosine om de histologie te evalueren en met antilichamen tegen Ki67 en menselijke vimentine om geïmgrafeerde cellen te visualiseren.
Zodra engraftment is geverifieerd, kan de tumor worden doorgenomen en zijn de engraftmentpercentages bij secundaire ontvangers meestal hoger met 80-100%. We raden aan om een tumor de eerste keer in een groter aantal ontvangende muizen te passeren, zodat voldoende cryopreserved materiaal kan worden gegenereerd om een bepaalde tumorlijn bij lage passage (2-5) te behouden voor toekomstige studies. Mediane overlevingstijden voor een bepaalde tumor zijn over het algemeen vergelijkbaar van passage tot passage wanneer elke keer hetzelfde aantal tumorcellen wordt getransplanteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
We zijn vooral patiënten van het Vanderbilt Universitair Medisch Centrum die onschatbaar onderzoeksmateriaal leverden voor de Molecular Neurosurgical Tissue Bank, bijzonder veel tegoed. We danken degenen die de Tissue Bank hebben opgericht en onderhouden, Reid C. Thompson MD (hoofdonderzoeker), Cherryl Kinnard RN (onderzoeksverpleegkundige) en Larry A. Pierce MS (manager). Histologische diensten werden gedeeltelijk uitgevoerd door het Translational Pathology Shared Resource van het Vanderbilt Universitair Medisch Centrum (VUMC) (ondersteund door toekenning 5P30 CA068485 aan het Vanderbilt-Ingram Cancer Center). Dit werk werd ondersteund door subsidies aan MKC van het NINDS (1R21NS070139), het Burroughs Wellcome Fund en VMC development funds. MKC wordt ondersteund door de afdeling Veteranenzaken, Veterans Health Administration, Office of Research and Development, Biomedical Laboratory Research and Development via subsidie 1 I01 BX000744-01. De inhoud vertegenwoordigt niet de standpunten van het Department of Veterans Affairs of de regering van de Verenigde Staten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 14040-133 | |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corp. | LK003150 | |
| Trypan blue solution 0.4% | Life Technologies | 15250061 | |
| Ketamine HCl | Obtained from institutional pharmacy or local veterinary supply company | ||
| Xylazine HCl | |||
| Ketoprofen | |||
| Ophthalmic ointment |
|||
| Povidone-iodine |
Fisher Scientific | 190061617 |
|
| Cryopreservation medium and proliferation supplement |
StemCell Technologies | 05751 |
|
| 0.2% Heparin sodium salt in PBS |
StemCell Technologies | 07980 |
|
| Penicillin-streptomycin |
Life Technologies | 15140-122 |
|
| Dimethyl sulfoxide |
Sigma-Aldrich | D6250-5X10ML |
|
| NOD.Cg-Prkdcscid I/2rgtm1Wjl/SzJ mice |
The Jackson Laboratory | 005557 |
NSG mice |
| Anti-human vimentin antibody |
Dako | M7020 |
Use 1:200 to 1:800 |
| Anti-human IDH1 R132H antibody |
Dianova | DIA-H09 |
Use 1:100 to 1:400 |
| Centrifuge with swinging bucket rotor |
|||
| Pipetter with dispensing speed control |
|||
| Disposable hemocytometer |
Fisher Scientific | 22-600-100 |
|
| Sterile surgical gloves |
Fisher Scientific | 11-388128 |
|
| Disposable gown |
Fisher Scientific | 18-567 |
|
| Surgical mask |
Fisher Scientific | 19-120-1256 |
|
| Tuberculin syringe |
BD | 305620 |
|
| Alcohol pads |
Fisher Scientific | 22-246-073 |
|
| Portable electronic scale |
Fisher Scientific | 01-919-33 |
|
| Zoom stereomicroscope |
|||
| Surgical clipper |
Stoelting | 51465 |
|
| Scalpel handle |
Fine Science Tools | 10003-12 |
|
| Scalpel blades, #10 |
|||
| Stereotaxic instrument |
Stoelting | 51730 |
|
| High-speed drill |
Stoelting | 51449 |
|
| Drill bit, 0.6 mm | Stoelting | 514552 | |
| Hamilton syringe |
Hamilton | 80336 |
|
| Autoclip, 9 mm |
BD | 427630 |
|
| Circulating water warming pad |
Kent Scientific | TP-700 TP-1215EA |
|
| Hot bead dry sterilizer |
Kent Scientific | INS300850 |
|
| Surgical scissors |
Fine Science Tools | 14101-14 |
|
| Fine scissors |
Fine Science Tools | 14094-11 |
|
| Spring scissors |
Fine Science Tools | 15018-10 |
|
| Dumont forceps |
Fine Science Tools | 11251-30 |
|
| Semimicro spatulas |
Fisher Scientific | 14374 |
|
| Mouse brain slicer matrix |
Zivic Instruments | BSMAS002-1 |
|
| Cryogenic storage vials |
Fisher Scientific | 12-567-501 |
References
- Johnson, J. I., et al. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials. Br. J. 84, 1424-1431 (2001).
- Witt Hamer, D. e, C, P., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27, 2091-2096 (2008).
- Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9, 391-403 (2006).
- Pandita, A., Aldape, K. D., Zadeh, G., Guha, A., James, C. D. Contrasting in vivo and in vitro fates of glioblastoma cell subpopulations with amplified EGFR. Genes Chromosomes Cancer. 39, 29-36 (2004).
- Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69, 3364-3373 (2009).
- Piaskowski, S., et al. Glioma cells showing IDH1 mutation cannot be propagated in standard cell culture conditions. Br. J. Cancer. 104, 968-970 (2011).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nat. Rev. 6, 425-436 (2006).
- Sasai, K., et al. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66, 4215-4222 (2006).
- Shu, Q., et al. Direct orthotopic transplantation of fresh surgical specimen preserves CD133+ tumor cells in clinically relevant mouse models of medulloblastoma and glioma. Stem Cells. 26, 1414-1424 (2008).
- Suggitt, M., Bibby, M. C. 50 years of preclinical anticancer drug screening: empirical to target-driven approaches. Clin. Cancer Res. 11, 971-981 (2005).
- Kerbel, R. S. Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved. Cancer Biol. Ther. 2, 134-139 (2003).
- Park, C. Y., Tseng, D., Weissman, I. L. Cancer stem cell-directed therapies: recent data from the laboratory and clinic. Mol. Ther. 17, 219-230 (2009).
- Carlson, B. L., Pokorny, J. L., Schroeder, M. A., Sarkaria, J. N. Establishment, maintenance and in vitro and in vivo applications of primary human glioblastoma multiforme (GBM) xenograft models for translational biology studies and drug discovery. Curr. Protoc. Pharmacol. Chapter. 14, (2011).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59, 1155-1168 (2011).
- Sarangi, A., et al. Targeted inhibition of the Hedgehog pathway in established malignant glioma xenografts enhances survival. Oncogene. 28, 3468-3476 (2009).
- Valadez, J. G., et al. Identification of Hedgehog pathway responsive glioblastomas by isocitrate dehydrogenase mutation. Cancer Lett. 328, 297-306 (2013).
- Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25, 2524-2533 (2007).
- Ehtesham, M., et al. Ligand-dependent activation of the hedgehog pathway in glioma progenitor cells. Oncogene. 26, 5752-5761 (2007).
- Kelly, J. J., et al. Oligodendroglioma cell lines containing t(1;19)(q10;p10. Neuro-oncology. 12, 745-755 (2010).
- Quintana, E., et al. Efficient tumour formation by single human melanoma cells. Nature. 456, 593-598 (2008).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174, 6477-6489 (2005).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
