Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Induktion af Invasive Transitional Cell blærecarcinom i Immune intakt humant MUC1 transgene mus: En model for immunterapi Development

Published: October 30, 2013 doi: 10.3791/50868
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 3, 1
1Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of California, Davis, 2Comparative Pathology Laboratory, UC Davis School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Merck Serono Research, Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Summary

En N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin-induceret blærekræft model blev udviklet i human mucin 1 (MUC1) transgene mus med henblik på prøvning MUC1-rettet immunterapi. Efter indgivelse af et MUC1 målrettet peptidvaccine, blev en cytotoksisk T-lymfocyt respons på MUC1 bekræftet ved måling af serum cytokinniveauer og T-celle specifik aktivitet.

Abstract

En præklinisk model for invasiv blærekræft blev udviklet i human mucin 1 (MUC1) transgene (MUC1.Tg) mus med henblik på evaluering af immunterapi og / eller kemoterapi. At fremkalde blærekræft, C57BL / 6 mus (MUC1.Tg og vildtype) blev behandlet oralt med det kræftfremkaldende N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin (OH-BBN) på 3,0 mg / dag, 5 dage / uge i 12 uger. For at vurdere effekten af ​​OH-BBN på serum-cytokinprofil under tumor udvikling blev fuldblod indsamlet via submandibulære blødninger før behandling og hver fjerde uge. Derudover blev en MUC1 målrettet peptidvaccine og placebo administreret til grupper af mus ugentligt i otte uger. Multiplex fluorometriske microbead immunoanalyses af serumcytokiner under tumor udvikling og efter vaccination blev udført. Ved forsøgets afslutning, interferon gamma (IFN-γ) / interleukin-4 (IL-4) ELISpot analyse for MUC1 specifik T-celle-immunreaktion og histopatologiske evalueringer af tumortypeog klasse blev udført. Resultaterne viste, at: (1) forekomsten af ​​blærekræft i både MUC1.Tg og vildtypemus var 67%, (2) transitional cell carcinomer (TCC) udviklet på en 2:1 sammenlignet med pladecellecarcinomer (SCC) , (3) inflammatoriske cytokiner steg med tiden under tumor udvikling, og (4) indgivelse af peptidet Vaccinen fremkalder et Th1-polariseret serum cytokinprofil og et MUC1 specifik T-celle-respons. Alle tumorer i MUC1.Tg mus var positive for MUC1 ekspression, og halvdelen af ​​alle tumorer i MUC1.Tg og vildtypemus var invasiv. Konklusionen er, at bruge en team tilgang gennem koordinering af indsatsen fra farmakologer, immunologer, patologer og molekylærbiologer har vi udviklet en immun intakt transgen musemodel af blærekræft, der udtrykker hMUC1.

Introduction

Blærekræft er den fjerde mest almindelige form for kræft og den ottende hyppigste årsag til kræftdødsfald i amerikanske mænd. I USA, er en anslået 72.500 nye tilfælde og 15.000 dødsfald som følge blærekræft forventes blandt mænd og kvinder samlet i 2013 1. Forekomsten af ​​blærekræft er cirka tre gange så højt hos mænd end hos kvinder. I USA tegner transitional cell carcinomer (TCC) for over 90% af tilfældene, mens pladecellecarcinomer (SCC) har en hyppighed på mindre end 2% 2. Den generelle relative 5-års overlevelse for papillary TCC er 91,5% sammenlignet med kun 30,9% for SCC 2.. Selvom noninvasive papillary TCCs tegner sig for cirka 75% af tilfældene på tidspunktet for diagnosen, selv med behandling mere end 50% af patienterne vil opleve en gentagelse inden for 5 år, med op til 30% af disse patienter udvikler sig til muskler invasiv sygdom 3,4 . Typiske behandlingsregimer for ikke-muskel-invasive sygdom omfatter transuretral resektion (TUR) efterfulgt af intravesikal kemoterapi. Hos patienter med high-grade Ta eller T1 tumorer kan en gentagelse TUR udføres før kemoterapi 3,4. For de patienter med lav-grade Ta tilbagefald eller high-grade Ta eller T1 læsioner, efterfulgt TUR af adjuvans kemoterapi eller immunterapi i form af Bacillus Calmette-Guerin (BCG), kan anvendes 3,4. Intravesikal BCG har vist sig at være overlegen i forhold til intravesikal mitomycin C med hensyn til tiden til tilbagefald 5. For T2 muskel invasiv sygdom, er den radikale cystectomy med eller uden neoadjuverende kemoterapi den anbefalede behandlingsforløb 3.. Hos patienter med SCC, synes radikal cystektomi at være den mest effektive behandling 6.. I betragtning af de meget høje tilbagefald på trods af de bedste behandlinger til rådighed, er der et klart behov for nye og mere effektive behandlinger for blærekræft.

Udvidelse nye immunterapier til bladdis kræft er en mulig tilgang, der kan holde løftet til at udvide sygdomsfri overlevelse. Historisk har BCG været den eneste effektive immunterapi for blærekræft. Dens virkningsmekanisme menes at involvere den uspecifikke induktion af en T-hjælper 1 (Th1) typen immunrespons via stigende niveauer af interleukin-2 (IL-2) og interferon gamma (IFN-γ) 4.. Cellulære eller Th1 immunitet, er kritisk i cancer-immunterapi som humorale eller Th2, er immuniteten aldrig vist sig at være effektiv mod solide tumorer, med undtagelse af antistoffer rettet mod vækstfaktorreceptorer 7. I et forsøg på at forbedre på fordelene ved BCG monoterapi blev IFN-α 2B/BCG kombinationen immunterapi evalueret i et fase II klinisk studie med overbevisende resultater 8.. En alternativ metode til immunterapi for blærekræft kan være at målrette tumor-associerede antigener (TAA'er), identifikation af som har gjort kræft immunterapi mere specifik 7

