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Medicine

इम्यून बरकरार मानव MUC1 ट्रांसजेनिक चूहों में आक्रामक संक्रमणकालीन सेल मूत्राशय कार्सिनोमा की प्रेरण: Immunotherapy विकास के लिए एक मॉडल

Published: October 30, 2013 doi: 10.3791/50868
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 1
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, 2Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Summary

एक N-butyl-n-(4-hydroxybutyl) nitrosamine प्रेरित मूत्राशय कैंसर मॉडल मानव mucin 1 (MUC1) के परीक्षण का उद्देश्य MUC1 का निर्देश immunotherapy के लिए ट्रांसजेनिक चूहों में विकसित किया गया था. एक MUC1 लक्षित पेप्टाइड वैक्सीन के प्रशासन के बाद, MUC1 को एक साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट प्रतिक्रिया सीरम cytokine स्तर और टी सेल विशिष्ट गतिविधि को मापने के द्वारा पुष्टि की गई.

Abstract

आक्रामक मूत्राशय कैंसर का एक preclinical मॉडल मानव mucin 1 (MUC1) immunotherapy और / या साइटोटोक्सिक कीमोथेरेपी का मूल्यांकन करने के उद्देश्य के लिए ट्रांसजेनिक (MUC1.Tg) चूहों में विकसित किया गया था. मूत्राशय कैंसर, C57BL 6 / चूहों (MUC1.Tg और जंगली प्रकार) 3.0 मिलीग्राम / दिन पर कैसरजन एन butyl-n-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) के साथ मौखिक रूप से इलाज किया गया, 5 दिन / सप्ताह प्रेरित करने के लिए 12 सप्ताह के लिए. ट्यूमर के विकास के दौरान सीरम साइटोकाइन प्रोफाइल पर OH-BBN के प्रभाव का आकलन करने के लिए, पूरे रक्त अवअधोहनुज उपचार करने से पहले bleeds और हर चार सप्ताह के माध्यम से एकत्र की गई थी. इसके अलावा, एक MUC1 लक्षित पेप्टाइड टीका और प्लेसबो आठ सप्ताह के लिए साप्ताहिक चूहों के समूह को दिलाई गई. ट्यूमर के विकास और निम्नलिखित टीकाकरण के दौरान सीरम साइटोकिन्स के मल्टीप्लेक्स fluorometric microbead immunoanalyses प्रदर्शन किया गया. समाप्ति पर, इंटरफेरॉन गामा (IFN-γ) / MUC1 विशेष टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और ट्यूमर के प्रकार का histopathological मूल्यांकन के लिए इंटरल्यूकिन 4 (आईएल -4) ELISpot विश्लेषणऔर ग्रेड प्रदर्शन किया गया. नतीजे बताते हैं कि: (1) MUC1.Tg और जंगली दोनों प्रकार चूहों में मूत्राशय के कैंसर की घटनाओं में 67% थी, (2) एक 2:1 के अनुपात में विकसित संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा (टीसीसी) स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) की तुलना , (3) भड़काऊ साइटोकिन्स ट्यूमर के विकास के दौरान समय के साथ वृद्धि हुई है, और (4) पेप्टाइड वैक्सीन के प्रशासन के एक Th1-ध्रुवीकृत सीरम साइटोकाइन प्रोफाइल और एक MUC1 विशेष टी सेल प्रतिक्रिया को प्रेरित करता है. MUC1.Tg चूहों में सभी ट्यूमर MUC1 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक थे, और MUC1.Tg और जंगली प्रकार चूहों में ट्यूमर के आधे आक्रामक थे. अंत में, pharmacologists, प्रतिरक्षाविज्ञानी, पैथोलॉजिस्ट और आणविक जीव के प्रयासों के समन्वय के माध्यम से एक टीम के दृष्टिकोण का उपयोग कर, हम hMUC1 व्यक्त करता है कि मूत्राशय के कैंसर का एक प्रतिरक्षा बरकरार ट्रांसजेनिक माउस मॉडल विकसित किया है.

Introduction

मूत्राशय कैंसर के कैंसर के चौथे सबसे आम रूप है और अमेरिकी पुरुषों में कैंसर से होने वाली मौतों के आठवें प्रमुख कारण है. संयुक्त राज्य अमेरिका में, मूत्राशय के कैंसर से एक अनुमान के अनुसार 72,500 नए मामले और 15,000 लोगों की मृत्यु 2013 1 में संयुक्त पुरुषों और महिलाओं के बीच उम्मीद कर रहे हैं. मूत्राशय के कैंसर की घटनाओं में महिलाओं की तुलना में लगभग तीन गुना पुरुषों में उच्च के रूप में है. मामलों के 90% से अधिक के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका में, संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा (टीसीसी) खाते, स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा (एससीसी) 2% से कम 2 की एक घटना है, जबकि. इल्लों टीसीसी के लिए समग्र सापेक्ष 5 साल की जीवित रहने की दर एस सी सी 2 के लिए केवल 30.9% की तुलना में 91.5% है. Noninvasive इल्लों TCCs भी रोगियों का 50% से उपचार अधिक मांसपेशी इनवेसिव रोग 3,4 के लिए प्रगति इन रोगियों के 30% अप करने के साथ, 5 साल के भीतर एक पुनरावृत्ति अनुभव होगा साथ, निदान के समय में मामलों की लगभग 75% के लिए खाते में हालांकि . गैर मांसपेशी निवेश संबंधी निर्णय के लिए विशिष्ट उपचार regimensasive रोग intravesical रसायन चिकित्सा के बाद transurethral लकीर (अरहर) शामिल हैं. उच्च ग्रेड टा या T1 ट्यूमर के साथ रोगियों में, एक दोहराने अरहर कीमोथेरेपी 3,4 करने से पहले किया जा सकता है. कम ग्रेड टा पुनरावृत्ति या उच्च ग्रेड टा या T1 घावों के साथ उन रोगियों के लिए, अरहर Calmette-Guerin (बीसीजी) 3,4 इस्तेमाल किया जा सकता है बैसिलस के रूप में सहायक कीमोथेरेपी या immunotherapy के द्वारा पीछा किया. Intravesical बीसीजी पुनरावृत्ति 5 से समय के लिए सम्मान के साथ intravesical mitomycin सी से बेहतर होना दिखाया गया है. टी 2 मांसपेशी आक्रामक रोग के लिए, neoadjuvant कीमोथेरेपी के साथ या बिना कट्टरपंथी cystectomy उपचार 3 की सिफारिश की पाठ्यक्रम है. एस सी सी के साथ रोगियों में, कट्टरपंथी cystectomy सबसे प्रभावी उपचार 6 प्रतीत होता है. सबसे अच्छा उपचार उपलब्ध के बावजूद पुनरावृत्ति की बहुत उच्च दर को देखते हुए, मूत्राशय के कैंसर के लिए नए और अधिक प्रभावी उपचार के लिए एक की जरूरत स्पष्ट रूप से नहीं है.

