Summary
En N-butyl-N-(4-hydroxibutyl) nitrosamin-inducerad blåscancer modell utvecklades i human mucin 1 (MUC1) transgena möss för att testa MUC1-riktad immunterapi. Efter administrering av en MUC1-riktad peptidvaccin, var en cytotoxisk T lymfocytsvaret MUC1 bekräftades genom mätning av serum cytokinnivåer och T-cell specifik aktivitet.
Abstract
En preklinisk modell av invasiv blåscancer utvecklades i human mucin 1 (MUC1) transgena (MUC1.Tg) möss för att utvärdera immunterapi och / eller cytostatika. För att inducera cancer i urinblåsan, C57BL / 6 möss (MUC1.Tg och vildtyp) behandlades oralt med cancerframkallande N-butyl-N-(4-hydroxibutyl) nitrosamin (OH-BBN) vid 3,0 mg / dag, 5 dagar / vecka i 12 veckor. För att bedöma effekterna av OH-BBN på serum cytokinprofil under tumörutveckling, var helblod via submandibulära blödningar före behandling och var fjärde vecka. Dessutom gjordes en MUC1-riktad peptidvaccin och placebo administrerades till grupper av möss varje vecka i åtta veckor. Multiplex fluorometriska microbead immunoanalyses av serum cytokiner under tumörutveckling och efter vaccination utfördes. Vid uppsägning, interferon-gamma (IFN-γ) / interleukin-4 (IL-4) ELISpot analys för MUC1 specifik T-cells immunsvar och histopatologiska utvärderingar av tumörtypoch årskurs utfördes. Resultaten visade att: (1) förekomsten av blåscancer i både MUC1.Tg och vildtyp möss var 67%, (2) övergångsbestämmelser cell cancer (TCC) som utvecklats på en 2:1-förhållande jämfört med skivepitelcancer (SCC) , (3) inflammatoriska cytokiner ökade med tiden under tumörutveckling, och (4) administrering av peptiden Vaccinet inducerar en Th1-polariserad serum cytokinprofil och en MUC1 specifik T-cellsvar. Alla tumörer i MUC1.Tg möss var positiva för MUC1 uttryck, och hälften av alla tumörer i MUC1.Tg och vildtyp möss invasiv. Sammanfattningsvis, med hjälp av ett lagarbete genom samordning av insatserna från farmakologer, immunologists, patologer och molekylärbiologer, har vi utvecklat ett immunförsvar intakt transgen musmodell av cancer i urinblåsan som uttrycker hMUC1.
Introduction
Cancer i urinblåsan är den fjärde vanligaste cancerformen och den åttonde vanligaste orsaken till dödsfall i cancer i amerikanska män. I USA finns uppskattningsvis 72.500 nya fall och 15.000 dödsfall i cancer i urinblåsan väntat bland män och kvinnor tillsammans under 2013 1. Förekomsten av cancer i urinblåsan är ungefär tre gånger så hög hos män jämfört med kvinnor. I USA, övergångsbestämmelser cell cancer (TCC) står för över 90% av fallen, medan skivepitelcancer (SCC) har en incidens på mindre än 2% 2. Den totala relativa 5-års överlevnad för papillär TCC är 91,5% jämfört med endast 30,9% för SCC 2. Även icke-invasiv papillär TCCS svarar för cirka 75% av fallen vid tidpunkten för diagnos, även med behandling mer än 50% av patienterna kommer att uppleva ett återfall inom fem år, med upp till 30% av dessa patienter vidare till muskel invasiv sjukdom 3,4 . Typiska behandlingsregimer för icke-muskel invasive sjukdom inkluderar transuretral resektion (TUR) följt av intravesikal kemoterapi. Hos patienter med höggradig Ta eller T1 tumörer, kan en upprepning TUR göras före kemoterapi 3,4. För de patienter med låggradig Ta upprepningar eller höggradig Ta eller T1 lesioner, följt TUR av adjuvant kemoterapi eller immunterapi i form av Bacillus Calmette-Guerin (BCG) kan användas 3,4. Intravesikal BCG har visat sig vara överlägsen intravesikal mitomycin C med avseende på tid till återfall 5. För T2 muskel invasiv sjukdom, är radikal cystektomi med eller utan neoadjuvant kemoterapi är den rekommenderade behandlingen 3. Hos patienter med SCC förefaller radikal cystektomi för att vara den mest effektiva behandlingen 6. Med tanke på de mycket höga återfall trots de bästa behandlingar som är tillgängliga, det finns helt klart ett behov av nya, mer effektiva behandlingar för cancer i urinblåsan.