En sådan TAA mucin 1 (MUC1), som er et celleoverfladeglycoprotein overudtrykt i mange epitelceller kræftformer, såsom blære, bryst, lunge, og bugspytkirtelkræft 9,10. Ekspression og modificering af MUC1 også ændres væsentligt under carcinogenese, sådan at underglycosylation udsætter antigene sekvenser af aminosyrer kendt som variabelt antal tandemgentagelser (VNTR) på peptidet kerne. Mens MUC1 er en selvstændig molekyle, er disse immundominante VNTR regioner normalt ikke udsættes på grund af omfattende glycosylering, og dermed de opfattes af immunsystemet som fremmede 11,12. Cytotoksiske T-lymfocytter (CTL'er), som specifikt genkender MUC1 epitoper er blevet isoleret fra de tumor-drænende lymfeknuder fra brystkræftpatienter 13, samt blod og knoglemarv af myelomatosepatienter 14,15, hvilket gør MUC1 et potentielt mål for en cellulært immunrespons. De immundominante VNTRs af underglycosylated form af MUC1 genkendes af CTL'er, hvilket resulterer i ødelæggelse af tumorceller 16-19. Native cellulære og / eller humorale immunresponser på kræft MUC1 er dog ikke stærk nok til at fjerne tumorer. At forøge den allerede eksisterende svag immunrespons til MUC1, kan syntetiske immundominante peptider indføres gennem vaccination at generere et CTL-respons stærk nok til at være af klinisk fordel 18,20. En MUC1 liposomal vaccine er allerede vist sig at øge overlevelsen i patienter med lungecancer 21,22, generere CTL'er kan dræbe MUC1-positive tumorceller, og producere en Th1-polariseret cytokin respons 23,24. Med en høj grad af MUC1 ekspression 9,11,25, er blærekræft en logisk kandidat til test MUC1-rettet immunterapi 26,27. Desuden MUC1 har potentiale som en prognostisk faktor i blærekræft 28, MUC1 ekspression i TCC er signifikant associeret med scenen og kvalitet, og metastatisk TCChar vist sig at fortsætte med at udtrykke MUC1 29..

For at vurdere den potentielle anvendelighed af MUC1-rettet immunterapi i blærekræft, udviklede vi en immun intakt humant MUC1 (hMUC1)-udtrykkende transgene (MUC1.Tg) musemodel af blærekræft congene på C57BL / 6 baggrund 30. Human MUC1 udtrykkes som en selvstændig protein under kontrol af sin egen promotor, hvilket resulterer i en vævsekspression mønster svarende observeret hos mennesker 30,31. Musene blev induceret med den kendte blære kræftfremkaldende N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) nitrosamin (OH-BBN) 32, og derefter de resulterende tumorer blev vurderet for hMUC1 ekspression og tumor type og kvalitet. For at vurdere effekten af ​​kræftfremkaldende på Th1/Th2 cytokinniveauer under tumor udvikling blev serumprøver indsamlet jævnligt for multiplex analyse. Mus blev derefter behandlet med en MUC1 målrettet peptidvaccine, og serummet cytokin og immunreaktioner blev evalueindikeret med multiplex fluorometrisk microbead immunoassay og ELISpot.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg og eksperimenter blev udført under en protokol godkendt af University of California, Davis Institutional Animal Care og brug administrative rådgivende udvalg.

1.. MUC1.Tg Mouse Avl og opformering

  1. UC Davis Mouse Biologi Program (MBP) racer vildtype C57BL / 6 hanmus med heterozygot MUC1.Tg C57BL / 6 hunmus at etablere vores opdræt koloni. MUC1.Tg afkom leveres til undersøgelser efter behov.
  2. MBP personale klippe tæerne af afkommet i en defineret mønster (0-99) til mus identifikation, og når relevant klip halen. Den tå eller hale væv forarbejdet til genotypebestemmelse ved hjælp af standard DNA-ekstraktion og Polymerase Chain Reaction (PCR) analyse.