Bladd के लिए नए immunotherapies के विस्तारएर कैंसर रोग से मुक्त अस्तित्व को विस्तार देने के लिए वादा पकड़ सकता है कि एक संभव दृष्टिकोण है. ऐतिहासिक, बीसीजी मूत्राशय कैंसर के लिए ही प्रभावी प्रतिरक्षा चिकित्सा की गई है. कार्रवाई के अपने तंत्र में वृद्धि इंटरल्यूकिन -2 के स्तर (आईएल -2) और इंटरफेरॉन गामा (IFN-γ) 4 के माध्यम से एक टी सहायक 1 (Th1) प्रकार प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अविशिष्ट प्रेरण शामिल माना जाता है. सेलुलर, या Th1 प्रतिरक्षा, त्रिदोषन, या Th2 के रूप में कैंसर immunotherapy में महत्वपूर्ण है, उन्मुक्ति वृद्धि कारक रिसेप्टर्स 7 के खिलाफ एंटीबॉडी के अपवाद के साथ, ठोस ट्यूमर के खिलाफ प्रभावी होना दिखाया गया है कभी नहीं. बीसीजी monotherapy के लाभ पर सुधार करने की कोशिश में, IFN-α 2B/BCG संयोजन प्रतिरक्षा चिकित्सा अनिर्णायक परिणाम 8 के साथ एक चरण द्वितीय चिकित्सीय परीक्षण में मूल्यांकन किया गया था. मूत्राशय कैंसर के लिए प्रतिरक्षा चिकित्सा के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण 7 कैंसर immunotherapy अधिक विशिष्ट बना दिया है पहचान जिनमें से ट्यूमर जुड़े एंटीजन (TAAs), लक्षित करने के लिए हो सकता है

ऐसा ही एक TAA इस तरह के मूत्राशय, स्तन, फेफड़े, और अग्नाशय के कैंसर 9,10 के रूप में कई उपकला सेल कैंसर में overexpressed एक कोशिका की सतह ग्लाइकोप्रोटीन है जो mucin 1 (MUC1), है. MUC1 की अभिव्यक्ति और संशोधन भी काफी carcinogenesis के दौरान बदल दिया है, कि इस तरह के underglycosylation पेप्टाइड कोर पर मिलकर दोहराता के चर संख्या (VNTR) के रूप में जाना जाता अमीनो एसिड की प्रतिजनी दृश्यों को उजागर करता है. MUC1 एक आत्म अणु है, वहीं इन immunodominant VNTR क्षेत्रों में सामान्य रूप से होने के कारण व्यापक ग्लाइकोसिलेशन को उजागर नहीं कर रहे हैं, और इस तरह वे विदेशी 11,12 के रूप में प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा देखा जाता है. विशेष रूप से MUC1 एपिटोप्स समझते हैं कि साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTLs) MUC1 एक के लिए एक संभावित लक्ष्य बना रही है, स्तन कैंसर के रोगियों के 13, साथ ही myeloma रोगियों 14,15 के रक्त और अस्थि मज्जा का ट्यूमर draining लिम्फ नोड्स से अलग कर दिया गया है सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है. underglycosylate की immunodominant VNTRsMUC1 की घ प्रपत्र 16-19 ट्यूमर कोशिकाओं के विनाश में जिसके परिणामस्वरूप, CTLs द्वारा मान्यता प्राप्त हैं. कैंसर MUC1 के मूल निवासी सेलुलर और / या प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, तथापि, ट्यूमर को खत्म करने के लिए पर्याप्त मजबूत नहीं कर रहे हैं. MUC1 के लिए पहले से ही विद्यमान कमजोर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाने के लिए, सिंथेटिक immunodominant पेप्टाइड्स नैदानिक ​​लाभ 18,20 का होना काफी मजबूत करने के लिए एक सीटीएल प्रतिक्रिया उत्पन्न करने के लिए टीकाकरण के माध्यम से पेश किया जा सकता है. एक MUC1 लिपोसोमल टीका पहले से ही, फेफड़ों के कैंसर के रोगियों 21,22 में अस्तित्व में वृद्धि MUC1 पॉजिटिव ट्यूमर कोशिकाओं को मारने में सक्षम CTLs उत्पन्न, और एक Th1-ध्रुवीकृत साइटोकाइन प्रतिक्रिया 23,24 उत्पादन दिखाया गया है. MUC1 अभिव्यक्ति 9,11,25 के एक उच्च स्तर के साथ, मूत्राशय कैंसर MUC1 का निर्देश प्रतिरक्षा चिकित्सा 26,27 के परीक्षण के लिए एक तार्किक उम्मीदवार है. इसके अलावा, MUC1 कैंसर 28, टीसीसी में MUC1 अभिव्यक्ति काफी मंच और ग्रेड के साथ जुड़ा हुआ है मूत्राशय में एक शकुन कारक के रूप में की क्षमता है, और metastatic टीसीसीMUC1 29 व्यक्त करने के लिए जारी रखने के लिए दिखाया गया है.

मूत्राशय कैंसर में MUC1 का निर्देश immunotherapy की क्षमता उपयोगिता का मूल्यांकन करने के लिए, हम एक प्रतिरक्षा बरकरार मानव MUC1 (hMUC1) व्यक्त C57BL 6 / पृष्ठभूमि 30 मूत्राशय कैंसर congenic की ट्रांसजेनिक (MUC1.Tg) माउस मॉडल विकसित किया है. मानव MUC1 मनुष्य 30,31 में कहा कि संगत के साथ एक ऊतक अभिव्यक्ति पैटर्न में जिसके परिणामस्वरूप अपने स्वयं के प्रमोटर के नियंत्रण में एक आत्म - प्रोटीन, के रूप में व्यक्त किया जाता है. चूहों तो ज्ञात मूत्राशय कैसरजन एन butyl-n-(4-hydroxybutyl) nitrosamine (OH-BBN) 32, और जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमर hMUC1 अभिव्यक्ति और ट्यूमर के प्रकार और ग्रेड के लिए मूल्यांकन किया गया, साथ प्रेरित किया गया. ट्यूमर के विकास के दौरान Th1/Th2 साइटोकाइन के स्तर पर कैसरजन के प्रभाव का आकलन करने के लिए, सीरम नमूनों मल्टीप्लेक्स विश्लेषण के लिए समय समय पर एकत्र किए गए थे. चूहे तो एक MUC1 लक्षित पेप्टाइड वैक्सीन के साथ इलाज किया, और सीरम साइटोकाइन और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया evalua थेमल्टीप्लेक्स fluorometric microbead immunoassay और ELISpot द्वारा टेड.

