Summary
Ein N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosamin-induzierten Blasenkrebs Modell wurde in menschlichen Mucin-1 (MUC1) transgenen Mäusen zur Prüfung MUC1-gerichtete Immuntherapie entwickelt. Nach Verabreichung eines MUC1-Peptid-Impfstoff gezielt wurde eine zytotoxische T-Lymphozyten-Reaktion auf MUC1 durch Messung Serum Cytokinspiegel und T-Zell-spezifische Aktivität bestätigt.
Abstract
Einem präklinischen Modell von Harnblasenkarzinom in menschlichen Mucin-1 (MUC1) transgene (MUC1.Tg) Mäuse für den Zweck der Bewertung Immuntherapie und / oder zytotoxische Chemotherapie entwickelt. Um Blasenkrebs, C57BL / 6 Mäuse (MUC1.Tg und Wildtyp) wurden oral mit dem Karzinogen N-Butyl-N-(4-hydroxybutyl) Nitrosamine (OH-BBN) bei 3,0 mg / Tag behandelt, 5 Tage / Woche induzieren für 12 Wochen. Um die Auswirkungen der OH-BBN auf Serum-Zytokin-Profil während der Tumorentwicklung zu bewerten, wurde Vollblut über submandibular blutet vor der Behandlung und alle vier Wochen gesammelt. Außerdem wurden ein MUC1-Peptid-Impfstoff gezielte und Placebo Gruppen von Mäusen wöchentlich acht Wochen lang verabreicht. Multiplex fluorometrische Mikrokügelchen immunoanalyses von Serum Zytokine während der Tumorentwicklung und nach der Impfung durchgeführt. Bei Beendigung, Interferon-gamma (IFN-γ) / Interleukin-4 (IL-4) ELISpot Analyse für MUC1 spezifischen T-Zell-Immunantwort und histopathologischen Auswertungen der Tumorartund Grad durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass: (1) das Vorkommen von Blasenkrebs in beide MUC1.Tg und Wildtyp-Mäusen betrug 67%, (2) Übergangsregelung Karzinome (TCC) im Verhältnis 2:1 entwickelt, um Plattenepithelkarzinome (SCC) im Vergleich , (3) inflammatorische Zytokine mit der Zeit während der Tumorentwicklung erhöht, und (4) Verwaltung des Peptid-Impfstoff induziert eine Th1-polarisierten Serum Zytokinprofil und MUC1 spezifischen T-Zell-Antwort. Alle Tumoren in Mäusen MUC1.Tg waren für MUC1 Ausdruck positiv, und die Hälfte aller Tumoren in MUC1.Tg und Wildtyp-Mäusen waren invasiv. Abschließend mit einem Team-Ansatz durch die Koordinierung der Bemühungen der Pharmakologen, Immunologen, Pathologen und Molekularbiologen haben wir ein Immunsystem intakt transgenen Mausmodell von Blasenkrebs, die hMUC1 Ausdruck entwickelt.
Introduction
Blasenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart und die achte häufigste Ursache für Todesfälle durch Krebs bei amerikanischen Männern. In den Vereinigten Staaten sind schätzungsweise 72.500 Neuerkrankungen und 15.000 Todesfällen von Blasenkrebs bei Männern und Frauen im Jahr 2013 1 kombiniert erwartet. Die Inzidenz von Blasenkrebs ist etwa dreimal so hoch bei Männern als bei Frauen. In den Vereinigten Staaten, Konto Übergangszeit Karzinome (TCC) für über 90% der Fälle, während Plattenepithelkarzinome (SCC) eine Inzidenz von weniger als 2% 2 haben. Der gesamte relative 5-Jahres-Überlebensrate für papilläre TCC ist 91,5% im Vergleich zu nur 30,9% für 2 SCC. Obwohl invasiven papillären TCCs entfallen rund 75% der Fälle zum Zeitpunkt der Diagnose, Behandlung sogar mit mehr als 50% der Patienten ein Rezidiv innerhalb von 5 Jahren zu erleben, mit bis zu 30% dieser Patienten voran zu Muskel-invasive Erkrankungen 3,4 . Typische Behandlungsschemata für Nicht-Muskel-invAsive Krankheit sind transurethrale Resektion (TUR) durch intravesical Chemotherapie. Bei Patienten mit hochgradigen Ta oder T1-Tumoren kann eine Wiederholung TUR vor der Chemotherapie 3,4 durchgeführt werden. Für jene Patienten mit low-grade Ta Rezidiven oder hochwertigem Ta oder T1-Läsionen, gefolgt von TUR adjuvante Chemotherapie oder Immuntherapie in Form von Bacillus Calmette-Guerin (BCG) 3,4 verwendet werden können. BCG hat sich gezeigt, überlegen zu sein intravesical Mitomycin C mit Bezug auf die Zeit, um eine Wiederholung 5. Für T2 Muskel invasive Erkrankungen, ist die radikale Zystektomie mit oder ohne neoadjuvante Chemotherapie die empfohlene Kur 3. Bei Patienten mit SCC erscheint Zystektomie die effektivste Behandlung 6 sein. Angesichts der sehr hohen Raten von Rückfällen trotz der besten Behandlungen zur Verfügung, es ist eindeutig ein Bedarf für neue, effektivere Therapien für Blasenkrebs.