2.. Undersøgelse Design

  1. Undersøgelse gruppeopgaver
    1. Vejes hver mus separat på en balance, og vægten i gram for hver mus.
    2. Denne del af proceduren involves den metode og design af undersøgelsen. For den første del af studiet, tildele aldersmatchede MUC1.Tg og vilde type mus til at starte blærekræft induktion med OH-BBN. Aflive mus 8 uger efter den sidste OH-BBN dosis for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​blæretumorer ved histologi.
    3. For den anden del af undersøgelsen, randomisere mandlige MUC1.Tg mus i det passende antal behandlings-og kontrolgrupper. Disse mus vil blive overvåget for serumcytokiner og T-celle immunreaktioner under induktion og tumor udvikling, og derefter ved afslutning af forsøget 8 uger efter den sidste OH-BBN dosis.
  2. Bladder Cancer Induktion
    1. OH-BBN er kræftfremkaldende og meget giftig. Læs og følg retningslinjerne i sikkerhedsdatabladet, når håndtering og opbevaring dette kemikalie.
    2. Beregn dosering opløsningens koncentration er nødvendig for at levere den passende dosis (3 mg), i et volumen på 100 ul til hver mus baseret på den gennemsnitlige vægt og number af mus i hver enkelt undersøgelse og gruppe.
    3. Fortynd OH-BBN i 100% ethanol. Bringe den endelige koncentration til 30 mg / ml med sterilt vand. Den endelige ethanol: vand koncentration bør være 20:80, v / v.
    4. Indgiv OH-BBN mundtligt ved hjælp af rustfrit stål, 20 G sonde nåle dagligt, 5 dage / uge i 12 uger, baseret på behandlingsgruppen opgaven starter i en alder af 8 uger.
  3. Vaccination Behandlinger
    1. Opløs indholdet af hvert hætteglas med frysetørret peptid vaccine i 600 pi 0,9% sterilt saltvand og grundigt resuspender ved at trække opløsningen gennem en 0,5 tommer 27 G kanyle 6x. Brug saltvand, koncentrationen justeres, så den ønskede dosis leveres i et volumen på 100 ul.
    2. Starter i uge 20, efter den sidste dosis af OH-BBN, vaccinen administrere på en ugentlig basis for en otte-ugers cyklus ved subkutan injektion af 100 ul anvendelse af en 25 G kanyle (uge nummer svarer til en alder af musene).
  4. Overvågning og Prøvetagning
    1. Vejes alle mus og palpere for tilstedeværelsen af ​​nye tumorer gang hver uge. Aflive enhver mus, der har mistet ≥ 20% af kropsvægten, eller hvis der er palpable tumorer, blod i urinen og / eller urinretention.
    2. Forud for den første OH-BBN dosis og derefter med 4 ugers intervaller derefter, indsamle fuldblod via submandibulære blødninger. Saml blod i serum størkning rør (BD Microtainer), og lad 30 min for blodet til at størkne.
    3. Centrifuger blodprøver i en mikrocentrifuge ved 3.500 xg i 10 min. Forsigtigt overføre serum skruelåget kryorør ved hjælp af en pipette.
    4. Flash fryse i flydende nitrogen, og opbevares ved -80 ° C indtil yderligere analyse af multiplex.
    5. Otte uger efter den sidste dosis OH-BBN, aflive alle mus med CO 2 kvælning.
    6. Placer hver mus på en dissektion bord, og pin ned af alle fire lemmer.
    7. Brug pincet og saks, maKE en horisontal snit i den øvre maveregionen. Sæt saksen ind i indsnittet mellem epidermislaget og bugvæggen og forsigtigt adskille huden fra det underliggende væv ved hjælp af pincet.
    8. Lav en lodret snit fra vandret snit efter den midterste akse mod den forreste ende af musen. Adskil huden mod brystkassen, og bruge en 1 ml sprøjte og en 22 G nål punktere hjerte og indsamle blod med en glat og jævn uafgjort.
    9. Se trin 2.4.3 og 2.4.4 for serum isolation og opbevaring.
    10. Brug pincet og saks, klippe og skræl tilbage resten af ​​epidermal lag. Skær gennem bugvæggen og bughinden og aseptisk fjerne blære tumor for immunhistokemisk (IHC) og Western blot.
    11. Saml milt for cellernes levedygtighed analyse (Muse) og ELISpot. For IHC, place blære tumor modellen i væv kassette og fastgør kølet formalin natten over ved stuetemperatur. Den følgende dag, erstatte formalin med 70% ethanol.
    12. Til Western blot-analyse af tumor, homogenisere tumoren, tilføje protein ekstraktionsbuffer plus Halt proteaseinhibitorer og overføre til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    13. Vortex i 30-60 sek og holde på is i 5 min. Flash fryse i flydende nitrogen og tøbrud i omgivelsernes vand. Gentag processen hvirvelbehandling, nedfrysning og optøning to gange.
    14. Centrifuger prøverne ved 10.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C, og overføre de cellulære ekstrakter til nye mærkede rør.
    15. Kvantificere koncentrationen ved at udføre en bicinchoninsyre Protein Assay (BCA) for protein målinger. Opbevar prøver ved -80 ° C, indtil klar til Western blot-analyse.

3.. Molekylærbiologi / vestlige

De følgende procedurer blev udført for at kontrollere ekspressionen af ​​MUC1 i mus blære tumorvæv ved hjælp af standard Western Blot-protokol (data ikke vistn).

  1. Adskil proteinekstrakter ved SDS-polyacrylamidgel elektroforese (SDS-PAGE) og derefter overføre på PVDF-membran ved hjælp af halvtørre apparat.
  2. Bloker proteinet overført membran med 5% skummetmælk i 0,1% Tween-20 i phosphatpufret saltvand (PBS-T) pH 7,4 i 1 time på en orbitalryster ved stuetemperatur.
  3. Inkuber membranen i 1 time ved stuetemperatur på et rysteapparat med anti-MUC1 eller anti-β-actin-antistof i 0,1% PBS-T.
  4. Vask membranen ved dekantering af opløsningen og tilsætning af 0,1% PBS-T. Swirl membranen på shakeren i 5 min, og der dekanteres. Gentag dette trin to gange.
  5. Inkuber membranen i 1 time ved stuetemperatur med et peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret sekundært antistof.
  6. Vask 3x (se trin 3.4).
  7. Følg protokollen for Enhanced Chemiluminesence (ECL) kit til at aktivere og læs fluorografi.