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Protocol

सभी जानवरों के अध्ययन और प्रयोगों के कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, डेविस संस्थागत पशु की देखभाल और प्रशासनिक सलाहकार समिति का प्रयोग करें द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किया गया.

1. MUC1.Tg माउस प्रजनन और प्रचार

  1. विषमयुग्मजी MUC1.Tg C57BL 6 / मादा चूहों के साथ यूसी डेविस माउस जीवविज्ञान कार्यक्रम (MBP) नस्लों जंगली प्रकार C57BL 6 / नर चूहों हमारे प्रजनन कॉलोनी स्थापित करने के लिए. जरूरत के रूप में MUC1.Tg संतानों के अध्ययन के लिए दिया जाता है.
  2. MBP कर्मियों माउस पहचान के लिए एक निर्धारित पैटर्न (0-99) में वंश के पैर की उंगलियों क्लिप, और जब लागू क्लिप पूंछ. पैर की अंगुली या पूंछ ऊतक मानक डीएनए निष्कर्षण और पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विश्लेषण का उपयोग जीनोटाइपिंग के लिए कार्रवाई की है.

2. अध्ययन डिजाइन

  1. समूह कार्य अध्ययन
    1. एक संतुलन पर अलग से एक माउस वजन और प्रत्येक माउस के लिए ग्राम में वजन रिकॉर्ड.
    2. निवेश संबंधी निर्णय प्रक्रिया का यह हिस्साअध्ययन की पद्धति और डिजाइन olves. अध्ययन के पहले भाग के लिए, ओह, BBN साथ मूत्राशय कैंसर प्रेरण शुरू करने के लिए उम्र से मिलान MUC1.Tg और जंगली प्रकार चूहों आवंटित. 8 सप्ताह ऊतक विज्ञान से मूत्राशय ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पिछले OH-BBN खुराक के बाद चूहों euthanize.
    3. अध्ययन के दूसरे भाग के लिए, उपचार और नियंत्रण समूहों की उचित संख्या में पुरुष MUC1.Tg चूहों randomize. इन चूहों को 8 सप्ताह के आखिरी OH-BBN खुराक के बाद अध्ययन की समाप्ति पर फिर प्रेरण और ट्यूमर के विकास के दौरान सीरम साइटोकिन्स और टी सेल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए निगरानी, ​​और किया जाएगा.
  2. मूत्राशय कैंसर प्रेरण
    1. ओह-BBN एक कैसरजन और बेहद जहरीला है. इस रसायन से निपटने और भंडारण के जब सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक के दिशा निर्देशों को पढ़ने के लिए और पालन करें.
    2. औसत वजन और कट्टरपंथी घुड़दौड़ का घोड़ा के आधार पर प्रत्येक माउस के लिए, 100 μl की एक मात्रा में उचित खुराक (3 मिलीग्राम), वितरित करने के लिए जरूरी खुराक समाधान एकाग्रता की गणनाप्रत्येक अध्ययन और समूह में चूहों के आर.
    3. 100% इथेनॉल में OH-BBN जलमिश्रित. अंतिम एकाग्रता के लिए 30 बाँझ पानी के साथ मिलीग्राम / एमएल लाओ. अंतिम इथेनॉल: पानी एकाग्रता 20:80 होना चाहिए, वी / वी
    4. 8 सप्ताह की उम्र में शुरू उपचार समूह के काम के आधार पर स्टेनलेस स्टील, दैनिक 20 जी नलिका - पोषण सुई, 5 दिन / 12 हफ्तों के लिए सप्ताह का उपयोग कर OH-BBN मौखिक रूप से प्रशासन.
  3. टीकाकरण उपचार
    1. 0.9% बाँझ खारा के 600 μl में और अच्छी तरह से एक 0.5 इंच 27 जी सुई 6x के माध्यम से समाधान बनाकर resuspend lyophilized पेप्टाइड वैक्सीन का पुनर्गठन प्रत्येक शीशी. वांछित खुराक 100 μl की एक मात्रा में वितरित किया जाता है कि इतना खारा का उपयोग करना, एकाग्रता समायोजित.
    2. ओह-BBN के अंतिम खुराक के बाद, एक 25 जी सुई (सप्ताह के नंबर पर चूहों की उम्र से मेल खाती है) का उपयोग कर 100 μl के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा एक आठ सप्ताह चक्र के लिए एक साप्ताहिक आधार पर टीका प्रशासन, सप्ताह 20 में शुरू.
  4. निगरानी और नमूना संग्रह
    1. सभी चूहों के वजन और प्रत्येक सप्ताह में एक बार नए ट्यूमर की उपस्थिति के लिए टटोलना. स्पर्शनीय ट्यूमर, मूत्र में रक्त, और / या मूत्र प्रतिधारण अगर वहाँ या शरीर के वजन के ≥ 20% खो दिया है कि किसी भी चूहों euthanize.
    2. तब पहली OH-BBN खुराक से पहले और 4 सप्ताह के अंतराल पर उसके बाद, अवअधोहनुज खून के माध्यम से पूरे रक्त इकट्ठा. सीरम थक्के ट्यूब (बी Microtainer) में रक्त ले लीजिए, और थक्का करने के लिए रक्त के लिए 30 मिनट की अनुमति है.
    3. 10 मिनट के लिए 3500 XG पर एक microcentrifuge में रक्त नमूने अपकेंद्रित्र. ध्यान से एक विंदुक का उपयोग टोपी cryotubes पेंच सीरम हस्तांतरण.
    4. -80 में तरल नाइट्रोजन, और दुकान में फ्लैश फ्रीज डिग्री सेल्सियस मल्टीप्लेक्स से आगे के विश्लेषण तक.
    5. आठ सप्ताह OH-BBN के अंतिम खुराक के बाद, सीओ 2 asphyxiation द्वारा सभी चूहों euthanize.
    6. एक विच्छेदन बोर्ड पर प्रत्येक माउस रखें और सभी चार अंगों से नीचे पिन.
    7. मा, संदंश और कैंची का प्रयोगके ऊपरी पेट क्षेत्र में एक क्षैतिज चीरा. Epidermal परत और पेट की दीवार के बीच में चीरा में कैंची डालें और धीरे संदंश की मदद से अंतर्निहित ऊतक से त्वचा को अलग.
    8. माउस के पूर्वकाल अंत में मध्य अक्ष निम्नलिखित क्षैतिज चीरा से एक ऊर्ध्वाधर चीरा. रिब पिंजरे से त्वचा अलग है, और एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 22 जी सुई, पंचर दिल और एक चिकनी और स्थिर आकर्षित के साथ रक्त इकट्ठा का उपयोग कर.
    9. सीरम अलगाव और भंडारण के लिए 2.4.3 और 2.4.4 कदम को देखें.
    10. संदंश और कैंची, कट और वापस छील epidermal परत के बाकी का उपयोग करना. पेट की दीवार और पेरिटोनियम के माध्यम से कट और aseptically immunohistochemistry (आईएचसी) और पश्चिमी धब्बा के लिए मूत्राशय ट्यूमर को दूर.
    11. सेल व्यवहार्यता विश्लेषण (सरस्वती) और ELISpot के लिए तिल्ली लीजिए. आईएचसी, जगह मूत्राशय ट्यूमर के ऊतक कैसेट में नमूना और कमरे के तापमान पर ठंडा formalin रात भर में ठीक करने के लिए. अगले दिन, 70% इथेनॉल के साथ नि: संक्रामक जगह.
    12. ट्यूमर के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए, ट्यूमर homogenize प्रोटीन निष्कर्षण बफर प्लस हाल्ट protease inhibitors के जोड़ और 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए स्थानांतरण.
    13. 30-60 सेकंड के लिए भंवर और 5 मिनट के लिए बर्फ पर पकड़. फ्लैश परिवेश पानी में तरल नाइट्रोजन और पिघलना में फ्रीज. , Vortexing ठंड और दो बार विगलन की प्रक्रिया को दोहराएं.
    14. 4 में 10 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए 10,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र और नए लेबल ट्यूबों को सेलुलर अर्क हस्तांतरण.
    15. प्रोटीन मापन के लिए एक Bicinchoninic एसिड प्रोटीन परख (बीसीए) के प्रदर्शन से एकाग्रता यों. स्टोर के नमूने पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस तक तैयार है.