Ausbau neuer Immuntherapien zur abgeschlossenem Satzer Krebs ist ein möglicher Ansatz, die Versprechen für die Verlängerung des krankheitsfreien Überlebens halten kann. Historisch gesehen hat BCG die einzige effektive Immuntherapie für Blasenkrebs. Seine Wirkungsweise wird angenommen, dass die nicht-spezifische Induktion einer T-Helfer 1 (Th1) die Immunantwort durch die Erhöhung des Niveaus von Interleukin-2 (IL-2) und Interferon gamma (IFN-γ) 4 umfassen. Zelluläre oder Th1 Immunität, ist kritisch in Krebs-Immuntherapie als humorale oder Th2 hat Immunität nie als wirksam gegen feste Tumoren, mit Ausnahme von Antikörpern gegen Wachstumsfaktor-Rezeptoren 7 gerichtet. In einem Versuch, auf die Vorteile der BCG-Monotherapie zu verbessern, wurde IFN-α 2B/BCG Kombination Immuntherapie in einer klinischen Phase-II-Studie mit eindeutigen Ergebnisse 8 bewertet. Ein alternativer Ansatz zur Immuntherapie für Blasenkrebs sein kann, um Tumor-assoziierte Antigene (TAA), die Identifizierung von denen gemacht Krebsimmuntherapie präziser 7 hat gezielt
Eine solche TAA Mucin 1 (MUC1), der ein Zelloberflächen-Glykoprotein in vielen epithelialen Tumoren wie Blasen-, Brust-, Lungen-und Bauchspeicheldrüsenkrebs 9,10 überexprimiert ist. Die Expression und Modifikation von MUC1 auch im wesentlichen während der Karzinogenese verändert, macht, dass underglycosylation antigene Sequenzen von Aminosäuren, wie variable Anzahl von Tandem-Repeats (VNTR) auf dem Peptid Kern bekannt. Während MUC1 ist ein selbst-Molekül sind diese immundominante VNTR-Regionen in der Regel nicht durch umfangreiche Glykosylierung ausgesetzt, und somit werden sie vom Immunsystem als fremd 11,12 gesehen. Zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), die spezifisch erkennen MUC1-Epitope aus den Tumor-Lymphknoten von Brustkrebspatientinnen 13 sowie Blut und Knochenmark von Myelom-Patienten isoliert wurden 14,15, so dass MUC1 ein potentielles Ziel für eine zellulären Immunantwort. Die immundominante VNTRs der underglycosylated Form von MUC1 durch CTLs erkannt wird, was die Zerstörung von Tumorzellen 16-19. Native zelluläre und / oder humorale Immunantwort gegen Krebs MUC1 sind jedoch nicht stark genug, um Tumoren zu eliminieren. Um die bereits bestehende schwache Immunantwort auf MUC1 vermehren können synthetische Peptide immundominante durch Impfung eingeführt werden, um eine CTL-Reaktion stark genug, um einen klinischen Nutzen zu generieren 18,20 sein. Ein MUC1 liposomalen Impfstoff wurde bereits gezeigt, dass das Überleben bei Patienten mit Lungenkrebs 21,22 zu erhöhen, erzeugen CTLs, die töten MUC1-positive Tumorzellen, und produzieren eine Th1-polarisierten Zytokinantwort 23,24. Mit einer hohen Expression von MUC1 9,11,25, Blasenkrebs ist ein logischer Kandidat für die Prüfung MUC1 gerichtet Immuntherapie 26,27. Ferner weist MUC1 Potential als prognostischer Faktor in Blasenkrebs 28. MUC1-Expression in TCC signifikant Stadium und Grad zugeordnet ist, und metastatischen TCCEs wurde gezeigt, weiterhin MUC1 29 auszudrücken.
Um die potentielle Nützlichkeit von MUC1-gerichtete Immuntherapie bei Blasenkrebs auszuwerten, haben wir eine intakte menschliche Immunsystem MUC1 (hMUC1)-exprimierenden transgenen (MUC1.Tg) Mausmodell von Blasenkrebs congenic auf der C57BL / 6 Hintergrund 30. Menschliche MUC1 ist als selbsttragende Protein unter der Kontrolle seines eigenen Promotors, was zu einer Gewebe-Expressionsmuster mit dem von Menschen beobachtet 30,31 ausgedrückt. Die Mäuse wurden mit dem bekannten Blase Karzinogen N-Butyl-N-(4-Hydroxybutyl) Nitrosamin (OH-BBN) 32, und dann die resultierenden Tumoren wurden hMUC1 Expression und Tumorart und Note bewertet induziert. Um die Wirkung des karzinogen auf Th1/Th2 Cytokinspiegel während der Tumorentwicklung zu untersuchen, wurden Serumproben regelmäßig für Multiplex-Analyse gesammelt. Die Mäuse wurden dann mit einer MUC1-Peptid-Impfstoff gezielt behandelt, und das Serum von Cytokinen und Immunantworten Auswertungted von Multiplex-Immunoassay fluorometrische Mikrokügelchen und ELISpot.