4.. Multiplex Fluorometric mikroperle Immunoassay

<ol>
  • Opsætning og Beregninger
    1. Ved hjælp af en 96-brønds plade map, tildele blanks, standarder, kontroller og ubekendte til brøndene. Beregn antallet og omfanget af analytter fange antistoffer og Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE), der er nødvendige for analysen.
    2. Lad alle buffere og fortyndere afbalancere til stuetemperatur. Forbered standarder og prøvefortyndinger anvende en tom plade med 96 brønde.
    3. Opløs serum matrix og frysetørret standard i henhold til producentens protokol og gøre 01:05 seriefortyndinger af standarden med den passende fortyndingsmiddel i 96-brønds plade. For de blanke brønde Brug den relevante fortyndingsmiddel.
    4. Fortynd alle kontroller og ukendte prøver 01:02 i passende fortyndingsmiddel i resten af ​​den 96-brønds plade.
    5. For perlen blanding, pipetteres den nødvendige mængde af den passende fortyndingsmiddel i en 15 ml rør. Vortex hver perle hætteglas i 20 sekunder og pipette den nødvendige mængde af hver analyt i 15 ml rør. Altid beskytte perlerne mod lys for at undgå fotoblegning. Anbring ikke 96-brønds plade på absorberende materiale for at undgå tab af prøven gennem fugtspredende.
  • Assay-protokollen
    1. Prewet med 96 brønde filter bundplade med 200 gl assaybuffer og muliggøre fuldstændig iblødsætning af filteret. Forsigtigt dræne vha. 96-brønds plade vakuumapparat og duppes tørre bunden af ​​pladen med en papirserviet.
    2. Ved hjælp af en multikanal pipette pipette 25 ul serum matrix til brøndene tildelt for de tomme felter og standarder samt pipette 25 ul Assay Buffer til brøndene tildelt for den kontrol og ubekendte.
    3. Afpipetteres 25 ul af blank, standarder, kontroller og ubekendte til de respektive tildelte brønde. Vortex perlen blanding i 20 sekunder og overføre perlerne til et reservoir.
    4. Afpipetteres 25 ul af perlen mix i hver brønd. Dæk pladen med aluminiumsfolie eller en uigennemsigtig plade låg til at beskytte mod lys.
    5. Forbered indfangningsantistoffet løsning. Pipette nødvendige mængde 0,1% PBS-T og fange antistof i et 15 ml rør og vortex i 10 sek. Overfør det indfangende antistof blanding til et reservoir og pipette 25 ul i hver brønd.
    6. Ryst pladen ved 500 rpm i en time ved stuetemperatur på en pladeryster. Tøm og vask pladen med 200 pi 0,1% PBS-T to gange. Hæld vandet fra og duppes tørt.
    7. Forbered SA-PE-løsning. Pipette nødvendige mængde 0,1% PBS-T og SA-PE i en 15 ml rør og vortex i 10 sek. Opløsningen overføres til et reservoir og pipette 25 ul i hver brønd.
    8. Ryst pladen ved 500 rpm i 30 minutter ved stuetemperatur på en pladeryster. Tøm og vask pladen med 200 pi 0,1% PBS-T to gange. Drain og b.parti tør.
    9. Tilsæt 100 pi 0,1% PBS-T og rystes på en pladeryster ved 500 rpm i mindst to minutter for at resuspendere perlerne. Læs og analysere pladen på Luminex LX200 maskinen.

    • 5.. IFN-γ/IL-4 ELISpot Forberedelse og analyse

    1. I en biologisk sikkerhedsskab milt behandle gennem 100 um nylon væv sier i 5 ml steril phosphatbufret saltvand (PBS) i sterile petriskåle. Lag splenocytterne på 3 ml lymfocytseparationsmedium i sterile 15 ml-rør.
    2. Centrifuger rørene ved 600 xg i 15 minutter for at adskille lymfocytter fra de røde blodlegemer. Overfør lagdelte lymfocytter over gradienten til nye sterile 15 ml-rør.
    3. Juster lydstyrken til 10 ml med steril PBS. Centrifugeres suspensionen ved 600 xg i 10 minutter for at pelletere cellerne.
    4. Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml PBS for cellelevedygtighed og tælle med Museanalysatoren. Følg Muse Count & Levedygtighed Kit protokol.
    5. Gør seriefortyndinger af lymfocytterne i 1,5 ml med skruelåg centrifugerør på fortyndingsfaktorer på 1:10, 01:20 og 01:40 (eller efter behov) i Count & Levedygtighed Reagent (minimum samlede volumen 300 ul). Pipette hver fortynding op og ned flere gange for at blande og analysere på Muse.
    6. Forbered en pladediagram af prøverne og betingelser for ELISpot pladen. Forbered ELISpot plade ifølge producentens protokol og pipette 100 ul medium peptid (10 ug / ml), eller scramble peptid (10 ug / ml) til hver brønd.
    7. Tilsæt 100 pi af cellesuspension, der leverer 1,0 x 10 6 celler til hver brønd og inkuberes pladen ved 37 ° C natten over.
    8. Følg producentens protokol for ELISPOT-analyse. Analyser udviklede ELISpot pladen ved hjælp af en dissektion mikroskop.
    9. Tal på resultaterne ved at tælle antallet af farvede pletter tilsvarenng til hver analyt i hver brønd. Pletterne svarer til antallet af spot-dannende celler (SFC) i hver brønd.

    6.. Immunhistokemi (IHC) og Hematoxylin & eosin (H & E) Farvning

    1. Tag blære tumorvæv bevaret som beskrevet ovenfor (afsnit 2.4.11), integrere i paraffin og trin-sektion på 4 um for immunhistokemisk analyse.
    2. Udfør IHC under anvendelse af en MUC1 antistof, der genkender tandemgentagelsesregionen af ​​MUC1. Brug Animal Research Kit peroxidase at minimere reaktiviteten af ​​det sekundære muse-antistof med endogent immunglobulin til stede i vævet.
    3. Udfør H & E farvning under anvendelse af standardprotokoller.