3. आण्विक जीवविज्ञान / पश्चिमी

निम्न कार्यविधियों मानक वेस्टर्न ब्लाट प्रोटोकॉल का उपयोग माउस मूत्राशय ट्यूमर के ऊतक में MUC1 की अभिव्यक्ति को सत्यापित करने के लिए प्रदर्शन किया गया (डेटा दिखाने के लिए नहींएन).

  1. Semidry उपकरण का उपयोग कर PVDF झिल्ली पर स्थानांतरण तो एसडीएस जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) द्वारा प्रोटीन अर्क अलग और.
  2. 0.1% से 5% नोनफेट दूध के प्रोटीन का तबादला झिल्ली ब्लॉक फास्फेट के बीच 20 कमरे के तापमान पर एक कक्षीय हिलनेवाला पर 1 घंटे के लिए खारा (पीबीएस टी) 7.4 पीएच Buffered.
  3. 0.1% पीबीएस आयकर में विरोधी MUC1 या विरोधी β-actin के एंटीबॉडी के साथ एक प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए झिल्ली सेते हैं.
  4. समाधान decanting और 0.1% पीबीएस टी जोड़कर झिल्ली धो लें. 5 मिनट और छानना के लिए एक प्रकार के बरतन पर भंवर झिल्ली. इस चरण में दो बार दोहराएँ.
  5. एक घोड़े की मूली peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए झिल्ली सेते हैं.
  6. 3x (3.4 कदम देखें) धो लें.
  7. Fluorography सक्रिय करने और पढ़ने के लिए बढ़ी Chemiluminesence (ईसीएल) किट के लिए प्रोटोकॉल का पालन करें.