Expanderande nya immunterapier för bladdER cancer är en möjlig strategi som kan hålla löftet att utvidga sjukdomsfri överlevnad. Historiskt sett har BCG varit den enda effektiva immunterapi för cancer i urinblåsan. Dess verkningsmekanism är tänkt att involvera ospecifik induktion av en T-helper 1 (Th1) typ immunsvar via ökade nivåer av interleukin-2 (IL-2) och interferon-gamma (IFN-γ) 4. Cellular, eller Th1 immunitet, är kritisk i cancer immunoterapi som humoralt eller Th2, har immunitet aldrig visat sig vara effektivt mot fasta tumörer, med undantag för antikroppar riktade mot tillväxtfaktorreceptorer 7. I ett försök att förbättra nyttan av BCG monoterapi, fick IFN-α 2B/BCG kombination immunterapi utvärderas i en fas II-studie med osäkra resultat 8. En alternativ metod för immunterapi för cancer i urinblåsan kan vara att rikta tumör-associerade antigener (TAA), identifiering av vilket har gjort cancerimmunotherapy mer specifik 7
En sådan TAA är mucin 1 (MUC1), som är ett cellyteglykoprotein överuttryckt i många epitelceller cancerformer såsom urinblåsa, bröst, lunga, och pankreascancer 9,10. Uttrycket och modifiering av MUC1 också ändras väsentligt under karcinogenes, exponerar så att underglycosylation antigena sekvenser av aminosyror kallas varierande antal tandem repeats (VNTR) på peptiden kärnan. Medan MUC1 är en self-molekyl, är dessa immundominanta VNTR regioner som inte normalt utsätts för på grund av omfattande glykosylering, och därmed de ses av immunsystemet som främmande 11,12. Cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) som specifikt känner igen MUC1 epitoper har isolerats från tumör-dränerande lymfkörtlar av bröstcancerpatienter 13, såväl som blod och benmärg från myelomatålmodig 14,15, vilket gör MUC1 ett potentiellt mål för en cellulärt immunsvar. De immundominanta VNTRs av underglycosylated form av MUC1 känns igen av CTL, vilket resulterar i destruktion av tumörceller 16-19. Native cellulära och / eller humorala immunsvar mot cancerous MUC1 är emellertid inte tillräckligt starka för att eliminera tumörer. För att förstärka den redan existerande svagt immunsvar mot MUC1, kan syntetiska immundominanta peptider införas genom vaccination för att generera en CTL-svar stark nog att vara av klinisk nytta 18,20. En MUC1 liposomal vaccinet har redan visats öka överlevnaden hos lungcancerpatienter 21,22, generera CTL med förmåga att döda MUC1-positiva tumörceller, och producera en Th1-polariserad cytokin respons 23,24. Med en hög nivå av MUC1 expression 9,11,25, är blåscancer en logisk kandidat för testning MUC1-riktad immunterapi 26,27. Dessutom har MUC1 potential som en prognostisk faktor vid blåscancer 28, MUC1 uttryck i TCC är signifikant associerade med stadium och grad, och metastaserande TCChar visats för att fortsätta att uttrycka MUC1 29.
För att utvärdera den potentiella nyttan av MUC1-riktad immunterapi i blåscancer, utvecklade vi en immun intakt human MUC1 (hMUC1)-uttryckande transgena (MUC1.Tg) musmodell av cancer i urinblåsan congenic på C57BL / 6 bakgrund 30. Human MUC1 uttrycks som ett kroppseget protein under kontroll av sin egen promotor, vilket resulterar i en vävnad uttryck mönster som överensstämmer med den som observerats hos människa 30,31. Mössen inducerades med den kända blåsan cancerframkallande N-butyl-N-(4-hydroxibutyl) nitrosamin (OH-BBN) 32, och sedan de resulterande tumörerna utvärderades med avseende hMUC1 uttryck och tumör typ och kvalitet. För att bedöma effekten av cancerframkallande på Th1/Th2 cytokinnivåer under tumörutveckling, har serumprover samlas regelbundet för multiplex analys. Mössen behandlades sedan med en MUC1-riktad peptidvaccin, och serumet cytokin och immunsvar var utvärted genom multiplex fluorometrisk mikrokornet immunanalys och ELISpot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Samtliga djurstudier och experiment utfördes under ett protokoll godkändes av University of California, Davis Institutional Animal Care och använda administrativa rådgivande kommittén.
Ett. MUC1.Tg Mouse Avel och förökning
- UC Davis Mus Biology Program (MBP) raser vildtyp C57BL / 6 hanmöss med heterozygot MUC1.Tg C57BL / 6 mushonor att etablera vår avel koloni. MUC1.Tg avkommor levereras för studier som behövs.
- MBP personal klippa tårna av avkomman i ett definierat mönster (0-99) för mus identifiering, och i förekommande fall klämma svansen. Den tå eller svans vävnad bearbetas för genotyping användning av standard DNA-extraktion och polymeraskedjereaktion (PCR)-analys.
2. Study Design
- Studera gruppuppgifter
- Väg varje mus separat på en balans och notera vikten i gram för varje mus.
- Denna del av förfarandet involves den metod och utformning av studien. För den första delen av studien, tilldela åldersmatchade MUC1.Tg och vild typ möss att starta induktion blåscancer med OH-BBN. Euthanize möss 8 veckor efter den sista OH-BBN dos för att bekräfta förekomsten av tumörer i urinblåsan genom histologi.
- För den andra delen av studien, randomiseras manliga MUC1.Tg möss in i lämpligt antal behandlings-och kontrollgrupper. Dessa möss kommer att övervakas för serum cytokiner och T-cell immunsvar under induktion och tumörutveckling, och sedan vid avslutande av studien 8 veckor efter den sista OH-BBN dos.
- Blåscancer Induktion
- OH-BBN är cancerframkallande och mycket giftigt. Läs och följ riktlinjerna i säkerhetsdatablad vid hantering och lagring av denna kemikalie.
- Beräkna doseringslösning koncentration som behövs för att leverera den lämpliga dosen (3 mg), i en volym av 100 | il, till varje mus baserat på genomsnittliga vikter och number av möss i varje studie och grupp.
- Späd OH-BBN i 100% etanol. Bringa den slutliga koncentrationen till 30 mg / ml med sterilt vatten. Den slutliga etanol: vatten koncentration bör vara 20:80, v / v.
- Administrera OH-BBN oralt med rostfritt stål, 20 G sondmatning nålar dagligen, 5 dagar / vecka under 12 veckor, baserat på den behandlade gruppen uppdraget börjar vid 8 veckors ålder.
- Vaccination Behandlingar
- Bered varje injektionsflaska med frystorkat peptidvaccin i 600 pl 0,9% steril koksaltlösning och grundligt resuspendera genom att dra lösningen genom en 0,5 tums 27 G nål 6x. Använda saltlösning, justera koncentrationen så att den önskade dosen levereras i en volym av 100 | il.
- Från och med vecka 20, efter den sista dosen av OH-BBN, administrera vaccinet på veckobasis för ett åtta veckors cykel genom subkutan injektion av 100 ^ med en 25 G nål (veckonummer motsvarar en ålder på möss).
- Övervakning och Provtagning
- Väg alla möss och palpera för förekomsten av nya tumörer gång varje vecka. Euthanize några möss som har förlorat ≥ 20% av kroppsvikten eller om det finns kännbara tumörer, blod i urinen, och / eller urinretention.
- Före den första OH-BBN dos och sedan vid 4 veckors intervall därefter, samla helblod via submandibulära blöder. Samla blodet i serum koagulering rör (BD Microtainer), och tillåta 30 minuter för blodet att koagulera.
- Centrifugera blodproven i en mikrocentrifug vid 3500 x g under 10 min. Försiktigt överföra serumet att skruvlocket cryotubes hjälp av en pipett.
- Flash frysa i flytande kväve, och förvara vid -80 ° C tills vidare analys med multiplex.
- Åtta veckor efter den sista dosen av OH-BBN, avliva alla möss med CO 2 kvävning.
- Placera varje mus på en dissektion board och hålla fast vid alla fyra lemmar.
- Använda pincett och sax, make ett horisontellt snitt i övre delen av buken. Sätt saxen i snittet mellan det epidermala skiktet och bukväggen och försiktigt separera huden från den underliggande vävnaden med hjälp av pincett.
- Gör en lodrät snitt från horisontellt snitt efter den mellersta axeln mot den främre änden av musen. Separera huden från bröstkorgen, och med användning av en 1 ml spruta och en 22 G nål, punktera hjärtat och samla blod med ett jämnt och stadigt dragning.
- Se steg 2.4.3 och 2.4.4 för serum isolering och lagring.
- Använda pincett och sax, klippa och skal tillbaka resten av epidermal lagret. Skär genom bukväggen och bukhinnan och aseptiskt bort blåstumör för immunohistokemi (IHC) och Western blot.
- Samla mjälte av cellernas livskraft analys (Muse) och ELISpot. För IHC, plats blåstumör exemplar i vävnad kassett och fixa i kyld formalin över natten vid rumstemperatur. Följande dag, ersätta formalin med 70% etanol.
- För Western blot analys av tumören, homogenisera tumören, tillsätt buffert proteinextraktion plus Halt proteashämmare och överföra till 1,5 ml mikrorör.
- Vortex för 30-60 sekunder och håll på is i 5 min. Flash frysa i flytande kväve och tina i omgivande vatten. Upprepa processen för vortex, frysning och upptining två gånger.
- Centrifugera proverna vid 10000 x g under 10 min vid 4 ° C och flytta hela cellextrakt till nya märkta rör.
- Kvantifiera koncentrationen genom att utföra en Bicinchoninic Assay Acid Protein (BCA) för protein mätningar. Förvara proverna vid -80 ° C tills redo för Western blot-analys.
Tre. Molecular Biology / västra
Följande procedurer utfördes för att kontrollera uttrycket av MUC1 i mus urinblåsan tumörvävnad med standard Western Blöt protokollet (data visar inten).
- Separera proteinextrakten genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och sedan överföra på PVDF-membran med användning halvtorra apparat.
- Blockera proteinet överfördes membranet med 5% fettfri mjölk i 0,1% Tween-20 i fosfatbuffrad saltlösning (PBS-T), pH 7,4 under 1 h på en orbitalskakare vid rumstemperatur.
- Inkubera membranet under 1 timme vid rumstemperatur på en skakare med anti-MUC1 eller anti-β-aktin antikropp i 0,1% PBS-T.
- Tvätta membranet genom dekantering av lösningen och tillsats av 0,1% PBS-T. Snurra membranet på skakare under 5 min och dekantera. Upprepa detta steg två gånger.
- Inkubera membranet under 1 h vid rumstemperatur med en pepparrotsperoxidas (HRP) konjugerad sekundär antikropp.
- Tvätta 3x (se steg 3.4).
- Följ protokollet för Enhanced Chemiluminesence (ECL) kit för att aktivera och läsa fluorografi.
4. Multiplex Fluorometrisk mikrokorn Immunoassay
<ol>- Med hjälp av en 96-brunnar karta, tilldela råämnen, standarder, kontroller och okända till brunnarna. Beräkna antalet och volymen av analyter, fånga antikroppar och streptavidin-fykoerytrin (SA-PE) som behövs för analysen.
- Låt alla buffertar och spädningsmedel till jämvikt till rumstemperatur. Förbered de standarder och utspädningar prov med användning av en tom 96-brunnar.
- Bered serum matrix och frystorkat standard enligt tillverkarens protokoll och göra 1:05 seriella spädningar av standarden med lämplig spädningsmedel i 96-brunnar. För de tomma brunnarna, använd lämplig spädningsvätska.
- Späd alla kontroller och okända prover 1:02 i lämpligt spädningsmedel i resten av 96-brunnar.
- För Pärlmix, pipettera upp önskad volym av lämpligt lösningsmedel i en 15 ml tub. Vortex varje pärla ampull under 20 s och pipettera den erforderliga volymen av varje analyt in i 15 ml rör. Alltid skydda pärlorna från ljus för att undvika fotoblekning. Placera inte den 96-brunnar på absorberande material för att undvika förlust av provet genom uppsugning.
- Prewet den 96-brunns filterplatta bottenplatta med 200 | il analysbuffert och medge fullständig blötläggning av filtret. Försiktigt rinna genom att använda 96-väl apparater platta vakuum och torka undersidan av plattan med en pappershandduk.
- Med hjälp av en flerkanalig pipett pipett 25 ul serum matrix till brunnarna tilldelats för ämnena och normer och pipett 25 ul analysbuffert till brunnarna tilldelats för kontrollerna och okända.
- Pipettera 25 ìl av ämnet, standarder, kontroller och okända till respektive tilldelade brunnar. Vortex pärlan mix för 20 sek och överföra pärlorna till en reservoar.
- Pipettera 25 | il av vulsten blandningen till varje brunn. Täck plattan med aluminiumfolie eller en ogenomskinlig platta lock för att skydda mot ljus.
- Bered lösningen infångningsantikroppen. Pipettera den erforderliga mängden 0,1% PBS-T och fånga antikropp i ett 15 ml rör och vortexa i 10 sek. Överför blandningen infångningsantikroppen till en reservoar och pipettera 25 | il i varje brunn.
- Skaka plattan vid 500 rpm under en timme vid rumstemperatur på en plattskakanordning. Töm och tvätta plattan med 200 l 0,1% PBS-T två gånger. Töm och torka.
- Förbered SA-PE-lösning. Pipettera den erforderliga volymen av 0,1% PBS-T och SA-PE in i ett 15 ml rör och vortexa i 10 sek. Överför lösningen till en reservoar och pipettera 25 | il i varje brunn.
- Skaka plattan vid 500 rpm under 30 minuter vid rumstemperatur på en plattskakanordning. Töm och tvätta plattan med 200 l 0,1% PBS-T två gånger. Drain och Bmycket torr.
- Pipettera 100 | il av 0,1% PBS-T och skaka på en tallrik skakanordning vid 500 varv per minut under minst två minuter för att resuspendera kulorna. Läs och analysera plattan på Luminex LX200 maskinen.
Fem. IFN-γ/IL-4 ELISpot beredning och analys
- I ett biologiskt säkerhetsskåp, bearbeta mjältarna genom 100 | im Nylon vävnad såll i 5 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i sterila Petri-skålar. Layer splenocyterna på 3 ml lymfocytseparationsmedium i sterila 15-ml rör.
- Centrifugera rören vid 600 xg under 15 min för att separera lymfocyterna från de röda blodkropparna. Överför de skiktade lymfocyter ovanför gradient till nya sterila 15 ml rör.
- Justera volymen till 10 ml med steril PBS. Centrifugera suspensionen vid 600 xg under 10 min för att pelletera cellerna.
- Aspirera supernatanten och suspendera cellerna i 1 ml PBS för cellens livskraft och räkna med Museanalysatorn. Följ Muse Count & Viability Kit protokoll.
- Gör seriespädningar av lymfocyterna i 1,5 ml centrifugrör med skruvkork rören vid spädningsfaktorer av 01:10, 01:20 och 01:40 (eller vid behov) i Count & Livsduglighet Reagent (minsta total volym 300 pl). Pipettera vardera spädning upp och ned flera gånger för att blanda och analysera på Muse.
- Förbered en tallrik karta av proverna och villkor för ELISpot plattan. Förbered ELISpot platta enligt tillverkarens protokoll och pipettera 100 pl medium, peptid (10 | ig / ml), eller scramble peptid (10 | ig / ml) till varje brunn.
- Pipettera 100 | il cellsuspension, leverera 1,0 x 10 6 celler till varje brunn och inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
- Följ tillverkarens protokoll för ELISpot-analysen. Analysera utvecklade ELISpot plattan med hjälp av en dissektion mikroskop.
- Mäta de resultat genom att räkna antalet av färgade fläckar corresponding till varje analyt i varje brunn. Fläckarna motsvarar antalet för slumpvis-bildande celler (SFC) i varje brunn.
6. Immunohistokemi (IHC) och Hematoxylin & Eosin (H & E) färgning
- Ta vävnad blåstumör bevarad som beskrivits ovan (avsnitt 2.4.11), bädda i paraffin och steg-sektionen vid 4 pm för immunhistokemisk analys.
- Utför IHC använder ett MUC1 antikropp som känner igen regionen tandemupprepning av MUC1. Använd Animal peroxidas Research Kit för att minimera reaktiviteten hos den sekundära musantikroppen med endogent immunglobulin närvarande i vävnaden.
- Utför H & E-färgning med användning av standardprotokoll.
7. Statistiska metoder
För Multiplex Fluorometrisk mikrokorn Immunoanalys, använd ett tvåsidigt Students t-test för att jämföra den genomsnittliga observerade serum cytokin koncentrationer mellan behandlings-och kontrollgrupper. För ELISpot, använd en en-way ANOVA för att jämföra plats bildar kolonier mellan media kontroll, scrambled peptid och peptid grupper. Använd Dunnetts multipla jämförelsetest för att minska sannolikheten för ett falskt positivt resultat. Ett p-värde på ≤ 0,05 anses signifikant olika för alla analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den prekliniska utvärderingen av effekterna av nya immunterapi och kombinationer i blåscancer kräver utveckling av en lämplig djurmodell. I vår transgen musmodell, resulterade induktion med den kemiska cancerframkallande OH-BBN i en hög frekvens av cancer i urinblåsan incidens av övervägande TCC med vissa SCC, som liknar cancer i urinblåsan hos människor. För att avgöra tumörens histologi, MUC1 uttryck status och immunsvaret på peptidvaccin behandling, var 21 MUC1.Tg och 18 vilda möss typ avlivas för insamling av blod, blåsor, och mjälte (figur 1) åtta veckor efter OH-BBN induktion (Vecka 28). Den cancer i urinblåsan Incidensen för både MUC1.Tg (14/21) och vildtyp (12/18) möss var 67%. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning bekräftade närvaron av både TCC och SCC, med TCCS dominerar vid ett 02:01-förhållande. Bland dessa, observerade vi en rad låg och hög kvalitet icke-invasiv till höggradig invasiva tumörer.Alla MUC1.Tg blåscancer prover var positiva för MUC1 expression med IHC (Figur 2). Det bör noteras att den antikropp som används för MUC1 IHC känner igen både normal och cancerös human MUC1.
Under modellutveckling, var serumnivåerna av inflammatoriska cytokiner övervakas i serie mellan vecka 8-28. Vi observerade att inflammatoriska cytokinnivåer ökat med tiden från induktion till slutet av studien (Figur 3). Denna cytokin mönster är mycket likt det vi observerats tidigare i vår lungcancer modell 33, som starkt tyder på att öka inflammatoriska cytokinnivåer kan korrelera med tumörutveckling.
För att bedöma Th1 serum cytokin svar på peptidvaccin, 15 vaccinerade och 14 placebobehandlade MUC1.Tg mössen avlivades och blod samlades i slutet av studien i vecka 28, 24 timmar efter den sista vaccinet behandling. Multiplex analys (Figure 4) visar ökad Th1 serum cytokinnivåer av TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-12 (p70) och IL-17 i vaccingruppen jämfört med placebogruppen. Nivåer av TNF-α, var IFN-γ, och IL-17 signifikant högre (p <0,05) i vaccinet-behandlade möss. Dessa resultat tyder på en Th1 polariserad cytokin svar på peptidvaccin.
För att utvärdera den Th1/Th2 immunsvaret på peptidvaccin, splenocyter bedömts av IFN-γ/IL-4 ELISpot. Tjugofyra timmar efter den sista behandlingen, mjältarna samlas in och bearbetas för att isolera lymfocyter för ELISpot analys. Lymfocyter räknades och bedömdes med avseende på viabilitet med Muse Analyzer (Figur 5). ELISpot plattor ympades med 1 x 10 6 viabla celler per brunn och utvecklat 48 h senare. Representativa resultat (Figur 6) visar en tydlig och specifik IFN-γ svar på peptiden, vilket bekräftar en Th1 immunsvar mot peptidenvaccin.
Figur 1. Mus Nekropsi. Nekropsi utfördes vid 28 veckor, 8 veckor efter slutet av OH-BBN induktion. Lever, blåstumör, och mjälte är angivna. Asterisk (*) markerar punktera punkten för provtagningen. I detta exempel har en hög kvalitet, invasiv SCC observerats. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Representativa urinblåsan vävnadssnitt färgades med H & E (till vänster) och humant MUC1 IHC (till höger) i Norma L urinblåsan, invasiv skivepitelcancer och invasiv övergångsperiod cell carcinoma. (A) Normal urinblåsa med slemhinna kantas av övergångsepitel, vilket visar diffus MUC1 reaktivitet. (B) bon av invasiv SCC (pil) i submucosa. Organiserade keratin lager (asterisk) linje blåsan slemhinnan. Diffus MUC1 reaktivitet ses i bon av SLL. (C) Mucosa innehåller TCC skjuter in i lumen (vänster, höger). Transitional cell carcinoma är anaplastic med invasionen i submucosa och muskler (pil och infälld). Slemhinna och TCC skjuter in lumen show diffusa MUC1 reaktivitet (höger, till höger), medan invasiva TCC har mindre framträdande reaktivitet (höger till vänster). Bar = 200 nm (huvudpanelen) och 50 pm (infälld). Klicka här för att se större bild .
3 "fo: innehåll-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3.jpg "width =" 600px "/>
Figur 3. Inflammatoriska serum cytokiner vid olika stadier av tumörutveckling. Serial serumprover samlades genom submandibulära blödningar vid baslinjen (8 veckor), därefter var 4: e vecka fram till avslutandet av studien. Blod poolades (n = 4), och serumet isolerades och analyserades för närvaro av 20 cytokiner. Halterna representerar medelvärdet av poolade prover och barer representerar intervallet. Pilar indikerar den punkt där OH-BBN dosering avslutade. Klicka här för att se större bild .
Figur 4.Th1 serum cytokiner efter peptidvaccin behandling. Serumprover togs vid avslutandet av studien, 24 h efter den sista dosen av vaccinet (n = 15) eller placebo (n = 14) och analyserades med avseende på närvaro av 20 cytokiner. Data visas som medelvärden cytokin koncentrationer och barer representerar positiv standardavvikelse. * P <0,05 Klicka här för att se större bild .
Figur 5. Representativa mus splenocyt histogrammet. Mussplenocyter isolerades vid avslutandet av studien och utvärderas för räkning och livskraft med en Muse Analyzer. Vänster panel, cell viablility baserat på cellstorlek. Höger panel, cellviabilitet baserad på kärnförsedda celler (levande celler i gröna zonen, döda celler i vita zonen). Klicka här för att se större bild .
Figur 6. Splenocyt LISpot analysen vid studiens avslutning. (A) representant brunnar visar IFN-γ (röda prickar) och IL-4 (blå prickar) som svar på media, scrambled peptid och peptid. En tydlig IFN-γ, antigenspecifikt svar observerades med peptid exponering. (B) Grafisk representation av typiska IFN-γ ELISpot data som visar medelvärdet (± standardavvikelse) spot bildar kolonier som svar på media, oordning peptid och peptid._blank "> Klicka här för att se större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den framgångsrika induktion av invasiv övergångsperiod och skivepitelcancer blåskarcinom i mänskliga MUC1.Tg möss erbjuder en preklinisk modell för immunterapi utveckling. Immunterapi studier kräver användning av en spontan, immun intakt modell för att utvärdera det inflammatoriska svaret till tumörprogression över tid samt immunsvaret mot immunterapi. I en spontan tumör utvecklingsmodell, förblir tumormicroenvironmenten intakt och tumörer utvecklas i en mer representativ tillväxttakt som möjliggör bedömning av antitumöreffekterna av behandling. Dessutom kan immunförsvaret mätas och övervakas genom biomarkörer, vilket möjliggör utvärdering av behandlingseffekt.
Andra tumörbärande musmodeller som beskrivits i litteraturen för att testa immunterapi innefattar både xenograft modeller och modeller transplantation. Även om dessa modeller är bekväma och har utförligt anställd inom cancerforskning,Det finns ett antal viktiga begränsningar att tänka på när de utför immunterapeutiska studier. Varken implanterad eller transplanterade tumörer utvecklas spontant, och de förökar sig i en microenvironment som inte är representativ för den vävnad från vilken tumörerna ursprungligen härstammar. Dessutom xenografts och transplanterade tumörer växer snabbare än spontana tumörer, så mindre tid att studera immuna effekterna av behandlingen. Viktigast av dessa modeller kräver värdar med nedsatt immunförsvar.
Utöver vår modell, det finns ett antal andra kemiskt inducerade modeller blåscancer. Exempelvis kan N-[4 - (5-nitro-2-furyl)-2-tiazolyl] formamid (FANFT) och N-metyl-N-nitrosourea (MNU) har också visats inducera blåscancer hos både råttor och möss . Men dessa kemikalier är något annorlunda med avseende på histologi av tumörerna som de kan orsaka. FANFT inducerar primärt urothelial cell carcinoma (UCC) med viss SCC, medan MNU inducerar papillär cancer som så småningom resulterar i muskel-invasiva tumörer med en låg förekomst av metastaser 34. OH-BBN används ofta för cancer i urinblåsan induktion i djurmodeller eftersom TCCS som utvecklar liknar höggradiga mänskliga TCCS 34. Urinblåsan cancer har också inducerats i hundar, kaniner och råttor såväl som i möss med användning av OH-BBN. Även hundar har liknande metaboliska processer med människor i förhållande till bioaktivering av carcinogener 35, är latensperioden för blåscancer utveckling i beaglar 37 veckor 36, och experimenterande med hundar har både ekonomiska och etiska överväganden. Kaniner har ännu längre latensperioder, och när de läggs på doseringen perioden är minst 21 månader krävs för TCC och SCC utveckling 37. Liknar möss, råttmodeller utvecklar tumörer som är histopathologically lika människor, med korta dosering perioder om 8 veckor och perioder latens på 5 veckor 38
Tidigare har vi utvecklat två immuna intakta mänskliga MUC1-uttryckande spontana tumör modeller för både lung 33 och bröstcancer 39. För att utvärdera immunotherapies i blåscancer, utvecklade vi en OH-BBN-inducerad, spontana musmodell av blåscancer. I likhet med de tidigare beskrivna modellerna 33,39, de tumörer som utvecklas i denna modell uttrycker det tumörassocierade antigen MUC1 som en själv-molekylen, som är målet för den peptidvaccin. Denna modell visade en 67% incidens av tumörer i urinblåsan, som alla var positiva för expression av humant MUC1. Histologiska utvärderingar visade att TCCS dominerade, vilket är i linje med vad som observerats i human blåscancer. Denna modell är perfekt för att studera bilcinogenesis, förebyggande strategier och behandling av lokaliserad och avancerad blåscancer hos människor. I framtiden planerar vi att genomföra ytterligare studier av immunterapi i kombination med kemoterapeutika och strålbehandling i den beskrivna blåscancer modell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, och GKH förklarar inga konkurrerande intressen. MWD är Principal Investigator för ett bidrag som mottagits från Merck KGaA, och MW är anställd av Merck KGaA.
Acknowledgments
Författarna vill tacka UC Davis Mus Biology Program för avel mössen. Denna forskning stöds av ett lån från Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
References
- Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215 (2007).
- Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
- Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
- Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
- Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
- Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
- Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
- Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
- Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
- Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
- Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
- Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
- Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
- Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
- Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
- Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
- Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
- Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
- Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
- Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
- Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
- Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
- Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
- Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
- Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
- Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
- Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
- Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
- Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
- Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
- McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
- Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
- Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
- Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
- Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
- Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
- Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
- Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).