    7.. Statistiske metoder

    For Multiplex Fluorometric mikroperle Immunoassay bruge en to-halet Student t-test til at sammenligne den gennemsnitlige observerede serum cytokinkoncentrationer mellem behandling og kontrolgrupper. For ELISpot at anvende en én-way ANOVA til at sammenligne stedet danner kolonier mellem kontrol med medierne, krypterede peptid og peptid grupper. Brug Dunnetts Multiple Comparison Test for at mindske sandsynligheden for et falsk positivt resultat. En p-værdi på ≤ 0,05 anses signifikant forskellig for alle analyser.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Den prækliniske vurdering af virkningerne af nye immunterapier og kombinationer i blærekræft kræver udvikling af en passende dyremodel. I vores transgene musemodel, resulterede induktion med kemiske kræftfremkaldende OH-BBN i en høj blærekræft forekomsten af ​​overvejende TCC med nogle SCC, der svarer til blærekræft hos mennesker. At bestemme tumorhistologien, MUC1 ekspression status og immunresponset på peptidvaccine behandling blev 21 MUC1.Tg og 18 vildtypemus aflivet til indsamling af blod, blærer, og milte (figur 1) otte uger efter OH-BBN induktion (Uge 28). Den blærekræft incidens for både MUC1.Tg (14/21) og vildtype (12/18) mus var 67%. Hematoxylin og eosin (H & E)-farvning bekræftede tilstedeværelsen af ​​både TCC og SCC, med TCCs hovedparten er på et 2:1 forhold. Blandt disse, observerede vi en række lav og høj kvalitet noninvasive til high-grade invasive tumorer.Alle MUC1.Tg blærekræft prøver var positive for MUC1 ekspression ved IHC (Figur 2). Det skal bemærkes, at det anvendte antistof til MUC1 IHC genkender både normal og kræft menneskelig MUC1.

    Under model udvikling blev serumniveauerne af inflammatoriske cytokiner overvåget serielt mellem uge 8-28. Vi observerede, inflammatoriske cytokinniveauer steg med tiden fra induktion gennem slutningen af undersøgelsen (figur 3). Dette cytokin mønster er meget lig hvad vi tidligere observeret i vores lungekræft model 33, som antyder kraftigt at øge inflammatoriske cytokinniveauer kan korrelere med tumorudvikling.

    At vurdere Th1 serum cytokin respons til peptidet vaccine, 15 vaccinerede og 14 placebobehandlede MUC1.Tg mus var aflivet og blod blev opsamlet ved slutningen af ​​studiet i uge 28, 24 timer efter den sidste vaccine behandling. Multiplex analyse (Figure 4) viser øget Th1 serum cytokinniveauer af TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-12 (p70) og IL-17 i vaccinegruppen i forhold til placebogruppen. Niveauer af TNF-α, IFN-γ og IL-17 var signifikant højere (p <0,05) i de vaccine-behandlede mus. Disse resultater tyder på en Th1 polariseret cytokin respons til peptidet vaccine.

    For at vurdere Th1/Th2 immunrespons til peptidet vaccinen blev splenocytter vurderet af IFN-γ/IL-4 ELISpot. Fireogtyve timer efter den sidste behandling blev miltene indsamlet og behandlet for at isolere lymfocytter til ELISpot analyse. Lymfocytter blev talt og vurderet for levedygtighed af Muse Analyzer (figur 5). ELISpot plader blev podet med 1 x 10 6 levedygtige celler per brønd og udviklet 48 timer senere. Repræsentative resultater (figur 6) viser en klar og specifik IFN-γ reaktion til peptidet, hvilket bekræfter en Th1 immunrespons til peptidetvaccine.

    Figur 1
    Figur 1. Mus Obduktion. Obduktion blev udført ved 28 uger, 8 uger efter afslutningen af OH-BBN induktion. Lever, blære tumor, og milt er angivet. Stjerne (*) markerer punktere point for blodprøvetagning. I dette eksempel blev en høj kvalitet, invasive SCC overholdes. Klik her for at se større billede .

    Figur 2
    Figur 2. Repræsentative blære vævssnit farvet med H & E (til venstre) og human MUC1 IHC (til højre) i norma l blære, invasiv pladecellecarcinom, og invasive transitionel cellecarcinom. (A) normal urinblæren med slimhinde foret med transitoriske epithel, som viser diffus MUC1 reaktivitet. (B) reder af invasive SCC (pil) i submucosa. Organiseret keratin lag (stjerne) linje blæren slimhinde. Diffus MUC1 reaktivitet ses i reder af SCC. (C) mucosa indeholder TCC rager ind i lumen (venstre, til højre). Transitional celle karcinom er anaplastisk med invasion i submucosa og muskler (pil og indsat). Slimhinde og TCC rager ind lumen show diffuse MUC1 reaktivitet (højre, til højre), mens invasiv TCC har mindre fremtrædende reaktivitet (højre, til venstre). Bar = 200 um (main panel) og 50 um (indsat). Klik her for at se større billede .

    3 "fo: content-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3.jpg "width =" 600px "/>
    Figur 3. Inflammatoriske serumcytokiner på forskellige stadier af tumor udvikling. Serial serumprøver blev indsamlet af submandibulære blødninger ved baseline (8 uger), derefter hver 4. uge derefter indtil afslutning af studiet. Blod blev samlet (n = 4), og serum blev isoleret og analyseret for tilstedeværelse af 20 cytokiner. Koncentrationer repræsenterer middelværdien af ​​puljede prøver og barer repræsenterer det interval. Pile angiver det punkt, hvor OH-BBN dosering indgået. Klik her for at se større billede .

    Figur 4
    Figur 4..Th1 serumcytokiner efter peptidvaccine behandling. Serumprøver blev indsamlet ved afslutning af studiet, 24 timer efter den sidste dosis af vaccinen (n = 15) eller placebo (n = 14) og analyseret for tilstedeværelsen af 20 cytokiner. Data er vist som middelværdi cytokinkoncentrationer og barer repræsenterer positive standardafvigelse. * P <0,05 Klik her for at se større billede .

    Figur 5
    Figur 5. Repræsentative mus splenocyt histogram. Musesplenocytter blev isoleret ved afslutning af studiet og vurderes for optælling og levedygtighed ved hjælp af en Muse Analyzer. Venstre panel, cell viablility baseret på cellestørrelse. Højre panel, cellernes levedygtighed baseret på kerneceller (levende celler i grøn zone, døde celler i hvide zone). Klik her for at se større billede .