4. मल्टीप्लेक्स fluorometric Microbead आमापन

<राजभाषा>
  • सेटअप और गणना
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली के नक्शे का उपयोग करना, कुओं को कारतूस, मानकों, नियंत्रण, और unknowns आवंटित. संख्या और analytes की मात्रा की गणना, एंटीबॉडी पर कब्जा और streptavidin-phycoerythrin (एसए पीई) परख के लिए की जरूरत है.
    2. सभी buffers और diluents कमरे के तापमान को संतुलित करने की अनुमति दें. एक खाली 96 अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर मानकों और नमूना dilutions तैयार.
    3. निर्माता प्रोटोकॉल और 96 अच्छी तरह से थाली में उपयुक्त मंदक के साथ मानक के 1:05 धारावाहिक dilutions बनाने के अनुसार सीरम मैट्रिक्स और lyophilized मानक पुनर्गठित. खाली कुओं के लिए, उचित मंदक का उपयोग करें.
    4. 96 अच्छी तरह से थाली के बाकी हिस्सों में उपयुक्त मंदक में सभी नियंत्रण और अज्ञात नमूने 01:02 पतला.
    5. मनका मिश्रण के लिए, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में उचित मंदक की मात्रा विंदुक. 20 सेकंड और पिपेट 15 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक analyte की आवश्यक मात्रा के लिए भंवर प्रत्येक मनका शीशी. हमेशा photobleaching से बचने के प्रकाश से मोतियों की रक्षा करना. Wicking के माध्यम से नमूना के नुकसान से बचने के लिए शोषक सामग्री पर 96 अच्छी तरह से थाली जगह नहीं है.
  • परख प्रोटोकॉल
    1. परख बफर के 200 μl के साथ 96 अच्छी तरह से फिल्टर नीचे की थाली Prewet और फिल्टर की पूरी भिगोने के लिए अनुमति देते हैं. धीरे 96 अच्छी तरह से थाली निर्वात उपकरण का उपयोग करके नाली और एक कागज तौलिया के साथ प्लेट के नीचे सूखी दाग.
    2. एक multichannel विंदुक, कारतूस और मानकों और नियंत्रण और unknowns के लिए सौंपा कुओं को परख बफर के पिपेट 25 μl के लिए सौंपा कुओं को सीरम मैट्रिक्स की पिपेट 25 μl का उपयोग करना.
    3. पिपेट 25 खाली की μl, मानकों, नियंत्रण, और संबंधित सौंपा कुओं को अज्ञात. भंवर मनका 20 सेकंड के लिए मिश्रण और एक जलाशय को मोती हस्तांतरण.
    4. प्रत्येक कुएं में मनका मिश्रण के पिपेट 25 μl. एल्यूमीनियम पन्नी या प्रकाश से बचाने के लिए एक अपारदर्शी थाली ढक्कन के साथ कवर प्लेट.
    5. कब्जा एंटीबॉडी समाधान तैयार है. 0.1% पीबीएस टी के लिए आवश्यक राशि पिपेट और 10 सेकंड के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और भंवर में एंटीबॉडी कब्जा. प्रत्येक कुएं में एक जलाशय और पिपेट 25 μl को कब्जा एंटीबॉडी मिश्रण स्थानांतरण.
    6. एक थाली प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 500 rpm पर थाली हिलाएँ. दो बार नाली और 0.1% पीबीएस आयकर के 200 μl के साथ प्लेट धो लो. नाली और सूखी दाग.
    7. एसए पीई समाधान तैयार है. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और 10 सेकंड के लिए भंवर में 0.1% पीबीएस आयकर और एसए पीई की मात्रा पिपेट. प्रत्येक कुएं में एक जलाशय और पिपेट 25 μl का हल स्थानांतरण.
    8. एक थाली प्रकार के बरतन पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 500 rpm पर थाली हिलाएँ. दो बार नाली और 0.1% पीबीएस आयकर के 200 μl के साथ प्लेट धो लो. नाली और खबहुत शुष्क.
    9. पिपेट 100 0.1% पीबीएस आयकर की μl और मोती resuspend करने के लिए कम से कम दो मिनट के लिए 500 rpm पर एक थाली प्रकार के बरतन में मिलाओ. Luminex Lx200 मशीन पर थाली पढ़ें और विश्लेषण.

    • 5. IFN-γ/IL-4 ELISpot तैयारी और विश्लेषण

    1. एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में, 100 माइक्रोन नायलॉन के ऊतकों के माध्यम से spleens प्रक्रिया 5 मिलीलीटर बाँझ फास्फेट में sieves खारा (पीबीएस) बाँझ पेट्री डिश में Buffered. बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूब में लिम्फोसाइट जुदाई मध्यम के 3 मिलीलीटर पर परत splenocytes.
    2. लाल रक्त कोशिकाओं से लिम्फोसाइटों अलग करने के लिए 15 मिनट के लिए 600 XG पर अपकेंद्रित्र ट्यूबों. नए बाँझ 15 मिलीलीटर ट्यूबों को ढाल ऊपर स्तरित लिम्फोसाइटों स्थानांतरण.
    3. बाँझ पीबीएस के साथ 10 मिलीलीटर मात्रा समायोजित करें. गोली कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 600 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र.
    4. तैरनेवाला Aspirate और सेल व्यवहार्यता के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend और सरस्वती के साथ गिनतीविश्लेषक. सरस्वती गणना और व्यवहार्यता किट प्रोटोकॉल का पालन करें.
    5. 1.5 मिलीलीटर पेंच टोपी अपकेंद्रित्र 1:10 कमजोर पड़ने कारकों पर ट्यूब, 01:20, और गणना और व्यवहार्यता अभिकर्मक (न्यूनतम कुल मात्रा 300 μl) में 01:40 (या के रूप में आवश्यक) में लिम्फोसाइटों के धारावाहिक dilutions बनाओ. सरस्वती पर मिश्रण और विश्लेषण करने के लिए कई बार प्रत्येक कमजोर पड़ने पिपेट और नीचे.
    6. ELISpot प्लेट के लिए नमूने और स्थितियों की एक थाली नक्शा तैयार करते हैं. निर्माता प्रोटोकॉल और मध्यम के पिपेट 100 μl, पेप्टाइड (10 माइक्रोग्राम / एमएल), या हाथापाई प्रत्येक अच्छी तरह से पेप्टाइड (10 माइक्रोग्राम / एमएल) के अनुसार ELISpot थाली तैयार है.
    7. अच्छी तरह से प्रत्येक के 1.0 x 10 6 कोशिकाओं पहुंचाने और 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर थाली सेते सेल निलंबन की पिपेट 100 μl,.
    8. ELISpot परख के लिए निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करें. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर विकसित ELISpot थाली का विश्लेषण करें.
    9. रंग के धब्बे की संख्या correspondi गिनती करके परिणाम योंप्रत्येक कुएं में प्रत्येक analyte के लिए एनजी. स्पॉट प्रत्येक कुएं में जगह बनाने कोशिकाओं की संख्या (एसएफसी) के अनुरूप हैं.

    6. Immunohistochemistry (आईएचसी) और Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला

    1. Immunohistochemical विश्लेषण के लिए 4 माइक्रोन से कम आयल और कदम अनुभाग में एम्बेड ऊपर वर्णित के रूप में संरक्षित मूत्राशय ट्यूमर के ऊतक (धारा 2.4.11), ले लो.
    2. MUC1 से मिलकर दोहराने क्षेत्र स्वीकार करता है कि एक MUC1 एंटीबॉडी का उपयोग आईएचसी प्रदर्शन करना. ऊतकों में उपस्थित अंतर्जात इम्यूनोग्लोब्युलिन साथ माध्यमिक माउस एंटीबॉडी की जेट कम करने के लिए पशु अनुसंधान किट peroxidase का प्रयोग करें.
    3. मानक प्रोटोकॉल का उपयोग एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन करना.

    7. सांख्यिकीय तरीके

    मल्टीप्लेक्स fluorometric Microbead प्रतिरक्षा के लिए, औसत उपचार और नियंत्रण समूहों के बीच सीरम साइटोकाइन सांद्रता मनाया तुलना करने के लिए एक दो पूंछ विद्यार्थी t-परीक्षण का उपयोग करें. ELISpot के लिए, एक एक डब्ल्यू का उपयोगमीडिया पर नियंत्रण के बीच कालोनियों बनाने हाजिर तुलना करने के लिए प्र एनोवा, पेप्टाइड और पेप्टाइड समूहों के तले. एक झूठी सकारात्मक परिणाम की संभावना को कम करने के लिए Dunnett के एकाधिक तुलना टेस्ट का प्रयोग करें. ≤ 0.05 की एक पी मूल्य सभी विश्लेषण के लिए काफी अलग माना जाता है.

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    Representative Results

    मूत्राशय कैंसर में उपन्यास immunotherapies और संयोजन के प्रभाव के preclinical मूल्यांकन एक उपयुक्त पशु मॉडल के विकास की आवश्यकता है. हमारे ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में, रासायनिक कैसरजन OH-BBN साथ प्रेरण मानव में मूत्राशय कैंसर के समान है, जो कुछ एस सी सी, के साथ मुख्य रूप से टीसीसी के मूत्राशय कैंसर के बढ़ते मामलों के एक उच्च दर में हुई. ट्यूमर के ऊतक विज्ञान, MUC1 अभिव्यक्ति की स्थिति और पेप्टाइड टीका उपचार के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का निर्धारण करने के लिए, 21 MUC1.Tg और 18 जंगली प्रकार चूहों OH-BBN प्रेरण के बाद रक्त का संग्रह, मूत्राशय, और spleens (चित्रा 1) के आठ सप्ताह के लिए euthanized थे (सप्ताह 28). दोनों MUC1.Tg (14/21) और जंगली प्रकार (12/18) चूहों के लिए मूत्राशय कैंसर के बढ़ते मामलों की दर 67% थी. Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला एक 2:1 के अनुपात में predominating TCCs साथ, टीसीसी और एससीसी दोनों की उपस्थिति की पुष्टि की. इन के अलावा, हम उच्च ग्रेड आक्रामक ट्यूमर को कम और उच्च ग्रेड noninvasive की एक सीमा मनाया.सभी MUC1.Tg मूत्राशय कैंसर के नमूनों आईएचसी (चित्रा 2) द्वारा MUC1 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक थे. यह MUC1 आईएचसी के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी दोनों सामान्य और कैंसर मानव MUC1 पहचानता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए.

    मॉडल के विकास के दौरान भड़काऊ साइटोकिन्स के सीरम स्तर सप्ताह 8-28 के बीच क्रमानुसार निगरानी की गई. हम भड़काऊ cytokine स्तर के अध्ययन के अंत (चित्रा 3) के माध्यम से प्रेरण से समय के साथ वृद्धि हुई है कि मनाया. इस साइटोकाइन पैटर्न हम दृढ़ता से भड़काऊ cytokine स्तर को बढ़ाने के ट्यूमर के विकास के साथ सहसंबंधी सकता है जो हमारे फेफड़ों के कैंसर के मॉडल 33 में मनाया पहले क्या करने के लिए समान है.

    पेप्टाइड वैक्सीन को Th1 सीरम साइटोकाइन प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, 15 टीके लगाए और 14 प्लेसबो का इलाज MUC1.Tg चूहों euthanized थे और खून पिछले टीका उपचार के बाद 24 घंटे, सप्ताह 28 में अध्ययन के अंत में एकत्र किया गया था. मल्टीप्लेक्स विश्लेषण (Figurई 4) placebo समूह की तुलना में वैक्सीन समूह में Th1 सीरम साइटोकाइन TNF-α के स्तर, IFN-γ, आईएल -2, आईएल -12 (P70), और आईएल 17 की वृद्धि हुई है दिखाता है. TNF-α के स्तर, IFN-γ, और आईएल -17 वैक्सीन का इलाज चूहों में (पी <0.05) काफी अधिक थे. इन परिणामों पेप्टाइड वैक्सीन के लिए एक Th1 ध्रुवीकृत साइटोकाइन प्रतिक्रिया सुझाव है.

    पेप्टाइड वैक्सीन को Th1/Th2 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए, splenocytes IFN-γ/IL-4 ELISpot द्वारा मूल्यांकन किया गया. पिछले उपचार के बाद चौबीस घंटे, spleens एकत्र और ELISpot विश्लेषण के लिए लिम्फोसाइटों अलग करने के लिए प्रोसेस किया गया. लिम्फोसाइटों सरस्वती विश्लेषक (चित्रा 5) से गिना जाता है और व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन किया गया. ELISpot प्लेटों के प्रति अच्छी तरह से 1 एक्स 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त और 48 घंटे बाद में विकसित किए गए. प्रतिनिधि परिणाम (चित्रा 6) पेप्टाइड करने के लिए एक Th1 प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की पुष्टि करता है जो पेप्टाइड करने के लिए एक स्पष्ट और विशिष्ट IFN-γ प्रतिक्रिया, दिखानेटीका.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. माउस पोस्टमार्टम. पोस्टमार्टम OH-BBN प्रेरण के अंत के बाद 28 सप्ताह 8 सप्ताह में प्रदर्शन किया गया था. लिवर, मूत्राशय ट्यूमर, और तिल्ली संकेत कर रहे हैं. तारांकित (*) रक्त संग्रह के लिए पंचर बिंदु के निशान. इस उदाहरण में, एक उच्च ग्रेड, आक्रामक एससीसी मनाया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

    चित्रा 2
    चित्रा 2. प्रतिनिधि मूत्राशय ऊतक वर्गों एच एंड ई (बाएं) और नॉरमा के मानव MUC1 आईएचसी (दाएं) के साथ दाग एल मूत्राशय, इनवेसिव स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा, और आक्रामक संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा. (ए) म्यूकोसा साथ सामान्य मूत्राशय फैलाना MUC1 जेट से पता चलता है, जो संक्रमणकालीन उपकला से खड़े हैं. (बी) submucosa में आक्रामक एससीसी (तीर) के घोंसलों. संगठित केरातिन परतों (तारांकन) लाइन मूत्राशय म्यूकोसा. फैलाना MUC1 जेट एससीसी के घोंसलों में देखा जाता है. (सी) Mucosa लुमेन (सही पर छोड़ दिया है) में पेश टीसीसी होता है. संक्रमणकालीन सेल कार्सिनोमा submucosa और मांसपेशियों (तीर और इनसेट) में आक्रमण के साथ anaplastic है. आक्रामक टीसीसी कम प्रमुख जेट (सही, छोड़ दिया पर) है, जबकि लुमेन शो में पेश mucosa और टीसीसी, MUC1 जेट (सही, सही पर) फैलाना. बार = 200 माइक्रोन (मुख्य पैनल) और 50 माइक्रोन (इनसेट). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