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Protocol
Alle tierexperimentellen Studien und Experimente wurden unter einem Protokoll, das von der University of California, Davis Institutional Animal Care und Verwenden Administrative Advisory Committee genehmigt durchgeführt.
1. MUC1.Tg Maus Zucht und Vermehrung
- Die UC Davis Mausbiologie Program (MBP) Rassen Wildtyp C57BL / 6 männlichen Mäusen mit heterozygoter MUC1.Tg C57BL / 6 weiblichen Mäusen zu unserer Zucht Kolonie zu gründen. MUC1.Tg Nachkommen für Studien geliefert, wie gebraucht.
- MBP Personal Clip die Zehen der Nachkommen in einem definierten Muster (0-99) für Maus-Identifikation, und falls anwendbar Clip der Schwanz. Die Zehe oder Schwanz Gewebe zur Genotypisierung mit Standard-DNA-Extraktion und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Analyse verarbeitet.
2. Studiendesign
- Studiengruppe Zuordnungen
- Wiegen Sie jede Maus einzeln auf einer Waage und notieren das Gewicht in Gramm für jede Maus.
- Dieser Teil des Verfahrens invOlvés die Methodik und Design der Studie. Für den ersten Teil der Studie, weisen Alter abgestimmte MUC1.Tg und Wildtyp-Mäusen zu Blasenkrebs Induktion mit OH-BBN starten. Euthanize Mäusen 8 Wochen nach der letzten OH-BBN Dosis, um das Vorhandensein von Tumoren der Blase durch Histologie bestätigen.
- Für den zweiten Teil der Studie zufällig männlichen Mäusen MUC1.Tg in die entsprechende Anzahl von Behandlungs-und Kontrollgruppen. Diese Mäuse werden für Serum Zytokine und T-Zell-Immunantwort während der Induktion und Tumorentwicklung überwacht werden, und dann bei Beendigung der Studie 8 Wochen nach der letzten Dosis OH-BBN.
- Bladder Cancer Induction
- OH-BBN ist krebserregend und hochgiftig. Bitte lesen und befolgen Sie die Anweisungen des Sicherheitsdatenblatt bei der Handhabung und Speicherung dieser Chemikalie.
- Berechnen Sie die Dosierung Lösung Konzentration erforderlich, um die entsprechende Dosis (3 mg) in einem Volumen von 100 ul liefern, jeder Maus auf den durchschnittlichen Gewichte und numbe Basisr von Mäusen in jeder Studie und Gruppe.
- Verdünnen Sie die OH-BBN in 100% Ethanol. Bringen Sie die endgültige Konzentration 30 mg / ml mit sterilem Wasser. Die endgültige Ethanol: Wasser-Konzentration sollte 20:80, v / v.
- Verwalten des OH-BBN oral mittels Edelstahl, 20 G Nadeln Magensonde täglich, 5 Tage / Woche für 12 Wochen auf der Behandlungsgruppe Zuordnung ab dem Alter von 8 Wochen bezogen.
- Impfung Behandlungen
- Den Inhalt jeder Flasche des lyophilisierten Peptids Impfstoff in 600 ul 0,9% sterile Kochsalzlösung und gründlich, indem die Lösung durch einen 0,5-Zoll-27 G Nadel 6x resuspendieren. Unter Verwendung von Kochsalzlösung, passen die Konzentration, so dass die gewünschte Dosis in einem Volumen von 100 ul geliefert wird.
- Ab Woche 20, nach der letzten Dosis von OH-BBN, die Verwaltung der Impfstoff auf einer wöchentlichen Basis für einen Acht-Wochen-Zyklus durch subkutane Injektion von 100 ul mit einer 25 G-Nadel (KW entspricht dem Alter der Mäuse).
- Überwachung und Probenahme
- Wiegen Sie alle Mäuse und tasten auf das Vorhandensein von neuen Tumoren einmal pro Woche. Euthanize keine Mäuse, die ≥ 20% des Körpergewichts verloren haben oder wenn es tastbare Tumoren, Blut im Urin und / oder Harnverhalt sind.
- Vor der ersten OH-BBN Dosis und dann in 4-wöchigen Abständen, sammeln Vollblut über submandibular blutet. Das Blut in Serum Blutgerinnung Rohre (BD Microtainer), und lassen Sie 30 Minuten für die Blutgerinnung.
- Zentrifuge die Blutproben in einer Mikrozentrifuge bei 3.500 xg für 10 min. Sorgfältig übertragen die Serum Kappe Kryoröhrchen mit einer Pipette zu schrauben.
- Blitzeis in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C bis zur weiteren Analyse von Multiplex.
- Acht Wochen nach der letzten Dosis von OH-BBN, einschläfern alle Mäuse durch CO 2-Erstickung.
- Platzieren Sie jede Maus auf eine Dissektion Bord und festzunageln von allen vier Gliedmaßen.
- Mit einer Pinzette und Schere, make ein horizontaler Schnitt in der oberen Bauchgegend. Setzen Sie die Schere in den Einschnitt zwischen der Epidermis und Bauchwand und vorsichtig trennen die Haut vom darunter liegenden Gewebe mit Hilfe der Pinzette.
- Einen vertikalen Schnitt von der horizontalen Schnitt nach der Mittelachse in Richtung des vorderen Endes der Maus. Trennen Sie die Haut vor dem Brustkorb und unter Verwendung einer 1 ml Spritze und einer 22 G Nadel durchstechen das Herz und Blut sammeln mit einer glatten und stetigen Unentschieden.
- Siehe 2.4.3 und 2.4.4 für Serum Isolierung und Lagerung fort.
- Mit einer Pinzette und Schere, schneiden und schälen zurück der Rest der Epidermis. Schnitt durch die Bauchdecke und Bauchfell und aseptisch entfernen Blasentumor für Immunhistochemie (IHC) und Western Blot.
- Sammle Milz für die Lebensfähigkeit der Zellen-Analyse (Muse) und ELISpot. Für IHC, Ort Blasentumor Probe in Gewebekassette und fixieren in gekühlten Formalin über Nacht bei Raumtemperatur. Am folgenden Tag, ersetzen Sie das Formalin mit 70% Ethanol.
- Für die Western-Blot-Analyse des Tumors, den Tumor zu homogenisieren, fügen Proteinextraktion Puffer plus Halt Protease-Inhibitoren und Transfer zum 1,5-ml-Röhrchen.
- Vortex für 30-60 sec und halten auf Eis für 5 min. Blitz in flüssigem Stickstoff und Auftauen in das umgebende Wasser einfrieren. Wiederholen Sie den Vorgang der Verwirbelung, Einfrieren und Auftauen zweimal.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g für 10 min bei 4 ° C und übertragen Sie die Zellextrakte auf neue Röhren beschriftet.
- Quantifizierung der Konzentration durch Ausführen einer Bicinchoninsäure Protein Assay (BCA) für die Protein-Messungen. Proben bei -80 ° C bis bereit für Western-Blot-Analyse.
3. Molecular Biology / Western
Die folgenden Verfahren wurden durchgeführt, um die Expression von MUC1 in Blasemaus Tumorgewebe mit Standard Western Blot Protokoll überprüfen (Daten nicht zeigenn).
- Trennen Sie die Proteinextrakte durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) und dann übertragen auf PVDF-Membran mit halbtrockenen Vorrichtung.
- Blockieren Sie das Protein übertragen Membran mit 5% Magermilch in 0,1% Tween-20 in Phosphate Buffered Saline (PBS-T) pH 7,4 für 1 Stunde auf einem Schüttler bei Raumtemperatur.
- Inkubieren der Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler mit anti-MUC1 oder anti-β-Actin-Antikörper in 0,1% PBS-T.
- Waschen der Membran durch Dekantieren der Lösung und Zugabe von 0,1% PBS-T. Swirl die Membran auf dem Schüttler für 5 min und dekantiert. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Inkubieren der Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit einem Meerrettich-Peroxidase (HRP)-konjugierten sekundären Antikörper.
- 3x waschen (siehe Schritt 3.4).
- Verfolgen Sie das Protokoll für die Enhanced Chemilumineszenz (ECL) Kit zu aktivieren und lesen Sie die Fluorographie.
4. Multiplex Fluorometric Microbead Immunoassay
<ol>- Mit einer 96-Well-Platte Karte zuweisen Blanks, Standards, Kontrollen und Proben in die Vertiefungen. Berechnen Sie die Anzahl und das Volumen des Analyten zu erfassen Antikörper und Streptavidin-Phycoerythrin (SA-PE) für den Assay benötigt.
- Lassen Sie alle Puffer und Verdünnungsmittel auf Raumtemperatur ins Gleichgewicht. Bereiten Sie die Standards und Probe Verdünnungen mit einem leeren 96-Well-Platte.
- Die Rekonstitution der lyophilisierten Matrix und Serum-Standard nach dem Protokoll des Herstellers und stellen 1.05 serielle Verdünnungen der Standardlösung mit dem geeigneten Verdünnungsmittel in 96-Well-Platte. Für die leeren Brunnen, verwenden Sie die entsprechende Verdünnungsmittel.
- Verdünnen alle Kontrollen und unbekannten Proben 1:2 in der geeigneten Verdünnungsmittel in dem Rest der 96-Well-Platte.
- Für die perlenmix, Pipette das erforderliche Volumen des geeigneten Verdünnungsmittel in einen 15-ml-Tube. Vortex jede Perle Fläschchen für 20 sec und Pipette das erforderliche Volumen der einzelnen Analyten in der 15 ml Tube. Schützen Sie die Perlen von Licht zu vermeiden Bleichen. Stellen Sie den 96-Well-Platte auf einer saugfähigen Unterlage zum Verlust der Probe durch Feuchtigkeitsregulierung vermeiden.
- Prewet den 96er Filter Bodenplatte mit 200 ul Assay-Puffer und ermöglichen vollständige Einweichen des Filters. Vorsichtig mit der 96-Well-Platte Vakuumapparatur abtropfen lassen und trocken tupfen die Unterseite der Platte mit einem Papiertuch.
- Mit einer Mehrkanal-Pipette Pipette 25 ul Serummatrix in die Vertiefungen für die Leer-und Standardproben und Pipette 25 ul Assay-Puffer in die Vertiefungen für die Kontrollen und die Proben zugeordnet.
- Je 25 ul des Rohlings, Normen, Kontrollen und Unbekannten zu den jeweils zugeordneten Vertiefungen. Vortex der Wulst-Mix für 20 sec und übertragen Sie die Perlen mit einem Reservoir.
- Je 25 ul der perlenmix in jede Vertiefung. Die Platte mit Aluminiumfolie oder einem opaken Platte Deckel den Inhalt vor Licht zu schützen.
- Bereiten Sie die Capture-Antikörper-Lösung. Pipette die erforderliche Menge von 0,1% PBS-T und Capture Antikörper in ein 15 ml Röhrchen und Vortex für 10 Sekunden. Übertragen Sie die Capture-Antikörper-Mix zu einem Reservoir und Pipette 25 ul in jede Vertiefung.
- Schütteln Sie die Platte bei 500 rpm für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Abtropfen lassen und waschen Sie die Platte mit 200 ul 0,1% PBS-T zweimal. Abtropfen lassen und trocken tupfen.
- Bereiten Sie die SA-PE Lösung. Pipettieren Sie die gewünschte Lautstärke von 0,1% PBS-T und SA-PE in einen 15-ml-Tube und Vortex für 10 Sekunden. Die Lösung wird in einem Reservoir und Pipette 25 ul in jede Vertiefung.
- Schütteln Sie die Platte bei 500 rpm für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Schüttler. Abtropfen lassen und waschen Sie die Platte mit 200 ul 0,1% PBS-T zweimal. Abtropfen lassen und bLos trocken.
- Je 100 ul 0,1% PBS-T und schütteln auf einem Schüttler bei 500 rpm für mindestens zwei Minuten, um die Beads zu resuspendieren. Lesen und analysieren die Platte auf dem Luminex Lx200 Maschine.
5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Vorbereitung und Analyse
- In einem biologischen Sicherheitsschrank, verarbeiten die Milz durch 100 um Nylon Gewebe Siebe in 5 ml steriler Phosphat-gepufferte Saline (PBS) in sterile Petrischalen. Schicht die Splenozyten auf 3 ml Lymphozyten-Trennmedium in sterile 15-ml-Röhrchen.
- Die Röhrchen bei 600 g für 15 min, um die Lymphozyten aus den roten Blutzellen zu trennen. Übertragen Sie die geschichteten Lymphozyten über dem Gradienten, neue sterile 15-ml-Röhrchen.
- Stellen Sie die Lautstärke auf 10 ml mit sterilem PBS. Wird die Suspension bei 600 × g für 10 min die Zellen zu pelletieren.
- Saugen Sie den Überstand und die Zellen in 1 ml PBS für die Lebensfähigkeit der Zellen und zählen mit der MuseAnalysator. Folgen Sie der Muse Count & Lebensfähigkeit Kit-Protokoll.
- Als serielle Verdünnungen der Lymphozyten in 1,5 ml Schraubdeckel Zentrifugenröhrchen bei Verdünnung von 1:10, 1:20 und 01.40 Uhr (oder nach Bedarf) in Count & Lebensfähigkeit Reagent (minimale Gesamtvolumen 300 ul). Pipettieren jeder Verdünnung nach oben und unten mehrmals zu mischen und auf die Muse zu analysieren.
- Bereiten Sie einen Teller Karte von den Proben und Bedingungen für die ELISpot Platte. Bereiten Sie die ELISpot Platte nach dem Protokoll des Herstellers und Pipette 100 ul Medium, Peptid (10 ug / ml) oder Gerangel Peptid (10 ug / ml) in jede Vertiefung.
- Je 100 ul Zellsuspension, liefert 1,0 x 10 6 Zellen in jede Vertiefung und Inkubation der Platte bei 37 ° C über Nacht.
- Folgen Sie dem Protokoll des Herstellers für den ELISPOT-Assay. Analysieren Sie den entwickelten ELISpot Platte mit einem Dissektionsmikroskop.
- Quantifizierung der Ergebnisse durch Zählen der Anzahl von farbigen Flecken corresponding auf jeden Analyten in jede Vertiefung. Die Spots mit der Anzahl der vor Ort-Zellen (SFC) in jede Vertiefung entsprechen.
6. Immunhistochemie (IHC) und Hämatoxylin & Eosin (H & E) Färbung
- Nehmen Blase Tumorgewebe erhalten wie oben beschrieben (Abschnitt 2.4.11), in Paraffin und Schritt-Abschnitt bei 4 um für immunhistochemische Analyse einzubetten.
- Führen IHC mit einem Antikörper, der das MUC1 Tandem Repeat-Region von MUC1 erkennt. Über die Animal Research Kit Peroxidase, um die Reaktivität der sekundären Maus-Antikörper mit endogenen Immunglobulin im Gewebe zu minimieren.
- Führen H & E-Färbung unter Verwendung von Standard-Protokollen.
7. Statistische Methoden
Für die Multiplex Fluorometric Microbead Immunoassay, verwenden Sie einen zweiseitigen Student-t-Test zum Vergleich der durchschnittlichen Serum beobachtet Cytokinkonzentrationen zwischen der Behandlungs-und Kontrollgruppen. Für ELISpot, benutzen Sie eine Ein-way ANOVA, um die Stelle bilden Kolonien zwischen der media control vergleichen, Rührei Peptid-und Peptid-Gruppen. Verwenden Dunnett Multiple Comparison Test, um die Wahrscheinlichkeit eines falsch positiven Ergebnis zu verringern. Ein p-Wert ≤ 0,05 gilt als signifikant für alle Analysen.
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Representative Results
Die präklinische Beurteilung der Auswirkungen von neuen Immuntherapien und Kombinationen in Blasenkrebs erfordert die Entwicklung eines geeigneten Tiermodell. In unserer transgenen Mausmodell führte Induktion mit dem chemischen Karzinogen OH-BBN in einer hohen Rate von Blasenkrebs Inzidenz von überwiegend TCC mit einigen SCC, die ähnlich wie Blasenkrebs beim Menschen ist. Um Tumorhistologie, MUC1 Expression Status und die Immunantwort gegen das Peptid-Impfstoff Behandlung zu bestimmen, wurden 21 MUC1.Tg und 18 Wildtyp-Mäusen für die Gewinnung von Blut, Blasen und Milz (Abbildung 1) von acht Wochen nach OH-BBN Induktion eingeschläfert (Woche 28). Der Blasenkrebs Inzidenzrate für sowohl MUC1.Tg (14/21) und Wildtyp (12/18)-Mäusen war 67%. Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung bestätigt die Anwesenheit sowohl TCC und SCC, mit TCC überwiegen im Verhältnis 2:1. Unter diesen beobachteten wir eine Reihe von Low-und High-grade-invasive, hochwertige invasive Tumoren.Alle MUC1.Tg Blasenkrebs Proben waren positiv für MUC1-Expression durch IHC (Abbildung 2). Es sollte angemerkt werden, dass der Antikörper für MUC1 IHC eingesetzt normalen und kanzerösen menschlichen MUC1 erkennt werden.
Während Modellentwicklung wurden die Serumspiegel von inflammatorischen Zytokinen seriell zwischen 8-28 Wochen überwacht. Wir beobachteten, dass inflammatorische Zytokin Ebenen mit der Zeit der Induktion durch das Ende der Studie (3) erhöht. Dieses Zytokin-Muster ist sehr ähnlich zu dem, was wir bisher beobachtet in unserem Lungenkrebs Modell 33, die stark darauf hin, dass die Erhöhung inflammatorische Zytokin-Spiegel können mit Tumorentwicklung korrelieren.
Um die Th1 Zytokin Serum Antwort auf die Peptid-Impfstoff zu beurteilen, geimpft 15 und 14 mit Placebo behandelten MUC1.Tg Mäuse euthanasiert und Blut wurde am Ende der Studie in Woche 28 gesammelt, 24 h nach der letzten Behandlung Impfstoff. Multiplex-Analyse (Figure 4) zeigt erhöhte Serum Th1 Zytokin TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-12 (p70) und IL-17 in der Impfstoff-Gruppe verglichen mit der Placebo-Gruppe. Levels von TNF-α, IFN-γ waren, und IL-17 signifikant höher (p <0,05) in der Impfstoff-behandelten Mäusen. Diese Ergebnisse deuten auf eine Th1 Zytokin polarisierte Reaktion auf das Peptid-Impfstoff.
Um die Th1/Th2 Immunantwort auf das Peptid-Impfstoff zu bewerten, wurden Splenozyten von IFN-γ/IL-4 ELISpot beurteilt. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Behandlung wurden Milz gesammelt und verarbeitet, um Lymphozyten für ELISpot Analyse zu isolieren. Lymphozyten wurden gezählt und bewertet für die Lebensfähigkeit von Muse Analyzer (Abbildung 5). ELISpot Platten wurden mit 1 × 10 6 lebensfähigen Zellen pro Vertiefung ausgesät und 48 Stunden später entwickelt. Repräsentative Ergebnisse (Abbildung 6) zeigen eine klare und spezifische IFN-γ Antwort auf das Peptid, das eine Th1-Immunantwort gegen das Peptid bestätigtImpfstoff.
Abbildung 1. Maus Necropsy. Necropsy wurde bei 28 Wochen, 8 Wochen nach dem Ende der OH-BBN Induktion durchgeführt. Leber-, Blasen-Tumor und Milz angegeben. Asterisk (*) markiert Einstichstelle für die Blutentnahme. In diesem Beispiel wurde ein hochwertiges, invasive SCC beobachtet. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 2. Repräsentative Blase Gewebeschnitte mit H & E (links) und menschlichen MUC1 IHC (rechts) von norma gefärbt l Blase, invasive Plattenepithelkarzinome und invasiven Urothelkarzinom. (A) Normale Harnblase mit Schleimhaut ausgekleidet durch Übergangsepithel, was zeigt diffuse MUC1 Reaktivität. (B) Nester von invasiven SCC (Pfeil) in Submukosa. Organisiert Keratinschichten (Sternchen) Linie der Blasenschleimhaut. Diffuse MUC1 Reaktivität in Nestern von SCC gesehen. (C) mucosae enthält TCC Projektion in das Lumen (links, rechts). Urothelkarzinom ist anaplastischen mit Invasion in Submucosa und Muskel (Pfeil und Einschub). Schleimhaut und TCC hineinragenden Lumen Show diffundieren MUC1 Reaktivität (rechts, rechts), während invasive TCC hat weniger prominent Reaktivität (rechts, links). Bar = 200 um (Hauptfeld) und 50 um (Einschub). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Abbildung 3. Entzündliche Serum Zytokine in verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung. Serielle Serumproben wurden von submandibular blutet an der Grundlinie (8 Wochen), dann alle 4 Wochen danach bis Ende der Studie gesammelt. Blut wurde (n = 4) vereinigt, und das Serum wurde isoliert und auf die Anwesenheit von 20 Zytokinen. Konzentrationen stellen den Mittelwert von Mischproben und Balken stellen das Sortiment ab. Die Pfeile zeigen die Stelle, an der OH-BBN Dosierung abgeschlossen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 4.Th1 Serumzytokine folgenden Peptid-Impfstoff Behandlung. Serumproben wurden am Ende der Studie gesammelt, 24 h nach der letzten Dosis des Impfstoffs (n = 15) oder Placebo (n = 14) und auf die Anwesenheit von 20 Zytokinen. Die Daten werden dargestellt als Mittelwert Cytokinkonzentrationen und Bars positive Standardabweichung darstellen. * P <0,05 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 5. Repräsentative Maus Splenozyten Histogramms. Maus-Splenozyten wurden am Ende der Studie isoliert und hinsichtlich Anzahl und die Lebensfähigkeit unter Verwendung einer Muse Analyzer. Linker Bereich, Zelle auf Zelle viablility Größe. Rechts-Panel, die Lebensfähigkeit der Zellen auf kernhaltigen Zellen (lebende Zellen basiert in grünen Bereich, abgestorbene Zellen in der weißen Zone). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
Abbildung 6. Splenozyten LISpot Analyse am Ende der Studie. (A) Repräsentative Brunnen zeigt IFN-γ (rote Flecken) und IL-4 (blaue Flecken) Produktion als Reaktion auf Medienberichte, Rührei Peptid und Peptid. Eine klare IFN-γ, Antigen-spezifische Antwort wurde mit Peptid Exposition beobachtet. (B) Graphische Darstellung der IFN-γ typische ELISpot Daten zeigen den Mittelwert (± Standardabweichung) vor Ort bilden Kolonien in Reaktion auf Medienberichte, Rührei Peptid und Peptid._blank "> Klicken Sie hier, um ein größeres Bild zu sehen.
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Discussion
Die erfolgreiche Induktion von Übergangs-und invasive Plattenepithelkarzinome Blasenkarzinom in menschlichen MUC1.Tg Mäuse bietet eine Immuntherapie präklinischen Modell für Entwicklung. Immunotherapeutic Untersuchungen erfordern die Verwendung eines spontanen, Immunsystem intakt Modell, um die entzündliche Reaktion auf Tumorprogression im Laufe der Zeit als auch der Immunantwort auf eine Immuntherapie zu bewerten. In einer spontanen Tumorentwicklung Modell bleibt der Tumor-Mikroumgebung intakt und die Tumore entwickeln in einem weiteren Vertreter Wachstumsrate, die für die Beurteilung der Antitumor-Wirkung der Behandlung ermöglicht. Darüber hinaus kann das Immunsystem gemessen und durch Biomarker überwacht werden, so dass für die Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung.
Andere tumortragenden Maus-Modellen in der Literatur für die Prüfung Immuntherapie beschrieben umfassen sowohl Xenotransplantatmodellen und Transplantation Modelle. Obwohl diese Modelle sind praktisch und wurden ausführlich in der Krebsforschung eingesetzt,gibt es eine Reihe von wichtigen Einschränkungen zu berücksichtigen, wenn die Durchführung immunotherapeutic Studien. Weder Xenotransplantaten oder transplantierten Tumoren entwickeln spontan, und sie vermehren sich in einer Mikroumgebung, die nicht repräsentativ für das Gewebe, aus denen die Tumore ursprünglich abgeleitet wurden. Darüber hinaus wachsen und transplantierten Tumoren Xenotransplantate schneller als spontanen Tumoren, so dass weniger Zeit, um das Immun-Effekte der Therapie zu untersuchen. Am wichtigsten ist, benötigen diese Modelle Gastgeber mit geschwächtem Immunsystem.
Zusätzlich zu unserem Modell gibt es eine Reihe von anderen chemisch induzierte Blasenkrebs Modelle. Zum Beispiel N-[4 - (5-Nitro-2-furyl)-2-thiazolyl] formamid (FANFT) und N-Methyl-N-nitrosoharnstoff (MNU) haben auch gezeigt, Blasenkrebs bei Ratten und Mäusen zu induzieren . Allerdings sind diese Chemikalien geringfügig in Bezug auf die Histologie des Tumors sie induzieren. FANFT primär induziert urothelial cell carcinoma (UCC) mit einigen SCC, während MNU induziert Papillarkarzinom, die schließlich zu Muskel-invasive Tumoren mit einer geringen Inzidenz von Metastasen 34. OH-BBN wird häufig für Blasenkrebs Induktion in Tiermodellen verwendet, weil die TCC die Entwicklung ähneln hochgradigen menschlichen TCC 34. Blasenkrebs ist auch bei Hunden, Kaninchen und Ratten als auch in Mäusen mit OH-BBN induziert wurde. Obwohl Eckzähne ähnlichen Stoffwechselprozessen teilen mit den Menschen in Bezug auf Bioaktivierung der Karzinogene 35, ist die Latenzzeit für Blasenkrebs Entwicklung in Beagles 37 Wochen 36, und Experimente mit Hunden haben sowohl finanzielle und ethische Erwägungen. Kaninchen haben sogar länger Latenzzeiten, und wenn der Dosierung Zeitraum aufgenommen, ein Minimum von 21 Monaten ist für die TCC und SCC Entwicklung 37 erforderlich. Ähnlich wie bei Mäusen, Ratten entwickeln Modelle Tumoren, die histologisch ähnlich wie beim Menschen sind, mit kurzen Perioden Dosierung von 8 Wochen und Latenzzeiten 5 Wochen 38
Zuvor haben wir zwei intakte menschliche Immunsystem MUC1-spontanen Tumor Modelle sowohl für Lungen-und Brustkrebs 33 39. Um Immuntherapien in Blasenkrebs auszuwerten, entwickelten wir ein OH-BBN-induzierte, spontane Mausmodell Blasenkarzinom. Ähnlich wie bei den zuvor beschriebenen Modelle 33,39 drücken die Tumoren, die in diesem Modell zu entwickeln das Tumor-assoziierte Antigen MUC1 als selbst-Molekül, das das Ziel der Peptid-Impfstoff ist. Dieses Modell zeigte eine 67% Inzidenz von Tumoren der Blase, die alle positiv für die Expression von humanem MUC1 waren. Die histologische Beurteilung ergab, dass TCC überwogen, was konsistent ist mit dem, was in der menschlichen Blasenkrebs beobachtet. Dieses Modell ist ideal für das Studium AutoKarzinogenese, Präventionsstrategien und die Behandlung von lokalisierten und fortgeschrittenem Blasenkrebs beim Menschen. In Zukunft planen wir weitere Studien der Immuntherapie in Kombination mit Chemotherapeutika und Strahlentherapie in der beschriebenen Blasenkrebs Modell verfolgen.
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Disclosures
DPV, GTW, SMG, CJK, AMG, und GKH deklarieren keine Interessenkonflikte. MWD ist der Principal Investigator eines Zuschusses von Merck KGaA, und MW ist ein Mitarbeiter der Merck KGaA.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die UC Davis Mausbiologie Programm für die Zucht der Mäuse danken. Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss von Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
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