    Figur 6
    Figur 6.. Splenocyt LISpot analyse ved afslutning af studiet. (A) Repræsentant brønde viser IFN-γ (røde pletter) og IL-4 (blå pletter) produktion som reaktion på medierne, scrambled peptid og peptid. En klar IFN-γ, antigen-specifikt respons blev observeret med peptid eksponering. (B) Grafisk repræsentation af typiske IFN-γ ELISpot data, der viser middelværdien (± standardafvigelse) spot danner kolonier i respons på medier, røræg peptid og peptidet._blank "> Klik her for at se større billede.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Den vellykkede induktion af invasive overgangs-og planocellulært blærecarcinom i menneskelige MUC1.Tg mus tilbyder en præklinisk model for Immunterapi udvikling. Immunterapeutiske undersøgelser kræver brug af en spontan, immun intakt model for at vurdere den inflammatoriske respons på tumorprogression over tid samt immunresponset over for immunterapi. I en spontan tumor udvikling model forbliver tumormikromiljøet intakt og tumorer udvikler sig en mere repræsentativ vækstrate, der giver mulighed for vurdering af antitumor effekt af behandlingen. Desuden kan immunsystemet måles og overvåges via biomarkører, der giver mulighed for evaluering af behandlingseffekt.

    Andre tumorbærende musemodeller beskrevet i litteraturen til afprøvning immunterapi indbefatter både xenograftmodeller og transplantation modeller. Selv om disse modeller er praktisk og er blevet grundigt ansat i kræftforskning,Der er en række vigtige begrænsninger til at overveje, når der udføres immunterapeutisk studier. Hverken xenotransplantater eller transplanterede tumorer udvikler spontant, og de formere sig en mikromiljø, der ikke er repræsentativ for det væv, hvorfra tumorerne blev oprindeligt stammer. Desuden implanteret og transplanterede tumorer vokser hurtigere end spontane tumorer, så mindre tid til at studere de immune effekter af behandlingen. Vigtigst er det, disse modeller kræver værter med svækket immunforsvar.

    Ud over vores model, er der en række andre kemisk induceret blærekræft modeller. For eksempel N-[4 - (5-nitro-2-furyl)-2-thiazolyl] formamid (FANFT) og N-methyl-N-nitrosourinstof (MNU) har også vist sig at fremkalde blærekræft i både rotter og mus . Men disse kemikalier er lidt anderledes med hensyn til histologi af tumorerne de inducerer. FANFT primært inducerer urothelial cell carcinoma (UCC) med nogle SCC, mens MNU inducerer papillært karcinom, der i sidste ende resulterer i muskel-invasive tumorer med en lav forekomst af metastaser 34.. OH-BBN er almindeligt anvendt til blærekræft induktion i gnaver modeller, fordi de TCCs der udvikler ligner høj kvalitet menneskelige TCCs 34.. Kræft i urinblæren er også blevet induceret i hjørnetænder, kaniner og rotter samt hos mus ved hjælp af OH-BBN. Selvom hjørnetænder deler lignende metaboliske processer med mennesker med hensyn til bioaktivering for kræftfremkaldende stoffer 35, den latenstid for blærekræft udvikling beagler er 37 uger 36, og eksperimenter med hunde har både økonomiske og etiske overvejelser. Kaniner har endnu længere latensperioder, og når tilføjet til doseringen frist en minimum på 21 måneder kræves for TCC og SCC udvikling 37.. Svarende til mus, rotte modeller udvikler tumorer, der er histopatologisk ligner mennesker, med korte dosering perioder af 8 uger latensperioder 5 uger 38

    Tidligere har vi udviklet to immune intakte humane MUC1-udtrykkende spontane tumor modeller for både lunge 33 og brystkræft 39.. For at vurdere immunterapier i blærekræft, har vi udviklet en OH-BBN-induceret, spontan musemodel af blærecarcinom. Svarende til de tidligere beskrevne modeller 33,39, tumorer, der udvikler sig i denne model udtrykker tumor-associeret antigen MUC1 som en selvstændig molekyle, som er målet for peptidvaccine. Denne model viste en 67% forekomst af blæretumorer, som alle var positive for ekspression af humant MUC1. Histologiske vurderinger viste, at TCCs dominerende, hvilket er i overensstemmelse med, hvad der observeres i human blærekræft. Denne model er ideel til at studere bilcinogenesis, forebyggelsesstrategier og behandling af lokaliseret og fremskreden blærekræft hos mennesker. I fremtiden planlægger vi at foretage yderligere undersøgelser af immunterapi i kombination med kemoterapeutiske og strålebehandling i den beskrevne blærekræft model.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    DPV, GTW, SMG, CJK, AMG og GKH erklære nogen konkurrerende interesser. MWD er Principal Investigator af tilskud modtaget fra Merck KGaA, og MW er ansat Merck KGaA.

