Summary
Una N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina inducida modelo de cáncer de vejiga fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) ratones transgénicos para el propósito de las pruebas de MUC1-inmunoterapia dirigida. Después de la administración de una vacuna de péptido MUC1-específica, una respuesta de linfocitos T citotóxicos para MUC1 se confirmó mediante la medición de los niveles séricos de citocinas y la actividad de células T específicas.
Abstract
Un modelo preclínico de cáncer de vejiga invasivo fue desarrollado en mucina humana 1 (MUC1) transgénicos (MUC1.Tg) ratones para el propósito de la evaluación de la inmunoterapia y / o quimioterapia citotóxica. Para inducir el cáncer de vejiga, C57BL / 6 ratones (tipo MUC1.Tg y silvestres) fueron tratados por vía oral con el carcinógeno N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) a 3,0 mg / día, 5 días / semana durante 12 semanas. Para evaluar los efectos de OH-BBN en el perfil de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor, sangre total se recogió a través de hemorragias submandibulares antes del tratamiento y cada cuatro semanas. Además, una vacuna de péptido MUC1-específica y el placebo se administraron a grupos de ratones a la semana durante ocho semanas. Se realizaron Multiplex fluorométricos inmunoanálisis microperlas de citoquinas en suero durante el desarrollo del tumor y después de la vacunación. A la terminación, el interferón gamma (IFN-γ) / interleucina-4 (IL-4) análisis de ELISPOT para MUC1 respuesta inmune de células T específica y evaluaciones histopatológicas de tipo de tumory se realizaron grado. Los resultados mostraron que: (1) la incidencia de cáncer de vejiga en ratones de tipo salvaje tanto MUC1.Tg y fue de 67%; (2) carcinomas de células transicionales (TCC) desarrollados en la relación 2:1 en comparación con carcinomas de células escamosas (SCC) ; (3) las citoquinas inflamatorias se incrementaron con el tiempo durante el desarrollo del tumor, y (4) la administración de la vacuna de péptido induce un perfil de citoquinas Th1-polarizado suero y una respuesta de células T específica MUC1. Todos los tumores en ratones MUC1.Tg fueron positivos para la expresión de MUC1, y la mitad de todos los tumores en ratones de tipo salvaje y MUC1.Tg eran invasiva. En conclusión, el uso de un enfoque de equipo a través de la coordinación de los esfuerzos de los farmacólogos, inmunólogos, anatomopatólogos y biólogos moleculares, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico intacto inmunológico del cáncer de vejiga que expresa hMUC1.
Introduction
El cáncer de vejiga es el cuarto tipo de cáncer más común y la octava causa de muerte por cáncer en los hombres estadounidenses. En los Estados Unidos, se espera que unos 72.500 nuevos casos y 15.000 muertes por cáncer de vejiga entre los hombres y mujeres en conjunto en 2013 1. La incidencia de cáncer de vejiga es aproximadamente tres veces mayor en los hombres que en las mujeres. En los Estados Unidos, carcinomas de células transicionales (TCC) representan más del 90% de los casos, mientras que los carcinomas de células escamosas (SCC) tienen una incidencia de menos de 2% 2. La tasa de supervivencia a 5 años relativa global para papilar TCC es 91,5% frente a sólo el 30,9% de SCC 2. Aunque los TCC papilares no invasivos representan aproximadamente el 75% de los casos en el momento del diagnóstico, incluso con el tratamiento de más de 50% de los pacientes experimentará una recurrencia dentro de 5 años, con un máximo de 30% de estos pacientes progresa a la enfermedad invasiva del músculo 3,4 . Pautas de tratamiento habituales para inv no músculoenfermedad ASIVE incluye la resección transuretral (TUR) seguida de quimioterapia intravesical. En pacientes con Ta de alto grado o tumores T1, una repetición TUR se puede realizar antes de la quimioterapia 3,4. Para aquellos pacientes con recurrencias Ta de bajo grado o Ta de alto grado o lesiones T1, RTU seguida de quimioterapia o inmunoterapia adyuvante en la forma de bacilo de Calmette-Guerin (BCG) se puede usar 3,4. Intravesical de BCG se ha demostrado ser superior a la mitomicina C intravesical con respecto al tiempo hasta la recurrencia 5. Para la enfermedad invasiva del músculo T2, la cistectomía radical con o sin quimioterapia neoadyuvante es el tratamiento recomendado 3. En los pacientes con SCC, la cistectomía radical parece ser el tratamiento más efectivo 6. Dadas las altas tasas de recurrencia a pesar de los tratamientos disponibles, existe una clara necesidad de nuevas terapias más eficaces para el cáncer de vejiga.
Ampliar nuevas inmunoterapias para Bladdcáncer er es un posible enfoque que puede mantener la promesa para prolongar la supervivencia libre de enfermedad. Históricamente, BCG ha sido la única inmunoterapia eficaz para el cáncer de vejiga. Se cree que su mecanismo de acción para involucrar a la inducción no específica de una respuesta inmunitaria de tipo T helper 1 (Th1) a través de aumento de los niveles de interleucina-2 (IL-2) y el interferón gamma (IFN-γ) 4. Celular, o la inmunidad Th1, es crítico en la inmunoterapia del cáncer como humoral, o Th2, inmunidad nunca se ha demostrado ser eficaz contra los tumores sólidos, con la excepción de anticuerpos dirigidos contra los receptores del factor de crecimiento 7. En un intento de mejorar los beneficios de BCG monoterapia, IFN-α combinación 2B/BCG inmunoterapia se evaluó en un ensayo clínico de fase II con resultados no concluyentes 8. Una aproximación alternativa a la inmunoterapia para el cáncer de vejiga puede ser para dirigir antígenos asociados a tumores (TAA), la identificación de lo que ha hecho la inmunoterapia del cáncer más específica 7
Uno de estos TAA es mucina 1 (MUC1), que es una glicoproteína de superficie celular sobreexpresados en muchos cánceres de células epiteliales, tales como la vejiga, de mama, de pulmón, y cáncer de páncreas 9,10. La expresión y la modificación de MUC1 también se altera sustancialmente durante la carcinogénesis, de tal manera que underglycosylation expone secuencias antigénicas de aminoácidos conocidos como número variable de repeticiones en tándem (VNTR) en el núcleo peptídico. Mientras MUC1 es una auto-molécula, estas regiones VNTR inmunodominantes no están normalmente expuestos debido a la amplia glicosilación, y por lo tanto son vistos por el sistema inmune como 11,12 extranjera. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen específicamente epítopos de MUC1 se han aislado de los ganglios linfáticos que drenan el tumor de los pacientes de cáncer de mama 13, así como la sangre y la médula ósea de pacientes con mieloma 14,15, haciendo MUC1 un blanco potencial para un respuesta inmune celular. Los VNTR inmunodominantes de la underglycosylated forma de MUC1 son reconocidos por CTL, lo que resulta en la destrucción de las células tumorales 16-19. La respuesta inmune celular y / o humoral nativos a MUC1 cancerosos son, sin embargo, no lo suficientemente fuerte como para eliminar los tumores. Para aumentar la respuesta inmune débil ya existente para MUC1, péptidos inmunodominantes sintéticos se pueden introducir a través de la vacunación para generar una respuesta de CTL lo suficientemente fuerte para ser de beneficio clínico 18,20. Una vacuna liposomal MUC1 ya se ha demostrado que aumenta la supervivencia en pacientes con cáncer de pulmón 21,22, generar CTL capaces de matar las células tumorales positivas para MUC1, y producir una respuesta de citoquinas Th1-polarizado 23,24. Con un alto nivel de expresión de MUC1 9,11,25, cáncer de vejiga es un candidato lógico para probar MUC1-inmunoterapia dirigida 26,27. Además, MUC1 tiene potencial como factor pronóstico en el cáncer de vejiga 28, MUC1 expresión en TCC se asoció significativamente con el estadio y grado, y metastásicos TCCse ha demostrado que continuar expresando MUC1 29.
Con el fin de evaluar la utilidad potencial de la inmunoterapia MUC1-dirigida en el cáncer de vejiga, hemos desarrollado un MUC1 humano intacto inmune (hMUC1)-expresando transgénico (MUC1.Tg) modelo de ratón de congenic cáncer de vejiga en los C57BL / 6 de fondo 30. MUC1 humana se expresa como un auto-proteínas bajo el control de su propio promotor, que resulta en un patrón de expresión de tejido consistente con la observada en los seres humanos 30,31. Los ratones se indujeron con el conocido carcinógeno vejiga N-butil-N-(4-hidroxibutil) nitrosamina (OH-BBN) 32, y a continuación, se evaluaron los tumores resultantes para hMUC1 expresión y el tipo y grado del tumor. Para evaluar el efecto de la sustancia cancerígena en los niveles de citoquinas Th1/Th2 durante el desarrollo de tumores, se recogieron muestras de suero periódicamente para el análisis múltiplex. Los ratones fueron tratados con una vacuna de péptido MUC1-específica, y la citoquina en suero y respuestas inmunes eran evaluaciónted por múltiplex inmunoensayo fluorimétrico microbead y ELISpot.
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Protocol
Todos los estudios con animales y los experimentos se llevaron a cabo bajo un protocolo aprobado por la Universidad de California, Davis Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comité Consultivo administrativa.
1. MUC1.Tg ratón obtención y la reproducción
- El Programa de Biología del Ratón Davis UC (MBP) razas de tipo salvaje C57BL / 6 ratones machos con heterocigotos MUC1.Tg C57BL / 6 ratones hembra para establecer nuestra colonia. MUC1.Tg crías se entregan los estudios según sea necesario.
- Personal de MBP clip de los dedos de la descendencia en un patrón definido (0-99) para la identificación del ratón y, cuando proceda, el clip de la cola. El dedo o el tejido de la cola se procesan para el genotipado mediante la extracción de ADN estándar y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), análisis.
2. Diseño del estudio
- Estudio actividades en grupo
- Pesar cada ratón por separado en una balanza y se registra el peso en gramos para cada ratón.
- Esta parte del procedimiento de invOlves la metodología y el diseño del estudio. Para la primera parte del estudio, asignar emparejados por edad ratones de tipo salvaje y MUC1.Tg para iniciar la inducción de cáncer de vejiga con OH-BBN. La eutanasia a los ratones 8 semanas después de la última dosis OH-BBN para confirmar la presencia de tumores en la vejiga por la histología.
- Para la segunda parte del estudio, los ratones aleatoriamente MUC1.Tg macho en el número apropiado de grupos de tratamiento y control. Estos ratones serán monitorizados para citoquinas en suero y respuestas inmunes de células T durante la inducción y el desarrollo del tumor, y luego a la terminación del estudio de 8 semanas después de la última dosis OH-BBN.
- Inducción de cáncer de vejiga
- OH-BBN es un agente cancerígeno y altamente tóxico. Por favor, lea y siga las instrucciones de la ficha de datos de seguridad de materiales para la manipulación y almacenamiento de este producto químico.
- Calcular la concentración de la solución de dosificación necesaria para administrar la dosis apropiada (3 mg), en un volumen de 100 l, a cada ratón en base a los pesos medios y Number de los ratones en cada estudio y de grupo.
- Diluir el OH-BBN en etanol 100%. Llevar la concentración final de 30 mg / ml con agua estéril. El final de etanol: concentración de agua debe ser 20:80, v / v
- Administrar el OH-BBN por vía oral usando el acero inoxidable, 20 G agujas por sonda diariamente, 5 días / semana durante 12 semanas, con base en el grupo de asignación de tratamiento a partir de la edad de 8 semanas.
- Tratamientos de vacunación
- Reconstituir cada vial de vacuna de péptido liofilizado en 600 l de 0,9% de solución salina estéril y resuspender a fondo por el dibujo de la solución a través de un 0,5 pulgadas aguja G 27 6x. Uso de solución salina, ajustar la concentración de manera que la dosis deseada se administra en un volumen de 100 l.
- Comenzando en la semana 20, después de la última dosis de OH-BBN, administrar la vacuna en una base semanal de un ciclo de ocho semanas mediante inyección subcutánea de 100 l usando una aguja de calibre 25 (número de semanas se corresponde con la edad de los ratones).
- Monitoreo y Toma de Muestras
- Pesar todos los ratones y palpar la presencia de nuevos tumores una vez cada semana. La eutanasia a los ratones que han perdido ≥ 20% del peso corporal o si hay tumores palpables, sangre en la orina, y / o retención urinaria.
- Antes de la primera dosis OH-BBN y luego a intervalos de 4 semanas a partir de entonces, recoger la sangre entera a través de las hemorragias submandibulares. Recoger la sangre en tubos de coagulación de suero Microtainer (BD), y 30 min para permitir que la sangre se coagule.
- Centrifugar las muestras de sangre en una microcentrífuga a 3500 xg durante 10 min. Transferir cuidadosamente el suero para atornillar criotubos tapa utilizando una pipeta.
- Flash congelación en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta su posterior análisis multiplex.
- Ocho semanas después de la última dosis de OH-BBN, la eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2.
- Coloque cada ratón en una tabla de disección y precisar por las cuatro extremidades.
- El uso de pinzas y tijeras, make una incisión horizontal en la región abdominal superior. Insertar las tijeras en la incisión entre la capa de la epidermis y de la pared abdominal y separar suavemente la piel del tejido subyacente con la ayuda de fórceps.
- Hacer una incisión vertical desde la incisión horizontal siguiendo el eje central hacia el extremo anterior del ratón. Separar la piel de la caja torácica, y el uso de una jeringa de 1 ml y una aguja de 22 G, perforar el corazón y recoger la sangre con un empate suave y constante.
- Consulte el paso 2.4.3 y 2.4.4 para el aislamiento y almacenamiento de suero.
- El uso de pinzas y tijeras, cortar y pelar el resto de la capa epidérmica. Corte a través de la pared abdominal y peritoneo y asépticamente extraer el tumor de vejiga de inmunohistoquímica (IHC) y Western blot.
- Recoger el bazo para el análisis de la viabilidad celular (Musa) y ELISPOT. Para IHC, lugar vesical tumoral en casete de tejido y fijar en formalina durante la noche refrigerada a temperatura ambiente. El día siguiente, reemplazar la formalina con etanol al 70%.
- Para el análisis de transferencia de Western de tumor, homogeneizar el tumor, añadir tampón de extracción de proteínas más inhibidores de la proteasa detener y transferir a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Vortex durante 30-60 segundos y mantener en hielo durante 5 min. Flash congela en nitrógeno líquido y descongelación en agua a temperatura ambiente. Repita el proceso de agitación, la congelación y descongelación dos veces.
- Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C y transferir los extractos celulares a nuevos tubos etiquetados.
- Cuantificar la concentración mediante la realización de un ensayo de proteína del ácido bicinconínico (BCA) para mediciones de la proteína. Almacene las muestras a -80 ° C hasta el momento de Western blot.
3. Biología Molecular / Western
Los siguientes procedimientos se llevaron a cabo para verificar la expresión de MUC1 en la vejiga del ratón tejido tumoral utilizando el protocolo de transferencia Western estándar (datos no muestrann).
- Separar los extractos de proteínas por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) y luego se transfieren a una membrana de PVDF utilizando un aparato semiseco.
- Bloquear la membrana de la proteína transferida con 5% de leche sin grasa en 0,1% de Tween-20 en tampón fosfato salino (PBS-T) de pH 7,4 durante 1 hora en un agitador orbital a temperatura ambiente.
- Se incuba la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador con anticuerpo anti-MUC1 o anti-β-actina en 0,1% de PBS-T.
- Lavar la membrana por decantación la solución y la adición de 0,1% de PBS-T. Remolino de la membrana en el agitador durante 5 minutos y se decanta. Repita este paso dos veces.
- Se incuba la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con una peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugada con anticuerpo secundario.
- Lave 3 veces (consulte el paso 3.4).
- Siga el protocolo para el kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL) para activar y leer el fluorografía.
4. Multiplex Fluorometric Inmunoensayo microcuentas
<ol>- Usar un mapa placa de 96 pocillos, ceder espacios en blanco, estándares, controles y muestras problema a los pocillos. Calcular el número y el volumen de analitos, la captura de anticuerpos y estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE) necesario para el ensayo.
- Permitir que todos los tampones y diluyentes alcancen la temperatura ambiente. Preparar los estándares y las diluciones de muestra usando una placa de 96 pocillos en blanco.
- Reconstituir la matriz de suero y estándar liofilizada de acuerdo con el protocolo del fabricante y hacer diluciones seriadas 1:05 de la norma con el diluyente apropiado en la placa de 96 pocillos. Para los pocillos de blanco, utilizar el diluyente apropiado.
- Diluir todos los controles y muestras desconocidas 1:02 en el diluyente apropiado en el resto de la placa de 96 pocillos.
- Para la mezcla de microesferas, pipetear el volumen requerido de diluyente apropiado en un tubo de 15 ml. Vortex cada vial de microesferas durante 20 seg y la pipeta el volumen requerido de cada analito en el tubo de 15 ml. Proteja siempre las cuentas de la luz para evitar photobleaching. No coloque la placa de 96 pocillos con material absorbente para evitar la pérdida de la muestra por capilaridad.
- Prehumedecido la placa de 96 pocillos de fondo filtro con 200 l de tampón de ensayo y permitir la impregnación completa del filtro. Drenar suavemente utilizando el aparato de vacío placa de 96 pocillos y secar la parte inferior de la placa con una toalla de papel.
- Con una pipeta multicanal, pipetas 25 l de matriz de suero en los pocillos asignados a los blancos y patrones y pipeta de 25 l de tampón de ensayo a los pocillos asignados a los controles y las incógnitas.
- Pipetear 25 l de la pieza en bruto, las normas, controles y desconocidos a los respectivos pozos asignados. Agite la mezcla de microesferas durante 20 segundos y transferir las cuentas a un depósito.
- Pipetear 25 l de la mezcla de microesferas en cada pocillo. Cubrir la placa con papel de aluminio o una placa de tapa opaca para protegerlo de la luz.
- Prepare la solución de anticuerpo de captura. Pipetear la cantidad requerida de 0,1% de PBS-T y anticuerpo de captura en un tubo de 15 ml y agitar durante 10 seg. Transferir la mezcla de anticuerpo de captura a un depósito y la pipeta 25 l en cada pocillo.
- Agitar la placa a 500 rpm durante una hora a temperatura ambiente en un agitador de placas. Escurrir y lavar la placa con 200 l de 0,1% PBS-T dos veces. Escurrir y secar.
- Prepare la solución de SA-PE. Pipetear el volumen requerido de 0,1% de PBS-T y SA-PE en un tubo de 15 ml y agitar durante 10 seg. Transferir la solución a un depósito y la pipeta 25 l en cada pocillo.
- Agitar la placa a 500 rpm durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de placas. Escurrir y lavar la placa con 200 l de 0,1% PBS-T dos veces. Escurrir y bmuchos seco.
- Pipetear 100 l de 0,1% de PBS-T y agitar en un agitador de placas a 500 rpm durante al menos dos minutos para resuspender las perlas. Leer y analizar la placa en la máquina LX200 Luminex.
5. IFN-γ/IL-4 ELISpot Preparación y Análisis
- En una cabina de seguridad biológica, procesar los bazos a través de tejido de nylon 100 micras tamices en 5 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en placas de Petri estériles. Capa de los esplenocitos en 3 ml de medio de separación de linfocitos en tubos estériles de 15 ml.
- Centrifugar los tubos a 600 xg durante 15 minutos para separar los linfocitos de las células rojas de la sangre. La transferencia de los linfocitos en capas por encima de la pendiente de nuevos tubos estériles de 15 ml.
- Ajuste el volumen a 10 ml con PBS estéril. Centrifugar la suspensión a 600 xg durante 10 min para sedimentar las células.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 ml de PBS para la viabilidad celular y contar con la Musaanalizador. Siga el conde Muse y protocolo Kit Viabilidad.
- Hacer diluciones seriadas de los linfocitos en 1,5 ml de tubos con cierre de tornillo centrifugar a factores de dilución de 1:10, 1:20 y 1:40 (o si necesario) de Count & Reactivo Viabilidad (mínimo volumen total 300 l). Pipetear cada dilución arriba y abajo varias veces para mezclar y analizar en el Muse.
- Elaborar un mapa de la placa de las muestras y las condiciones para la placa ELISpot. Preparar la placa de ELISPOT de acuerdo con el protocolo del fabricante y pipeta de 100 l de medio, el péptido (10 g / ml), o péptido (10 g / ml) a cada pocillo lucha.
- Pipetear 100 l de suspensión celular, la entrega de 1,0 x 10 6 células a cada pocillo e incubar la placa a 37 ° C durante la noche.
- Seguir el protocolo del fabricante para el ensayo ELISPOT. Analizar la placa ELISpot desarrollada usando un microscopio de disección.
- Cuantificar los resultados mediante el recuento del número de manchas de color corresponding a cada analito en cada pocillo. Los puntos corresponden al número de células formadoras de punto (SFC) en cada pocillo.
6. La inmunohistoquímica (IHC) y hematoxilina y eosina (H & E) tinción
- Tome el tejido tumoral de vejiga conservada como se describió anteriormente (sección 2.4.11), insertar en parafina y la sección paso a los 4 m para el análisis inmunohistoquímico.
- Realizar IHC usando un anticuerpo MUC1 que reconoce la región de repetición en tándem de MUC1. Utilice el kit de peroxidasa de Investigación de Animales para minimizar la reactividad del anticuerpo secundario del ratón con inmunoglobulina endógena presente en el tejido.
- Realizar H & E tinción utilizando protocolos estándar.
7. Métodos Estadísticos
Para el Multiplex Fluorometric Inmunoensayo microcuentas, utilice la prueba t de Student de dos colas para comparar el promedio observado concentraciones de citoquinas en suero entre los grupos de tratamiento y control. Para ELISpot, utilice una sola way ANOVA para comparar el punto de formación de colonias entre el control de los medios de comunicación, revueltos péptido y grupos de péptidos. Utilice prueba de comparación múltiple de Dunnett para disminuir la probabilidad de un resultado positivo falso. Un valor de p ≤ 0,05 se consideraron significativamente diferentes para todos los análisis.
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Representative Results
La evaluación preclínica de los efectos de las nuevas inmunoterapias y combinaciones en el cáncer de vejiga requiere el desarrollo de un modelo animal adecuado. En nuestro modelo de ratón transgénico, la inducción con el carcinógeno químico OH-BBN dio lugar a una alta tasa de incidencia del cáncer de vejiga predominantemente de TCC con un poco de SCC, que es similar al cáncer de vejiga en humanos. Para determinar la histología del tumor, el estado MUC1 expresión y la respuesta inmune a la vacuna de péptido de tratamiento, 21 y 18 MUC1.Tg ratones de tipo silvestre fueron sacrificados para la recogida de sangre, vejigas, y bazos (Figura 1) Ocho semanas siguientes OH-BBN inducción (Semana 28). La tasa de incidencia del cáncer de vejiga, tanto para MUC1.Tg (14/21) y de tipo salvaje (12/18) los ratones fue de 67%. Hematoxilina y eosina (H & E) tinción confirmaron la presencia de ambos CTP y SCC, con TCC que predominan en la relación 2:1. Entre ellas, se observó un rango de bajo y de alto grado no invasivo de tumores invasivos de alto grado.Todos los especímenes de cáncer de vejiga MUC1.Tg fueron positivos para la expresión de MUC1 por IHC (Figura 2). Cabe señalar que el anticuerpo utilizado para MUC1 IHC reconoce MUC1 humana tanto normal como canceroso.
Durante el desarrollo del modelo, los niveles séricos de citocinas inflamatorias se monitorizaron en serie entre las semanas 8-28. Hemos observado que los niveles de citoquinas inflamatorias se incrementaron con el tiempo de inducción a través del final del estudio (Figura 3). Este patrón de citoquinas es muy similar a lo que se observó previamente en nuestro modelo de cáncer de pulmón 33, lo que sugiere fuertemente que el aumento de los niveles de citoquinas inflamatorias se puede correlacionar con el desarrollo del tumor.
Para evaluar la respuesta de citoquinas Th1 a suero de la vacuna de péptido, 15 vacunados y 14 MUC1.Tg ratones tratados con placebo fueron sacrificados y la sangre se recogió al final del estudio en la semana 28, 24 horas después del último tratamiento con la vacuna. Análisis Multiplex (Figure 4) muestra un aumento de los niveles séricos de citocinas Th1 de TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-12 (p70), e IL-17 en el grupo de la vacuna en comparación con el grupo de placebo. Los niveles de TNF-α, IFN-γ, e IL-17 fueron significativamente mayores (p <0,05) en los ratones tratados con la vacuna. Estos resultados sugieren una respuesta Th1 de citoquinas polarizado a la vacuna de péptido.
Con el fin de evaluar la respuesta inmune Th1/Th2 a la vacuna de péptido, los esplenocitos fueron evaluados por IFN-γ/IL-4 ELISPOT. Veinticuatro horas después del último tratamiento, se recogieron los bazos y se procesaron para aislar los linfocitos para el análisis ELISPOT. Los linfocitos se contaron y se evaluó su viabilidad por Muse analizador (Figura 5). Placas ELISpot fueron sembradas con 10 6 células viables de 1 x por pocillo y se desarrollaron 48 horas más tarde. Los resultados representativos (Figura 6) muestran un IFN-γ respuesta clara y específica para el péptido, lo que confirma una respuesta inmune Th1 al péptidovacuna.
Figura 1. Ratón necropsia. Se realizó la necropsia a las 28 semanas, 8 semanas después del final de OH-BBN inducción. Hígado, tumor de vejiga y el bazo se indican. El asterisco (*) marca el punto de punción para la extracción de sangre. En este ejemplo, se observó un alto grado, SCC invasivo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Secciones de tejido de vejiga representativos teñidas con H & E (izquierda) y humanos MUC1 IHC (derecha) de la norma l de vejiga, carcinoma de células escamosas invasivo, y el carcinoma de células de transición invasivas. (A) normal de la vejiga urinaria con la mucosa revestidos por epitelio de transición, que muestra difusa MUC1 reactividad. (B) Los nidos de SCC invasivo (flecha) en la submucosa. Capas de queratina Organizado (asterisco) línea la mucosa vesical. Reactividad MUC1 difuso se ve en nidos de SCC. (C) La mucosa contiene TCC se proyecta hacia la luz (a la izquierda, a la derecha). Carcinoma de células transicionales es anaplásico con invasión submucosa y muscular (flecha y recuadro). Mucosa y TCC se proyecta hacia lumen espectáculo difundir MUC1 reactividad (a la derecha, a la derecha), mientras TCC invasiva tiene reactividad menos prominente (a la derecha, a la izquierda). Bar = 200 m (panel principal) y 50 micras (recuadro). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
3 "fo: content-width =" 6 pulgadas "fo: src =" / files/ftp_upload/50868/50868fig3highres.jpg "src =" files/ftp_upload/50868/50868fig3.jpg "width =" / 600px "/>
Figura 3. Citoquinas inflamatorias suero en diferentes etapas de desarrollo del tumor. Muestras de suero en serie se recogieron por hemorragias submandibulares al inicio del estudio (8 semanas), y luego cada 4 semanas a partir de entonces hasta la terminación del estudio. La sangre se agruparon (n = 4), y el suero se aisló y se analizó para determinar la presencia de citocinas 20. Las concentraciones representan la media de muestras y bares agrupados representan la gama. Las flechas indican el punto en el que OH-BBN dosificación concluyó. Haz clic aquí para ver la imagen más grande .
La Figura 4.Citoquinas Th1 suero después del tratamiento con vacuna de péptido. Las muestras de suero se recogieron a la terminación del estudio, 24 horas después de la última dosis de la vacuna (n = 15) o placebo (n = 14) y se analizaron para la presencia de 20 citoquinas. Los datos se muestran como media de las concentraciones de citoquinas y las barras representan la desviación estándar positivo. * P <0.05 Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 5. Representante del ratón histograma esplenocitos. Esplenocitos de ratón se aisló la terminación del estudio y se evaluaron para el recuento y la viabilidad mediante un analizador de Muse. El panel izquierdo, viablility celular basado en el tamaño celular. Panel de la derecha, la viabilidad celular basada en células nucleadas (células vivas en la zona verde, las células muertas en la zona blanca). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
La Figura 6. Análisis LISpot esplenocitos la terminación del estudio. (A) Representante pozos que muestra IFN-γ (manchas rojas) e IL-4 (manchas azules) de producción en respuesta a los medios de comunicación, revueltos péptido, y el péptido. Se observó un IFN-γ, clara respuesta antígeno-específica con la exposición al péptido. (B) Representación gráfica de IFN-γ típica ELISpot datos muestran la media (± desviación estándar) que forman colonias en respuesta a los medios de comunicación para comer, revueltos péptidos y péptidos._blank "> Haga clic para ampliar la imagen.
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Discussion
La inducción exitosa de carcinoma de células transicionales de vejiga y de células escamosas invasivo en ratones MUC1.Tg humanos ofrece un modelo preclínico para el desarrollo de la inmunoterapia. Estudios inmunoterapéuticas requieren el uso de un modelo intacta espontánea, inmunológico con el fin de evaluar la respuesta inflamatoria a la progresión del tumor con el tiempo, así como la respuesta inmune a la inmunoterapia. En un modelo desarrollo de tumores espontáneo, el microambiente tumoral se mantiene intacto y los tumores se desarrollan a una tasa de crecimiento más representativa que permita la evaluación de los efectos antitumorales del tratamiento. Por otra parte, el sistema inmune puede ser medidos y controlados mediante marcadores biológicos, lo que permite la evaluación de la eficacia del tratamiento.
Otros modelos de ratones portadores de tumores descritos en la literatura para las pruebas de inmunoterapia incluyen tanto los modelos de xenoinjertos y modelos de trasplante. Aunque estos modelos son convenientes y se han empleado ampliamente en la investigación del cáncer,hay una serie de limitaciones importantes a considerar al llevar a cabo estudios de inmunoterapia. Ni los xenoinjertos de tumores trasplantados ni desarrollan de forma espontánea, y que proliferan en un microambiente que no es representativo del tejido de la que se derivaron originalmente los tumores. Por otra parte, y xenoinjertos de tumores trasplantados crecen más rápidamente que los tumores espontáneos, lo que permite menos tiempo para estudiar los efectos inmunológicos de la terapia. Lo más importante, estos modelos requieren hosts con sistemas inmunes comprometidos.
Además de nuestro modelo, hay una serie de otros modelos de cáncer de vejiga inducidas químicamente. Por ejemplo, N-[4 - (5-nitro-2-furil)-2-tiazolil] formamida (FANFT) y N-metil-N-nitrosourea (MNU) también se han demostrado para inducir cáncer de vejiga en ratas y ratones . Sin embargo, estos productos químicos son un poco diferente con respecto a la histología de los tumores se inducen. FANFT induce principalmente carcinoma urotelial (UCC) con un poco de SCC, mientras que MNU induce el carcinoma papilar que finalmente da lugar a tumores músculo-invasivos con una baja incidencia de metástasis 34. OH-BBN se utiliza comúnmente para la inducción de cáncer de vejiga en modelos de roedores debido a que los países que aportan contingentes que se desarrollan parecen mucho a los TCC humanos de alto grado 34. Cáncer de vejiga urinaria también ha sido inducida en caninos, conejos y ratas, así como en ratones utilizando OH-BBN. Aunque caninos comparten procesos metabólicos similares a los seres humanos en relación con bioactivación de carcinógenos 35, el período de latencia para el desarrollo de cáncer de vejiga en perros beagle es 37 semanas 36 y experimentaciones con los perros tienen las consideraciones financieras y éticas. Los conejos tienen períodos de latencia aún más largos, y cuando se añade al tiempo de dosificación, se requiere un mínimo de 21 meses para la TCC y el desarrollo SCC 37. Similares a los ratones, los modelos de rata desarrollan tumores que son histológicamente similares a los humanos, con períodos cortos de dosificación de 8 semanas y los períodos de latencia de 5 semanas 38
Anteriormente hemos desarrollado dos MUC1-que expresan modelos de tumores humanos espontáneos inmune intacto, tanto para 33 pulmón y cáncer de mama 39. Con el fin de evaluar las inmunoterapias en cáncer de vejiga, hemos desarrollado un OH-BBN-inducida, modelo de ratón espontánea de carcinoma de vejiga. Al igual que en los modelos descritos anteriormente 33,39, los tumores que se desarrollan en este modelo expresan el antígeno MUC1 asociado al tumor como un auto-molécula, que es la diana de la vacuna de péptido. Este modelo mostró una incidencia del 67% de los tumores de vejiga, todos los cuales fueron positivos para la expresión de MUC1 humana. Evaluaciones histológicas mostraron que predominaban los TCC, lo que es consistente con lo que se observa en el cáncer de vejiga humana. Este modelo es ideal para el estudio de cochecarcinogénesis, las estrategias de prevención y el tratamiento del cáncer de vejiga localizado y avanzado en los seres humanos. En el futuro, tenemos la intención de realizar estudios adicionales de la inmunoterapia en combinación con quimioterapia y radioterapia en el modelo de cáncer de vejiga se describe.
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Disclosures
DPV, MMA, SMG, CJK, AMG y GKH no declarar los intereses en conflicto. MWD es el investigador principal de la subvención recibida de Merck KGaA y MW es un empleado de Merck KGaA.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer al Programa de Biología de la Universidad de California Davis ratón para la cría de los ratones. Esta investigación fue apoyada por una donación de Merck KGaA, Darmstadt, Alemania.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)-nitrosamine (OH-BBN) | TCI America | B0938 | |
| 20 G Gavage Needles | Popper Sons, Inc. | 7921 | Stainless steel |
| Peptide Vaccine | N/A | N/A | investigational agent |
| BD Microtainers | BD | 365957 | |
| Tissue Cassettes | Simport | M490-12 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | SF100-4 | |
| Lysis Buffer | Pierce | 87787 | |
| Halt Protease & Phosphatase inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 78444 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | |
| Mouse Cytokine 20plex Kit | Invitrogen | LMC006 | |
| Magnetic Microsphere Beads | Luminex | MC100xx-01 | xx is the bead region |
| Anti-mouse TNF- Capture Antibody | BD Pharmingen | 551225 | |
| Anti-mouse TNF- Detection Antibody | BD Pharmingen | 554415 | |
| Anti-mouse IFN- Capture Antibody | Abcam | ab10742 | |
| Anti-mouse IFN- Detection Antibody | Abcam | ab83136 | |
| PBS, pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Assay Buffer | Millipore | L-MAB | |
| Cytokine Standard | Millipore | MXM8070 | |
| Multi-screen HTS 96well filter plates | Millipore | MSBVN1210 | |
| SA-PE | Invitrogen | SA10044 | |
| 100 m Nylon Tissue Sieves | BD | 352360 | |
| Splenocyte Separation Media | Lonza | 17-829E | |
| TNF- /IL-4 ELISpot plates | R&D Systems | ELD5217 | |
| Rabbit Anti-MUC1 monoclonal antibody | Epitomics | 2900-1 | |
| Goat Anti-actin monoclonal antibody | Sigma | A1978 | |
| Anti-rabbit HRP antibody | Promega | W401B | |
| Goat anti-mouse HRP antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-2005 | |
| PVDF membrane | BioRad | 162-0174 | |
| Mini Protean TGX Precast Gels | BioRad | 456-1083 | |
| Muse Count & Viability Kit | Millipore | MCH100104 | |
| MUC1 Antibody | BD Pharmingen | 550486 | IHC antibody |
| Animal Research Peroxidase Kit | Dako | K3954 | IHC staining |
| Equipment and Software | |||
| Millipore plate vaccum apparatus | Millipore | MSVMHTS00 | |
| Luminex Lx200 | Millipore / Luminex | 40-013 | Manufactured by Luminex, distributed by Millipore |
| Luminex Xponent Software | Millipore / Luminex | N/A | Version 3.1; included with Luminex Lx200 |
| Milliple Analyst Software | Milliplex / VigeneTech | 40-086 | Version 5.1 |
| Muse Cell Analyzer | Millipore | 0500-3115 | |
| Muse Software | Millipore | N/A | Version 1.1.0.0; included with Analyzer |
| Dissecting Microscope | Unitron | Z730 | |
| Graphpad Prism Software | Graphpad Software Inc. | N/A | Version 5.1 |
| Mini Protean Tetra Cell Gel apparatus | BioRad | 165-8001 | |
| Trans Blot SD Cell and PowerPac | BioRad | 170-3849 |
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