    3 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 6in "के लिए: src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3.jpg "चौड़ाई =" 600px "/>
    चित्रा 3. ट्यूमर के विकास के विभिन्न चरणों में भड़काऊ सीरम साइटोकिन्स. सीरियल सीरम नमूनों तो आधारभूत अवअधोहनुज bleeds (8 सप्ताह), उसके बाद अध्ययन समाप्ति तक हर 4 हफ्तों से एकत्र किए गए थे. रक्त (एन = 4) जमा किया गया था, और सीरम अलग किया गया था और 20 साइटोकिन्स की उपस्थिति के लिए विश्लेषण. सांद्रता जमा नमूने और सलाखों के मतलब श्रेणी का प्रतिनिधित्व का प्रतिनिधित्व करते हैं. तीर OH-BBN खुराक निष्कर्ष निकाला बात जिस पर संकेत मिलता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

    चित्रा 4
    4 चित्रा.पेप्टाइड वैक्सीन उपचार. सीरम नमूनों का पालन Th1 सीरम साइटोकिन्स 24 घंटा अंतिम वैक्सीन की खुराक (एन = 15) या प्लेसबो (एन 14 =) के बाद, अध्ययन समाप्ति पर एकत्र की है और 20 साइटोकिन्स की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया. मतलब साइटोकाइन सांद्रता और सलाखों सकारात्मक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व के रूप में डेटा दिखाया गया है. * पी <0.05 बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

    चित्रा 5
    चित्रा 5. प्रतिनिधि माउस splenocyte हिस्टोग्राम. माउस splenocytes अध्ययन समाप्ति पर अलग और एक सरस्वती विश्लेषक का उपयोग गिनती और व्यवहार्यता के लिए मूल्यांकन किया गया. वाम पैनल, सेल आकार के आधार पर सेल जीवित - क्षमता. Nucleated कोशिकाओं (जीवित कोशिकाओं के आधार पर सही पैनल, सेल व्यवहार्यता हरी क्षेत्र में, सफेद क्षेत्र में मृत कोशिकाओं). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

    चित्रा 6
    6 चित्रा. अध्ययन समाप्ति पर Splenocyte LISpot विश्लेषण. (ए) प्रतिनिधि कुओं दिखा IFN-γ (लाल धब्बे) और आईएल -4 (नीले धब्बे) मीडिया के जवाब में उत्पादन, पेप्टाइड तले, और पेप्टाइड. एक स्पष्ट IFN-γ, प्रतिजन विशेष प्रतिक्रिया पेप्टाइड प्रदर्शन के साथ मनाया गया. के विशिष्ट IFN-γ मतलब (± मानक विचलन) मीडिया के जवाब में कालोनियों बनाने हाजिर दिखा ELISpot डेटा, पेप्टाइड और पेप्टाइड तले. (बी) ग्राफ़िकल प्रतिनिधित्व_blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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    Discussion

    मानव MUC1.Tg चूहों में आक्रामक संक्रमणकालीन और स्क्वैमस सेल मूत्राशय कार्सिनोमा के सफल प्रेरण Immunotherapy विकास के लिए एक preclinical मॉडल प्रदान करता है. Immunotherapeutic पढ़ाई समय के साथ ही प्रतिरक्षा चिकित्सा के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर ट्यूमर प्रगति को भड़काऊ प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के क्रम में एक सहज, प्रतिरक्षा बरकरार मॉडल के उपयोग की आवश्यकता होती है. एक सहज ट्यूमर के विकास के मॉडल में, ट्यूमर microenvironment बरकरार है और ट्यूमर के इलाज के अर्बुदरोधी प्रभाव के आकलन के लिए अनुमति देता है कि एक अधिक प्रतिनिधि वृद्धि दर से विकास. इसके अलावा, प्रतिरक्षा प्रणाली को उपचार प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है, बायोमार्कर के माध्यम से मापा जाता है और निगरानी की जा सकती है.

    प्रतिरक्षा चिकित्सा परीक्षण के लिए साहित्य में वर्णित अन्य ट्यूमर असर माउस मॉडल xenograft मॉडल और प्रत्यारोपण मॉडल दोनों शामिल हैं. इन मॉडलों सुविधाजनक हैं और बड़े पैमाने पर कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में नियोजित किया गया है,immunotherapeutic अध्ययनों का आयोजन करने पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण सीमाओं के एक नंबर रहे हैं. Xenografts न ही प्रतिरोपित ट्यूमर न तो अनायास विकसित करने, और वे ट्यूमर मूल रूप से प्राप्त किए गए जिसमें से ऊतक के प्रतिनिधि नहीं है कि एक microenvironment में पैदा करना. इसके अलावा, xenografts और प्रतिरोपित ट्यूमर कम समय चिकित्सा की प्रतिरक्षा प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है, और अधिक तेजी से सहज ट्यूमर की तुलना में बड़े होते हैं. सबसे महत्वपूर्ण बात, इन मॉडलों समझौता प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ मेजबान टीम की आवश्यकता होती है.

    हमारे मॉडल के अलावा, अन्य रासायनिक प्रेरित मूत्राशय कैंसर मॉडलों के एक नंबर रहे हैं. उदाहरण के लिए, एन [4 - (5 नाइट्रो-2-furyl)-2-thiazolyl] formamide (FANFT) और एन मिथाइल एन nitrosourea (MNU) भी चूहों और चूहों दोनों में मूत्राशय कैंसर प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है . हालांकि, इन रसायनों वे प्रेरित ट्यूमर के ऊतक विज्ञान के संबंध में थोड़ा अलग हैं. जबकि एम FANFT मुख्य रूप से, कुछ एससीसी साथ urothelial सेल कार्सिनोमा (यूसीसी) लाती हैपरमाणु अंततः मेटास्टेसिस 34 की एक कम भार के साथ पेशी इनवेसिव ट्यूमर में परिणाम है कि इल्लों कार्सिनोमा लाती है. विकसित कि TCCs निकट उच्च ग्रेड मानव TCCs 34 जैसे लगते हैं क्योंकि OH-BBN सामान्यतः कृंतक मॉडल में मूत्राशय कैंसर शामिल करने के लिए प्रयोग किया जाता है. मूत्राशय कैंसर भी कुत्तों, खरगोश और चूहों में के रूप में अच्छी तरह से ओह-BBN का उपयोग चूहों में प्रेरित किया गया है. कुत्तों 35 carcinogens के bioactivation के संबंध में मनुष्य के साथ इसी तरह की चयापचय की प्रक्रिया का हिस्सा है, बीगल में मूत्राशय कैंसर के विकास के लिए विलंबता अवधि 37 सप्ताह से 36 है, और कुत्तों के साथ experimentations के वित्तीय और नैतिक आधार दोनों है. खरगोश भी अब विलंबता अवधि है, और खुराक की अवधि के लिए जोड़ा है, जब 21 महीने के न्यूनतम टीसीसी और एससीसी विकास 37 के लिए आवश्यक है. चूहों के लिए इसी प्रकार, चूहे मॉडल कम 8 सप्ताह की खुराक अवधि और 5 सप्ताह 38 से विलंबता समय के साथ मनुष्य के लिए histopathologically समान हैं कि ट्यूमर विकसित

    पहले हम दोनों फेफड़ों के 33 और स्तन कैंसर के 39 के लिए दो प्रतिरक्षा बरकरार मानव MUC1 व्यक्त सहज ट्यूमर मॉडल विकसित किया है. मूत्राशय कैंसर में immunotherapies के मूल्यांकन करने के लिए, हम मूत्राशय कार्सिनोमा के एक ओह-BBN प्रेरित, सहज माउस मॉडल विकसित किया है. पहले से वर्णित मॉडल 33,39 के लिए इसी प्रकार, इस मॉडल में विकसित ट्यूमर है कि पेप्टाइड वैक्सीन का लक्ष्य है जो एक आत्म - अणु, के रूप में ट्यूमर जुड़े प्रतिजन MUC1 व्यक्त करते हैं. इस मॉडल मानव MUC1 की अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक थे, जो सभी के मूत्राशय ट्यूमर के एक 67% घटना से पता चला है. ऊतकीय आकलन मानव मूत्राशय कैंसर में मनाया जाता है के साथ संगत है, जो TCCs predominated दिखाया. इस मॉडल की कार के अध्ययन के लिए आदर्श हैcinogenesis, रोकथाम रणनीति और मानव में स्थानीय और उन्नत मूत्राशय कैंसर का इलाज. भविष्य में, हम वर्णित मूत्राशय कैंसर के मॉडल में रसायन - चिकित्सा और विकिरण चिकित्सा के साथ संयोजन में immunotherapy के अतिरिक्त अध्ययन को आगे बढ़ाने की योजना है.

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    Disclosures

    DPV, GTW, एसएमजी, सीजेके, एएमजी, और GKH कोई प्रतिस्पर्धा हितों की घोषणा. MWD मर्क KGaA से प्राप्त अनुदान के प्रधान अन्वेषक है, और मेगावाट मर्क KGaA का एक कर्मचारी है.

    Acknowledgments

    लेखकों चूहों प्रजनन के लिए यूसी डेविस माउस जीवविज्ञान कार्यक्रम को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध मर्क KGaA, Darmstadt, जर्मनी से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent 
    N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) TCI America B0938
    20 G Gavage Needles Popper Sons, Inc. 7921 Stainless steel
    Peptide Vaccine N/A N/A investigational agent
    BD Microtainers BD 365957
    Tissue Cassettes Simport M490-12
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific SF100-4
    Lysis Buffer Pierce 87787
    Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail Thermo Scientific 78444
    Pierce BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
    Mouse Cytokine 20plex Kit Invitrogen LMC006
    Magnetic Microsphere Beads Luminex MC100xx-01 xx is the bead region
    Anti-mouse TNF- Capture Antibody BD Pharmingen 551225
    Anti-mouse TNF- Detection Antibody BD Pharmingen 554415
    Anti-mouse IFN- Capture Antibody Abcam ab10742
    Anti-mouse IFN- Detection Antibody Abcam ab83136
    PBS, pH 7.4 Sigma P3813-10PAK
    Tween-20 Fisher BP337-500
    Assay Buffer Millipore L-MAB
    Cytokine Standard Millipore MXM8070
    Multi-screen HTS 96well filter plates Millipore MSBVN1210
    SA-PE Invitrogen SA10044
    100 m Nylon Tissue Sieves BD 352360
    Splenocyte Separation Media Lonza 17-829E
    TNF- /IL-4 ELISpot plates R&D Systems ELD5217
    Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody Epitomics 2900-1
    Goat Anti-actin monoclonal antibody Sigma A1978
    Anti-rabbit HRP antibody Promega W401B
    Goat anti-mouse HRP antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2005
    PVDF membrane BioRad 162-0174
    Mini Protean TGX Precast Gels BioRad 456-1083
    Muse Count & Viability Kit Millipore MCH100104
    MUC1 Antibody BD Pharmingen 550486 IHC antibody
    Animal Research Peroxidase Kit Dako K3954 IHC staining
    Equipment and Software
    Millipore plate vaccum apparatus Millipore MSVMHTS00
    Luminex Lx200 Millipore / Luminex 40-013 Manufactured by Luminex, distributed by Millipore
    Luminex Xponent Software Millipore / Luminex N/A Version 3.1; included with Luminex Lx200
    Milliple Analyst Software Milliplex / VigeneTech 40-086 Version 5.1
    Muse Cell Analyzer Millipore 0500-3115
    Muse Software Millipore N/A Version 1.1.0.0; included with Analyzer
    Dissecting Microscope Unitron Z730
    Graphpad Prism Software Graphpad Software Inc. N/A Version 5.1
    Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus BioRad 165-8001
    Trans Blot SD Cell and PowerPac BioRad 170-3849

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    चिकित्सा अंक 80 आनुवंशिक रूप से संशोधित मूत्राशय पशु कैंसर टीके Immunotherapy पशु प्रयोगों मॉडल नियोप्लास्म मूत्राशय कैंसर C57BL 6 / माउस MUC1 Immunotherapy preclinical मॉडल
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    Vang, D. P., Wurz, G. T., Griffey, S. M., Kao, C. J., Gutierrez, A. M., Hanson, G. K., Wolf, M., DeGregorio, M. W. Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice: A Model for Immunotherapy Development. J. Vis. Exp. (80), e50868, doi:10.3791/50868 (2013).

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