    Acknowledgments

    Forfatterne vil gerne takke UC Davis Mouse Biologi Program til avl af mus. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra Merck KGaA, Darmstadt, Tyskland.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagent 
    N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) TCI America B0938
    20 G Gavage Needles Popper Sons, Inc. 7921 Stainless steel
    Peptide Vaccine N/A N/A investigational agent
    BD Microtainers BD 365957
    Tissue Cassettes Simport M490-12
    10% Neutral Buffered Formalin Fisher Scientific SF100-4
    Lysis Buffer Pierce 87787
    Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail Thermo Scientific 78444
    Pierce BCA Protein Assay Kit Pierce 23225
    Mouse Cytokine 20plex Kit Invitrogen LMC006
    Magnetic Microsphere Beads Luminex MC100xx-01 xx is the bead region
    Anti-mouse TNF- Capture Antibody BD Pharmingen 551225
    Anti-mouse TNF- Detection Antibody BD Pharmingen 554415
    Anti-mouse IFN- Capture Antibody Abcam ab10742
    Anti-mouse IFN- Detection Antibody Abcam ab83136
    PBS, pH 7.4 Sigma P3813-10PAK
    Tween-20 Fisher BP337-500
    Assay Buffer Millipore L-MAB
    Cytokine Standard Millipore MXM8070
    Multi-screen HTS 96well filter plates Millipore MSBVN1210
    SA-PE Invitrogen SA10044
    100 m Nylon Tissue Sieves BD 352360
    Splenocyte Separation Media Lonza 17-829E
    TNF- /IL-4 ELISpot plates R&D Systems ELD5217
    Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody Epitomics 2900-1
    Goat Anti-actin monoclonal antibody Sigma A1978
    Anti-rabbit HRP antibody Promega W401B
    Goat anti-mouse HRP antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. SC-2005
    PVDF membrane BioRad 162-0174
    Mini Protean TGX Precast Gels BioRad 456-1083
    Muse Count & Viability Kit Millipore MCH100104
    MUC1 Antibody BD Pharmingen 550486 IHC antibody
    Animal Research Peroxidase Kit Dako K3954 IHC staining
    Equipment and Software
    Millipore plate vaccum apparatus Millipore MSVMHTS00
    Luminex Lx200 Millipore / Luminex 40-013 Manufactured by Luminex, distributed by Millipore
    Luminex Xponent Software Millipore / Luminex N/A Version 3.1; included with Luminex Lx200
    Milliple Analyst Software Milliplex / VigeneTech 40-086 Version 5.1
    Muse Cell Analyzer Millipore 0500-3115
    Muse Software Millipore N/A Version 1.1.0.0; included with Analyzer
    Dissecting Microscope Unitron Z730
    Graphpad Prism Software Graphpad Software Inc. N/A Version 5.1
    Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus BioRad 165-8001
    Trans Blot SD Cell and PowerPac BioRad 170-3849

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Siegel, R., Naishadham, D., et al. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
    2. Lynch, C. F., Davila, J. A. Chapter 23. Cancer of the urinary bladder. SEER Survival Monograph: Cancer Survival Among Adults: U.S. SEER Program, 1988-2001, Patient and Tumor Characteristics. Ries, L. A. G., Young, J. L., et al. , National Cancer Institute, SEER Program. Bethesda, MD. 07-6215 (2007).
    3. Jacobs, B. L., Lee, C. T., et al. Bladder cancer in 2010: how far have we come. CA Cancer J. Clin. 60 (4), 244-272 (2010).
    4. Sexton, W. J., Wiegand, L. R., et al. Bladder cancer: a review of non-muscle invasive disease. Cancer Control. 17 (4), 256-268 (2010).
    5. Bohle, A., Jocham, D., et al. Intravesical bacillus Calmette-Guerin versus mitomycin C for superficial bladder cancer: a formal meta-analysis of comparative studies on recurrence and toxicity. J. Urol. 169 (1), 90-95 (2003).
    6. Shokeir, A. A. Squamous cell carcinoma of the bladder: pathology, diagnosis and treatment. BJU Int. 93 (2), 216-220 (2004).
    7. Rosenberg, S. A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature. 411 (6835), 380-384 (2001).
    8. Joudi, F. N., Smith, B. J., et al. Final results from a national multicenter phase II trial of combination bacillus Calmette-Guerin plus interferon alpha-2B for reducing recurrence of superficial bladder cancer. Urol. Oncol. 24 (4), 344-348 (2006).
    9. Lau, S. K., Weiss, L. M., et al. Differential expression of MUC1, MUC2, and MUC5AC in carcinomas of various sites: an immunohistochemical study. Am. J. Clin. Pathol. 122 (1), 61-69 (2004).
    10. Hollingsworth, M. A., Swanson, B. J. Mucins in cancer: protection and control of the cell surface. Nat. Rev. Cancer. 4 (1), 45-60 (2004).
    11. Scholfield, D. P., Simms, M. S., et al. MUC1 mucin in urological malignancy. BJU Int. 91 (6), 560-566 (2003).
    12. Devine, P. L., McKenzie, I. F. Mucins: structure, function, and association with malignancy. Bioessays. 14 (9), 619-625 (1992).
    13. Jerome, K. R., Barnd, D. L., et al. Cytotoxic T-lymphocytes derived from patients with breast adenocarcinomas recognize an epitope present on the protein core of a mucin molecule preferentially expressed by malignant cells. Cancer Res. 51 (11), 2908-2916 (1991).
    14. Takahashi, T., Makiguchi, Y., et al. Expression of MUC1 on myeloma cells and induction of HLA-unrestricted CTL against MUC1 from a multiple myeloma patient. J. Immunol. 153 (5), 2102-2109 (1994).
    15. Choi, C., Witzens, M., et al. Enrichment of functional CD8 memory T cells specific for MUC1 in bone marrow of patients with multiple myeloma. Blood. 105 (5), 2132-2134 (2005).
    16. Barnd, D. L., Lan, M. S., et al. Specific, major histocompatibility complex- unrestricted recognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T-cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (18), 7159-7163 (1989).
    17. Ioannides, C. G., Fisk, B., et al. Cytotoxic T-cells from ovarian malignant tumors can recognize polymorphic epithelial mucin core peptides. J. Immunol. 151 (7), 3693-3703 (1993).
    18. Tang, C. K., Katsara, M., et al. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. Expert Rev. Vaccines. 7 (7), 963-975 (2008).
    19. Mukherjee, P., Ginardi, A. R., et al. MUC1-specific cytotoxic T lymphocytes eradicate tumors when adoptively transferred in vivo. Clin. Cancer Res. 7, 848-855 (2001).
    20. Acres, B., Limacher, J. M. MUC1 as a target antigen for cancer immunotherapy. Expert Rev. Vaccines. 4 (4), 493-502 (2005).
    21. Butts, C., Murray, N., et al. Randomized phase IIB trial of BLP25 liposome vaccine in stage IIIB and IV non-small-cell lung cancer. J. Clin. Oncol. 23 (27), 6674-6681 (2005).
    22. Butts, C., Maksymiuk, A., et al. Updated survival analysis in patients with stage IIIB or IV non-small-cell lung cancer receiving BLP25 liposome vaccine (L-BLP25), phase IIB randomized, multicenter, open-label trial. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 137 (9), 1337-1342 (2011).
    23. Agrawal, B., Krantz, M. J., et al. Rapid induction of primary human CD4+ and CD8+ T cell responses against cancer-associated MUC1 peptide epitopes. Int. Immunol. 10 (12), 1907-1916 (1998).
    24. Palmer, M., Parker, J., et al. Phase I study of the BLP25 (MUC1 peptide) liposomal vaccine for active specific immunotherapy in stage IIIB/IV non-small-cell lung cancer. Clin. Lung Cancer. 3 (1), 49-57 (2001).
    25. Walsh, M. D., Hohn, B. G., et al. Mucin expression by transitional cell carcinomas of the bladder. Br. J. Urol. 73 (3), 256-262 (1994).
    26. Murray, A., Simms, M., et al. Production and characterization of rhenium-188-C595 antibody for radioimmunotherapy of transitional cell bladder cancer. J. Nucl. Med. 42 (5), 726-732 (2001).
    27. Hughes, O., Bishop, M., et al. Targeting superficial bladder cancer by the intravesical administration of 67copper-labelled anti-MUC1 mucin monoclonal antibody C595. J. Clin. Oncol. 18 (2), 363-370 (2000).
    28. Conn, I. G., Crocker, J., et al. HMFG-2 as a prognostic indicator in superficial bladder cancer. J. Clin. Pathol. 41 (11), 1191-1195 (1988).
    29. Hughes, O., Denley, H., et al. MUC1 mucin expression in transitional cell carcinoma of the bladder: a target for diagnosis and therapy with monoclonal antibody C595. J. Urol. Pathol. 12, 185-197 (2000).
    30. Rowse, G. J., Tempero, R. M., et al. Tolerance and immunity to MUC1 in a human MUC1 transgenic murine model. Cancer Res. 58 (2), 315-321 (1998).
    31. Mukherjee, P., Madsen, C. S., et al. Mucin-1 specific immunotherapy in a mouse model of spontaneous breast cancer. J. Immunother. 26 (1), 47-62 (2003).
    32. McCormick, D. L., Ronan, S. S., et al. Influence of total dose and dose schedule on induction of urinary bladder cancer in the mouse by N-butyl-N-(4-hydroxy-butyl)nitrosamine. Carcinogenesis. 2 (3), 251-254 (1981).
    33. Wurz, G. T., Gutierrez, A. M., et al. Antitumor effects of L-BLP25 antigen-specific tumor immunotherapy in a novel human MUC1 transgenic lung cancer mouse model. J. Transl. Med. 11, 10-1186 (2013).
    34. Kunze, E., Schauer, A., et al. Stages of transformation in the development of N-butyl-N-(4hydroxybutyl)-nitrosamine-induced transitional cell carcinomas in the urinary bladder of rats. Z Krebsforsch Klin. Onkol. Cancer Res. Clin. Oncol. 87 (2), 139-160 (1976).
    35. Crallan, R. A., Georgopoulos, N. T., et al. Experimental models of human bladder carcinogenesis. Carcinogenesis. 27 (3), 374-381 (2006).
    36. Samma, S., Uemura, H., et al. Rapid induction of carcinoma in situ in dog urinary bladder by sequential treatment with N-methyl-N'-nitrosourea and N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine. Gann. 75 (5), 385-387 (1984).
    37. Bornhof, C., Wolfrath, G., et al. Induction of urinary bladder urothelial cancers in the rabbit by dibutylnitrosamine with an artificial bladder calculus as cocarcinogen. Urologe A. 28 (6), 339-343 (1989).
    38. Irving, C. C., Tice, A. J., et al. Inhibition of N-n-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamine-induced urinary bladder cancer in rats by administration of disulfiram in the diet. Cancer Res. 39 (8), 3040-3043 (1979).
    39. Mehta, N. R., Wurz, G. T., et al. L-BLP25 vaccine plus letrozole induces a TH1 immune response and has additive antitumor activity in MUC1-expresssing mammary tumors in mice. Clin. Cancer Res. 18 (10), 2861-2871 (2012).

    Tags

    Medicin urinblære Animals genetisk modificerede Cancer Vaccines Immunterapi dyreforsøg Models Neoplasmer blærekræft C57BL / 6 mus MUC1 Immunterapi præklinisk model
    Induktion af Invasive Transitional Cell blærecarcinom i Immune intakt humant MUC1 transgene mus: En model for immunterapi Development
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Vang, D. P., Wurz, G. T., Griffey,… More

    Vang, D. P., Wurz, G. T., Griffey, S. M., Kao, C. J., Gutierrez, A. M., Hanson, G. K., Wolf, M., DeGregorio, M. W. Induction of Invasive Transitional Cell Bladder Carcinoma in Immune Intact Human MUC1 Transgenic Mice: A Model for Immunotherapy Development. J. Vis. Exp. (80), e50868, doi:10.3791/50868 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter