Summary
I denna artikel presenteras ett protokoll för en kontextuell och cued rädsla konditione test med en videoanalyssystem för att utvärdera rädsla inlärning och minne hos möss.
Abstract
Den kontextuella och cued rädsla konditione test är en av de beteendetester som bedömer förmågan hos möss att lära sig och komma ihåg ett samband mellan miljö-stickrepliker och aversiva upplevelser. I detta test är möss placerades i en konditioneringskammare och ges avklipp av en konditionerad stimulus (en auditiv cue) och en aversiv obetingat stimulus (en elektrisk fotchock). Efter en fördröjningstid mössen utsätts för samma konditioneringskammare och en annorlunda formad kammare med presentationen av den auditiva cue. Frysning beteende under testet mäts som ett index av rädsla minne. För att automatiskt analysera beteendet, har vi utvecklat en videoanalyssystem använder ImageFZ programvara programmet, som är tillgänglig som en gratis nedladdning på http://www.mouse-phenotype.org/. Här, för att visa detaljerna i våra protokoll, visar vi vårt förfarande för kontextuella och cued rädsla konditione test i C57BL/6J-möss använder ImageFZ system. Dessutom validerade vi våra protokoll och videon analyserande systemets prestanda genom att jämföra Frystiden mäts av ImageFZ system eller ett system dator mätning photobeam baserade med som görs av en mänsklig observatör. Såsom visas i våra representativa resultat, de data som erhålls genom ImageFZ liknade de som analyseras av en mänsklig observatör, vilket indikerar att beteendeanalys med användning av ImageFZ systemet är mycket tillförlitlig. Den nuvarande film artikel ger detaljerad information om testförfaranden och främja förståelsen för den experimentella situationen.
Introduction
Den kontextuella och cued rädsla konditione test är den beteendemässiga paradigm som används för att bedöma associativ rädsla inlärning och minne hos gnagare 1-3. Detta test har i stor utsträckning använts för att förstå de neurobiologiska mekanismer för rädsla inlärning och minne i transgena och knockout-möss 1,4-16. Frysning beteende, som definieras som fullständig orörlighet med undantag för andningen, är en vanlig reaktion på skrämmande situationer. I detta beteende paradigm, efter djuren utsätts för en ihopkoppling av en auditiv kö med en elektrisk footshock, de svarar på rädslan producerande stimulans genom att visa frysning beteende, vilket mäts som ett index på associativ rädsla inlärning och minne. Detta test kräver mindre utarbeta utrustning, mindre fysisk ansträngning av försöksledaren, och mycket mindre träningstid för möss än andra inlärnings-och minnesuppgifter, det i allmänhet kräver ca 5-10 min / dag per mus i 2 dagar. Även om testproceduren är simple och kräver lite tid att utföra, skall utredaren noggrant observera och mäta mus beteende, och därför har flera automatiska mätsystem utvecklats för att genomföra beteendeanalys 17-20. Vår video-analyssystem, som vi utvecklat med ImageFZ programvara, ger oss möjlighet att enkelt analysera frysbeteende och producerar mycket tillförlitliga resultat. Den här artikeln innehåller detaljerad information om vårt testförfarande och beskriver hur du använder ImageFZ programvara.
Protocol
Alla försök skall utföras i enlighet med den vägledning och protokoll som fastställts av lokala Djurvård och användning kommittéer.
1. Apparat Inställnings
- Anordning för konditionering och sammanhang testet är en kvadratisk kammare med en electrifiable gallergolv, en ljudkälla, och en kalibrerad stöt generator. Olika kammarstorlekar användes, med dimensioner som varierar från 54 cm x 27 cm x 30 cm 21 till 25 cm x 35 cm x 30 cm 22. I detta protokoll, apparaten består av en akryl kvadrat kammare (33 cm x 25 cm x 28 cm, transparent i de främre och bakre väggar, vitt i sidoväggarna) med metallgaller (0,2 cm i diameter, placerade 0,5 cm från varandra) omfattas genom en transparent akryl lock (Figur 1A). Det är nödvändigt att placera kammaren på en vit akryl golv (figur 1B) att analysera beteendet hos svarta, agouti, eller utspädd bruna möss eftersom ett bildanalyssystem med det jagmageFZ programvara (tillgänglig för gratis nedladdning, se tabell av material / reagenser) skiljer ett mörkt föremål från en vit bakgrund i varje video som bild. Albino möss också kan testas med hjälp av svarta metallgaller och en svart akryl golv (Figur 1B). Light-emitting diode (LED) tänds är fästa vid taket ovanför apparaten. Den gallergolv är upplyst på 100 lux med LED-lampor. En högtalare som är ansluten till ett vitt brus / tongenerator (Figur 1C) är monterad på ett tak 5 cm ovanför locket för att presentera en auditiv cue (ett vitt brus, 55 dB) som en betingad stimulus (CS). Gallren är kopplade till en stötgenerator (Figur 1C) för att leverera en elektrisk footshock som obetingat stimulus (US). Testkammaren är placerad i ett ljudisolerat rum (170 cm x 210 cm x 200 cm) (Figur 1D) för att minimera yttre buller under testerna. Detta tillstånd förhindrar även att de möss, som för närvarande inte är utsatta för entesta från att höra en auditiv kö eller läte av testmöss.
- Apparaten för den cued testet består av en kammare, som har olika egenskaper från konditioneringskammaren, vilket ger ett nytt sammanhang. Det är absolut nödvändigt att förändra de sensoriska signaler så mycket som möjligt så att musen uppfattar det nya sammanhang som vara orelaterade till konditioneringskammaren. Generellt är en annorlunda formad låda eller en triangulär kammare användas. Dessutom används olika belysning och / eller doftsignaler tillhandahålls också till musen. I detta protokoll, är apparaten en akryl triangulär kammare (33 cm x 29 cm x 32 cm, vita i varje sidovägg) med en platt, vitt golv för svart, agouti, eller utspädd bruna möss eller en platt, svart golv för albino möss, täckt med ett transparent akryl lock (figur 1E). LED-lampor är fästa vid taket ovanför apparaten. Belysningsgolvnivån är satt till 30 lux. En högtalare monteras i taket 5 cm ovanför locket prESENT en auditiv kö som är samma som den som ges till möss vid tiden för konditionering. Den triangulära Kammaren är belägen i en annan ljudisolerat rum från rummet där konditionering och sammanhang testet utförs.
- Varje kammare är utrustad med en takmonterad Charge Coupled Device (CCD) kamera ansluta till en Windows-dator via quad video splitter och USB bildinspelningsenhet för att övervaka musen beteende, och bilder av apparaten och musen fångas upp och analyseras av ansökan programvara ImageFZ (se protokoll 6). Vitt brus och footshock generatorer automatiskt av ImageFZ programvara, starttid och varaktighet vitt brus och footshock måste skrivas in i en textfil (se ett exempel textfil "enkel-villkor" visas i videon för information om hur parametrarna skrivs i filen), som läses in i programmet.
- Före varje prov börjar, akryl väggaroch golv torkas av med en handduk indränkt i super underklor vatten (pH 6-7) och gallren rengörs med 70% etanol för att förhindra en bias baserad på olfactory cues. Gallren är torkas med etanol i stället för super underklor vatten för att säkerställa att gallren inte minska deras elektriska ledningsförmåga på grund av rost.
2. Djurpreparering
- Generellt är 2-4 möss inrymt per bur i en temperaturkontrollerad djurrummet (23 ± 2 ° C) med en 12 tim ljus / mörker-cykel (t.ex. ljus på vid 7:00).
- I detta protokoll, för att minska eventuella påverkan av bur transport på beteende och att anpassa möss till den experimentella miljön, är de burar som innehåller mössen överförs från djur djurrummet in i ett ljudisolerat väntrummet intill ett ljudisolerat testrum minst 30 min Före varje provning påbörjas.
- Samtliga experiment (figur 2a) bör utföras under Same tidsperiod i ljus eller mörk fas varje dag för att minimera de beteendemässiga variationer som produceras genom att testa vid olika tidpunkter 23,24. I detta protokoll, är alla de experiment som genomfördes mellan 1 timme efter debuten av den lätta fasen och 1 timme före starten av den mörka fasen (från 8:00 till 6:00 i ljuset fas). Om endast en apparat är tillgänglig, bör möss av varje genotyp testas i en motvikts för att minska eventuella effekter av den experimentella tid och testordning ämnen på spatial förmåga. ImageFZ kan styra upp till 4 apparater. Testa 4 möss samtidigt med 4 apparater i en motvikts ordning tillåter forskaren att spara tid och minska eventuella effekter av de experimentella parametrar på musen beteende.
3. Conditioning
- Möss placeras i konditioneringskammare, och mössen typiskt tillåts att fritt utforska kammaren under 120 sek. Därefter auditory kö, till exempel ett vitt brus, tonen, och hörsel klickern, presenteras som ett CS i 30 sek, och en 0,1 till 0,8 mA fotchock ges till mössen som USA under de sista 2 sekunder av ljudet. Presentationen av CS-USA paring upprepas för att stärka föreningen. Mössen är kvar i kammaren under en lång tid efter den sista presentationen för att ytterligare etablera sambandet mellan ramen för kammaren och obehaglig upplevelse. I detta protokoll, efter 120 sekunder av fri utforskning, är en auditiv kö (vitt brus, 55 dB) presenteras i 30 sekunder, och en 0,3 mA fotchock levereras kontinuerligt under de sista 2 sekunder av vitt brus. Efter 90 sekunder, är ihopkopplingen av hörsel kö med fotchock ges till försöks igen. Presentationen av CS-US upprepas tre gånger per session (120, 240 och 360 sekunder efter början av den konditionerande) (Figur 2B). Efter den sista fotchock mössen lämnas ostörda i kamrarna för 90 sek.
- Innan konditione sessionen börjar, kör ImageFZ programvara program väljer plugin-menyn "FZ Conditioning och FZ Online (4 kammare), och ange parametervärden steg-för-steg enligt följande.
- Steg 1: Projekt-ID. Ange en mapp där du vill lagra dina datafiler.
- Steg 2: Sessionsnamn. Skriv några ord, till exempel den experimentella dag, i "Session"-rutan och välj en referens textfil där starttid och varaktighet vitt brus och footshock är skrivna, i "Reference" rutan. Ett prov textfil visas i videon.
- Steg 3: Parameterinställningar. Ange parametervärden i varje ruta enligt följande.
- Rate (bild / sek): bildfrekvens för bildtagning, t.ex. 1 bild / sek.
- Varaktighet (sek): När det gäller konditionering, är den totala varaktigheten 480 sek.
- Bin duration (sek): t.ex. 60 sek, data analyseras i varje block60 sek.
- Ämne storlek - min (bildpunkter): ImageFZ upptäcker en mus och buller som svarta partiklar (en massa av pixlar) i en vit bakgrund i varje bild. När det gäller den svarta partiklar (bildpunkter) är mindre än den "Ämne storlek - min (bildpunkter)" värde (t.ex. 100 pixlar), partiklarna betraktas som buller och undantas från bildanalysen.
- Ämne storlek - max (pixlar): när storleken på de svarta partiklarna är mer än storleken på den "Ämne storlek - max (bildpunkter) värdet partiklarna inte med i analysen.
- Ramstorlek - bredd / höjd (cm): kammardimension, dvs 33 cm bred och 25 cm hög.
- Frysning kriterium (pixlar): t.ex. 30 pixlar, se information i protokoll 6.
- Frysning varaktighet - min (sek): t.ex. 2 sek, när ingen mus rörelse detekteras för bara mindre än 2 sekunder, är dess beteende inte räknas som "frysning",.
- Shock hastighet (bild / sek): se detaljerna i protokoll 6.
- Steg 4: Ämne ID. Ange ämnesidentifiering.
- Steg 5: Kamerainställningar. Styr ljusstyrkan och kontrasten i den tagna bilden.
- Steg 6: Threshold Settings. Justera tröskelvärden för att upptäcka en svart mus som svarta pixlar i en vit bakgrund i varje bild och att döma mus beteende som "frysning" eller "icke-frysning" (se detaljer i protokoll 6). För att analysera en albino mus, klicka på kryssrutan "inverterat läge", och justera tröskelvärdena på lämpligt sätt.
- Steg 7: Ställ Cage Field. Ange området för varje kammare som du vill fånga. När du klickat på rektangeln knappen i verktygslådan, rita en rektangel runt golvet i kammaren på live-bildfönstret. Välj sedan kammarnummer och klicka på "Set"-knappen. Slutligen klickar du på "Complete"-knappen.
<li> Efter parameterinställningar är inställda, ska ett förberedande prov ges med hjälp av övnings möss (möss som inte används som subjekt) innan det första testet av dagen för att avgöra om bildanalyssystemet och vitt brus / chockgeneratorer fungerar utan problem. - Flytta en buren innehåller övnings möss till den ljudisolerade testrummet från den intilliggande väntrummet, och placera varje mus i konditionekammaren. Omedelbart efter att placera mössen i kammaren, klicka på startknappen för ImageFZ. I programmet presenteras auditiva ledtrådar och / eller elektriska footshocks till mössen i den ordning som du anger i en referens-fil.
- Efter 480 sekunder har gått, återgår mössen till sina hem bur och återgå buren till hyllan i djurrummet.
- Rengör kamrarna noggrant. Klicka sedan på "Next Analysis"-knappen, och upprepa steg 3.2.4-3.6 för försöksmöss.
- ImageFZ butiker lever och spåra bilder i TIFF-format. Programmet gör det möjligtoss att utföra en analys off till en ny analys av bilder med hjälp av modifierade parametervärden. Om du gör en offline analys, väljer plugin-menyn "rädsla Conditioning och FZ Offline" och välj mapp data som du vill att en ny analys. Därefter indataparametervärdena igen, och klicka på "Complete"-knappen.
4. Context Test
- Efter konditioneringssessionen har avslutats mössen återvände till samma konditioneringskammare och avslutade för frysning beteende att mäta innehållsrade fruktan (kontext test). En fördröjningsintervall mellan konditionering och ramen testet har i allmänhet fastställd till 24 timmar. I detta protokoll, för att bedöma färskt minne och fjärrminne (mätt med testet 1 dag och mer än 28 dagar efter behandling, respektive) 25, är mössen utsattes för sammanhanget testet ca 24 timmar och 30 dagar efter konditionesessionen. Mössen placerades i conditioning kammare och tillåts att fritt utforska kammaren under 300 sek utan CS och US-presentationer (figur 2C).
- Kör ImageFZ programvara och ställa in programmet programvarans parametervärden på samma sätt som i konditione (se avsnitt 3.2.3), men ändra varaktighet för detta test till 300 sek och välja en referens textfil för sammanhanget testet . När du har ändrat inställningen, bör en förberedande prov ges med hjälp av övnings möss för att kontrollera ImageFZ systemet.
- Placera varje mus i konditioneringskammaren och klicka på startknappen. Efter 300 sekunder har gått tillbaka mössen in i deras hem buren, och lämna buren orörd tills cued testet börjar.
- Rengör kamrarna. Klicka sedan på "Next Analysis"-knappen, och upprepa steg från 4,3 till 4,4 i testmöss.
5. Cued Test
- Cued testet utförs på samma dag på den kontext test eller på nästa dag.I detta test är möss placerades i en annan testkammaren med mycket olika egenskaper, vilket ger en ny kontext som inte har samband med konditioneringskammaren under 3 min. I slutet av den första 3 min, är hörsel kö som presenteras vid konditionering ges till möss i 3 min i romanen sammanhang miljön. I detta protokoll är cued test utfört några timmar efter ramen testet. Möss får utforska den trekantiga kammare under 360 sek. I den första 3 min, är varken en CS eller USA presenteras, och därefter, är en CS (en 55 dB vitt brus) som presenteras för de sista 3 min.
- Kör ImageFZ programvara och ange parametervärden på samma sätt som i konditionering, förutom ändra varaktigprovtillfället till 360 sek och välja en referens textfil för cued testet. Efter justering av inställningen, ska ett förberedande prov ges med hjälp av övnings möss för att kontrollera ImageFZ systemet.
- Placera varje mus i den trekantiga kammaren och klicka på startknappen. Efter 360 sekunder har gått, återgår mössen till sina hem bur och återgå buren till hyllan i djurrummet.
- Rengör kamrarna. Klicka sedan på "Next Analysis"-knappen och upprepa steg från 5,3 till 5,4 i testmöss.
- För att ytterligare testa fjärrminne, upprepa protokollen 4-5 ca 30 dagar efter konditionesessionen (Figur 2A).
6. Bildanalys
- Utför datainsamling och analys automatiskt med hjälp ImageFZ. Denna programvara Programmet bygger på det offentliga rummet ImageJ programmet (utvecklat av Wayne Rasband vid National Institutes of Health och finns på http://rsb.info.nih.gov/ij/), modifierad av Tsuyoshi Miyakawa (ImageFZ programvara , tillgänglig för gratis nedladdning, se tabell av material / reagenser).
- För alla experiment, ta bilder vid en given bildhastighet (t.ex. 1 fps) med ImageFZ med hjälp av en USB-video capture enhet, inklusive envideokamera. För att mäta den sträcka från de på varandra följande bilder, justera "tröskel min" värdet av programmet (t.ex. 80 pixlar), som är inställd på att segmentet bilderna i ett svart partikel (en mus) och en vit bakgrund. Den tillryggalagda sträckan beräknas ur avståndet mellan varje uppsättning av xy-koordinater för tyngdpunkten hos partikeln i de på varandra följande bilder.
- För att mäta frys beteende från de på varandra följande bilder, justera tröskel min (xor) värdet av programmet (t.ex. 160 bildpunkter), som är inställd på att segmentet bilderna i ett svart partikel (mus) och bakgrund, och sedan beräkna areal (bildpunkter) i nonoverlapping regioner mellan partiklar av varje par av bilder i följd. Justera värdet genom att använda skjutreglaget för tröskelverktyget tills det svarta partikel i varje bild matchar formen på hela kroppen av musen exklusive svansen. Om området av nonoverlapping regionen är under frysning kriteriet "värde (t.ex. 30 pixlar), är beteendet anses vara" frysa "(figur 3), som i allmänhet definieras som den fullständiga avsaknaden av rörelse förutom andning och hjärtslag. När området överstiger detta värde, är beteendet anses vara "icke-frysning" (Figur 3). Domen bör göras på grundval av definitionen av frysning. Möss ibland uppvisar en subtil rörelse och en momentan orörlighet, vilket inte kan anses som en frysning beteende som speglar rädslan. Den orörlighet som varar en kort tid (t.ex. mindre än 2 sek), vilket sannolikt skiljer sig från manifestationen av rädsla, kan uteslutas från analysen genom att ställa in tidströskel för frysning. För att ställa in tröskel tiden input "Frysning varaktighet - min (sek)" värde (t.ex. 2 sek).
- Den ImageFZ programmet automatiskt calculates tillryggalagd sträcka (cm) och den procentandel av frysning. Resultaten sparas i textfiler, och bor och spåra bilder lagras i ett TIFF-format. För att mäta den sträcka (cm) som ett index på elektrisk footshock känslighet, det ImageFZ programmet förvärvar också bilder med hög bildhastighet (t ex 4 fps) för 6 sekunder, mätt från 2 sek innan leverans av en 2 sek fotchock till 2 sek efter fotchock under online-analys. För att ställa in bildhastigheten för fotografering före, under, och efter footshock, mata in ett värde i "Shock hastighet (bild / sek)" rutan. Efter online-analys, utföra offline analys genom att välja en plug-in menyn "FZ Shock offline" för att erhålla data för den sträcka.
- De parametervärden för ImageFZ programmet bör optimeras för att generera resultat som liknar de som erhålls av observatörer i förberedande test. För manuell poäng, är den frysning beteende kontinuerligt mäts med en stopwatch och en händelse-inspelningsprogram eller ett förfarande momentant tidssampling varje 3-10 sek, under analys med ImageFZ programvara. Två observatörer genomför normalt beteendeobservationer. För att justera parametervärdena för ImageFZ programmet för att se till att resultaten av bildanalysen överensstämmer med de mänskliga observatörer, göra en offline analys av ImageFZ programmet, modifiera tröskel min (xor) "och" frysa kriterium värderingar . För att utföra offline analys, markera plugin-menyn "FZ Offline" och matar in några parametervärden.
7. Felsökning
- Hur kan det ImageFZ programmet erhållas och installeras?
Den ImageFZ Programmet finns för gratis nedladdning från vår hemsida (se tabell av material / reagenser), och körs på en Windows-dator. Ladda ner zip-mappen för ImageFZ och installera programmet på din dator. Se "readme.txt"-filen för INSTALLATIONpå detaljer och följ steg-för-steg-instruktioner. - Varför är felmeddelandet "Fel inställning inspelningsenhet" visas?
Kontrollera anslutningen av kamerakabeln och din förare installation av USB-bildinspelningsenhet. Om det inte finns något problem med inställningarna och det ImageFZ programvara kanske inte fungerar med din bildinspelningsenhet. Se "readme.txt"-fil om lämplig enhet för användning med ImageFZ programvara. - ImageFZ kan inte upptäcka hela kroppen av musen som en partikel.
Ställ in värdet på "tröskel min" och / eller "tröskel min (xor) lägre än det aktuella värdet. Om ImageFZ inte kan upptäcka musen på en viss plats, till exempel i hörnet av ett provrum, då otillräckliga testförhållanden, till exempel ett jämnt belyst golv eller en något kontrasterande skillnad mellan musen och bakgrunden, kan förekomma. För att lösa detta problem, justera parametervärden (t.ex. - Bild fånga på en hög bildhastighet saktar ner datorn under online-analys.
Ställ in bildhastigheten till ett värde som är lägre än det belopp, och utför online-analys. Den ImageFZ analys, genom bild förvärv på 1 fps, räcker för exakt mätning av frysning, som visas i resultat avsnittet företrädaren. - Resultaten av ImageFZ analysen håller inte med de mänskliga poäng.
Undersök den lagrade bilden och bedömningsresultatet filer. Om ImageFZ skattar frysning, ställ in "frysning kriteriet" till ett lägre värde än det aktuella värdet, och utföra offline analys. Om ImageFZ skattar frysning, ställ in "frysning kriteriet" till ett högre värde än det aktuella värdet. - I optogenetical och in vivo elektrofysiologiska experiments, fiberkabeln som finns på huvudet av musen stör dom frysa.
Coat kablarna i vitt för en svart mus och ändra position och vinkel på kameran tills kablarna inte upptäcks. - Vad som behövs för offline analys?
Skapa en mapp med namnet "Image_FZ" i rotkatalogen på ImageFZ programmet. I denna mapp, skapa undermappar "bilder" och "Sessions". Flytta en 8 bitars gråskala bild till "Bilder"-mappen, och skapa en textfil där bild filnamnet är skrivet i "Sessions"-mappen. Därefter kör ImageFZ offline analys, och följ instruktionerna i programmet.
Representative Results
I rädsla konditione test, mänskliga experimentatorer användas för att kvantifiera den frysning beteende genom arbetskrävande direkt observation 26-29, men nyligen photobeam-baserad dator mätning (t.ex. den "Freeze Monitor 'systemet) och bild-analyssystem har använts för att automatiskt mäta frys beteende 26,30-32. ImageFZ är en automatiserad bild-analyssystem, som ger resultat som är jämförbara med dem som erhållits genom mänsklig observation, såsom beskrivs nedan. Här jämförde vi resultaten av mänsklig observation med de ImageFZ analys under varierande parametrar: "Rate (bild / sek)" och "Frysning kriterium (bildpunkter)." I detta experiment fem manliga C57BL/6J möss (genomsnittlig kroppsvikt ± SD (g), 31,4 ± 3,55; betyda kroppsstorlek ± SD (pixlar), 351,6 ± 62,2) användes vid 15 till 27 veckors ålder. Den mänskliga observationen gjordes med hjälp av en händelse-inspelningsprogram (en Macintosh OS9 program), en nyckel-pressning händelse som fortsätterd 2 sekunder eller mer när en mus visade en släng av ingen rörelse ansågs "frysning". Den procentuella andelen av frysning beräknades varje 60 sekund i varje test och används för korrelationsanalyser. I procent av frysning görs av de två observatörer (interobserver tillförlitlighet, för konditionering, r = 0.879, för sammanhang test, r = 0.957, för cued prov, r = 0.866, i alla fall, r = 0.888) var i genomsnitt för att generera en människa poäng. Korrelationer mellan frys procentsatser mäts genom ImageFZ med varje bildfrekvens (dvs. 1, 2, och 4 fps) och de som ingår i de mänskliga observationer undersöktes. Som visas i figur 4, var frysprocenten genom ImageFZ (1, 2, och 4 fps) starkt korrelerad med den medelvärdet av mätningarna av de två observatörer. Noterbart är att ta bilder med en högre bildhastighet inte alltid ger den bästa korrelationen. Bildanalys på 1 fps gett resultat liknar de som erhålls från mänskliga observatörer i earje prov. Korrelationer mellan frys procentsatser mäts genom mänskliga observationer och med hjälp ImageFZ under varje tillstånd av "Frys kriteriet (bildpunkter)" (dvs. 20, 30, och 40 pixlar) undersöktes. De frysta procentsatser beräknats med hjälp ImageFZ på "Frys kriteriet (bildpunkter)" av den 20, 30 och 40 pixlar var, i alla fall, starkt korrelerade med de som ingår i de mänskliga observationer (Figur 5). Som visas i figur 5D, när frys kriteriet är satt till ett lågt värde, den subtila rörelser med musen, anses vara "frysning" av observatörer, skulle betraktas som "icke-frysning" med hjälp ImageFZ. Omvänt, om kriteriet är satt till ett högt värde, förflyttning av en mus, gjorde som "icke-frysning" av observatörer, skulle betraktas som "frysning" med hjälp ImageFZ (figur 5C, 5F och 5I). Således, för att få de mest tillförlitliga resultat, varje parameter i ImageFZ programmet bör kalibreras ossning data görs genom mänskliga observationer i varje testmiljö.
Dessutom har vi jämfört resultaten genererade av en mänsklig observatör som använder en dator mätsystem photobeam baserat (Freeze monitorsystem), med dem som erhölls med användning av ImageFZ (se figur 6). Den mänskliga observatören var blind för behandlingsgruppen och resultaten av ImageFZ scoring. För parameterinställningarna för Freeze Övervaka systemet, använde vi tre mått på andelen frysning från ett tidigare validerat systemet 30. Kortfattat, antalet 10-sek intervall i vilka djuren krävde mer än 1 eller 2 sekunder för att korsa den första nya strålen av intervallet (1 sek 10 sek och 2 sek 10 sek, respektive) och latensen mellan början av varje 5 sek intervall och den tredje nya trålen avbrott inom detta intervall (Latency3) mättes. Procentsatserna i intervallen under vilka musen frysning eller den andel av den totala tid rbligatoriskt att bryta den tredje photobeam beräknades.
Procentsatserna av frysning som uppmätts i varje system illustreras i figur 6. Grupperna jämfördes med användning av två-vägs upprepade mätningar ANOVA följt av t-tester (se tabell 1). De frysta procentsatser som mäts med ImageFZ (Figur 6B) var mer liknar de gjorde genom mänsklig observation (Figur 6A) än de uppgifter som erhållits med hjälp av en photobeam baserat system (figur 6C-E). De frysta procentsatser som mäts med hjälp av ImageFZ programmet i varje test var starkt korrelerade med de som gjorde mål genom mänsklig observation (konditionering, r = 0.947, kontext test, r = 0,970; cued prov, r = 0,934), medan sambanden mellan frys procentsatser uppmätta använder datorn mätsystem photobeam baserade (1sek 10 sek, 2 sek 10 sek, eller Latency3) och den mänskliga observatören var lägre (konditionering, r = 0.503, 0.593 och 0.761, sammanhang test, r = 0.772, 0.819 och 0.912) jämfört med sambanden mellan frys procentsatser som mäts med ImageFZ och mänsklig observation (fig. 7A och 7B). Dessutom Figur 7 visar att skillnaderna mellan frys procentsatser som erhålls genom mänsklig observation och använder ImageFZ i varje mus var de minsta skillnaderna. Dessa resultat indikerade att frysning procentsatser som mäts med ImageFZ liknade de som erhålls genom mänsklig observation och att ImageFZ är mycket noggrann när man mäter mängden av frysning.
Figur 1. Apparat för den kontextuella och cued rädsla konditionetest. (A) En akryl fyrkantig kammare för konditionering och sammanhang test, (
Figur 2. Schematisk bild av protokollet. (A) Översikt av kontextuella och cued rädsla konditione test, (B) konditionering, (C) cAKGRUND testet, och (D) cued testet. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Bildanalys av ImageFZ programvara. För varje par av successiva bilder, är den areal (bildpunkter), genom vilken flyttade musen beräknas av ImageFZ. När detta område är under en viss nivå (t.ex. 30 pixlar), är beteendet bedöms vara "frysning". När den areal uppgår till eller överstiger tröskelvärdet, är beteendet anses vara "icke-frysning". Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Jämförelser av frys procentsatser beräknats från bilder till olika bildhastighet med hjälp ImageFZ med de som mättes genom mänsklig observation. Rädslan tester konditionegenomfördes med hjälp av manliga C57BL/6J-möss (n = 5). Under testerna, två observatörer gjorde det frysning beteende. Samtidigt var livebilder tagna vid 4 fps med hjälp av ImageFZ programmet. De filer som tagits vid 4 fps har bantat efter extraktion ramarna för att motsvara bilder som tagits på 1 fps eller 2 fps. De parametervärden för "Rate (bild / sek)" var satt till 1, 2 eller 4 bilder per sekund, och frysning procenttal i varje 60-sek bin beräknades från bildfiler med ImageFZ offline analys. Varje punkt representerar en frys andel av varje 60-sek bin. Pearsons korrelationskoefficienter mellan uppgifterna från mänsklig observation och ImageFZ analys beräknades.Klicka här för att visa en större bild.
Figur 5. De frysta procentsatser beräknas från bilderna på olika frys kriterium värden med ImageFZ och de som uppmätts genom mänskliga observationer jämfördes. Rädslan tester konditionegenomfördes med hjälp av manliga C57BL/6J-möss (n = 5). Under testerna, inspelad två observatörer frysning beteende, och de levande bilderna fångades med hjälp av ImageFZ programmet. De frysta procenttal i varje 60 sek bin beräknades från bilderna (1 bild / sek) genom ImageFZ offline analys, ställa in parametervärden för "Frys kriterium (bildpunkter)" till 20, 30 eller 40 pixlar. Varje punkt representerar en frys andel av varje 60-sek bin. Pearsons korrelations coefficients mellan uppgifterna från mänsklig observation och ImageFZ analysen beräknades i varje test. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 6. Procentsatserna av frysning mättes med användning av automatiserade system och mänsklig iakttagelse i obetingade och betingade grupper av hankön C57BL/6J möss (n = 5 vardera grupp). (A) Human observation, (B) ImageFZ, (C) Frysmonitorsystem 1 (1 sek 10 sek), (D) Frys monitorsystem 2 (2 sek 10 sek), och (E) Freeze monitorsystem 3 (Latency3). Grupp jämförelser utfördes med tvåvägs upprepade mätningar ANOVA följt av t-tester (unconditioned gruppen vs rade grupp, *, P <0,05; †, p <0,01). De data som erhållits med hjälp av ImageFZ liknade de gjorde genom mänsklig observation. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 7. Korrelation och distribution av skillnaderna mellan frys procentsatser, mätt med hjälp av automatiska system och mänsklig observation. (AB) Spridningsdiagram och Pearsons korrelationskoefficienter mellan frysning procentsatser görs genom automatiserade system och mänskliga observationsfrekvens visas. De frysta procentsatser, beräknade med hjälp ImageFZ, var starkt korrelerade med de som erhålls genom mänsklig observation. (CF) förekomster av mindre än en 10% difskillnaden mellan de frys procentsatser som erhålls vid automatiserade system kontra mänsklig observation var högst när data analyseras med ImageFZ jämfördes med de som analyserades genom mänsklig observation. Klicka här för att visa en större bild.
| ANOVA | |||
| Skick | Tid | Skick x Tid | |
| Dag 1 (konditionering) | |||
| Humant | F (1,8) = 28,53, p = 0,0007 | F (7,56) = 20,79, p <0,0001 | F (7,56) = 16,58, p <0,0001 |
| ImageFZ | F (1,8) = 13,97, p = 0,0057 | F (7,56) = 21,40, p <0,0001 | F (7,56) = 11,69, p <0,0001 |
| Freeze-skärm (1sec10sec) | F (1,8) = 5,16, p = 0,0528 | F (7,56) = 2,39, p = 0,0329 | F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 |
| Freeze-skärm (2sec10sec) | F (1,8) = 4,07, p = 0,0782 | F (7,56) = 3,44, p = 0,0039 | F (7,56) = 1,52, p = 0,1803 |
| Freeze-skärm (Latency3) | F (1,8) = 4,44, p = 0,0682 | F (7,56) = 9,94, p <0,0001 | F (7,56) = 4,33, p = 0,0007 |
| Dag 2 (kontext) | |||
| Humant | F (1,8) = 42,94, p = 0,0002 | F (4,32) = 1,91, p = 0,1336 | F (4,32) = 1,48, p = 0,2302 |
| ImageFZ | F (1,8) = 49.61, p = 0,0001 | F (4,32) = 2,06, p = 0,1087 | F (4,32) = 0,83, p = 0,5174 |
| Freeze-skärm (1sec10sec) | F (1,8) = 20,28, p = 0,002 | F (4,32) = 1,63, p = 0,1918 | F (4,32) = 0,55, p = 0,6997 |
| Freeze-skärm (2sec10sec) | F (1,8) = 40,20, p = 0,0002 | F (4,32) = 2,66, p = 0,0504 | F (4,32) = 1,20, p = 0,3306 |
| Freeze-skärm (Latency3) | F (1,8) = 35,30, p = 0,0003 | F (4,32) = 2,49, p = 0,0626 | F (4,32) = 1,09, p = 0,3793 |
Tabell 1. Jämförelser av statistik.
Discussion
Den kontextuella och cued rädsla konditione test är en av de mest använda paradigm för att utvärdera inlärning och minne. Detta test är en form av Pavlovsk beting där en association görs mellan en kontext och / eller en betingad stimulus (auditiv cue) och en aversiv stimulus (elektrisk fotchock). Efter en enda parning av sammanhanget / hörsel cue och footshock, möss uppvisar långvarig frysning när man står inför antingen sammanhanget eller kön. I detta test är frysning beteende används som ett index på rädsla minne. Farmakologiska och lesion studier har visat att minnesbildning, konsolidering, och hämtning regleras i flera delar av hjärnan, som amygdala, hippocampus, och prefrontala cortex 3,33-35. Dessutom har molekylära genetik studier visat betydelsen av specifika gener och molekyler som är involverade i inlärning och minne i dessa områden i hjärnan med hjälp av genmanipulerade möss 36. Därför är detta test enkee och användbar för att utforska den neurobiologiska grunden underliggande rädsla inlärning och minne. I den här filmen artikeln, introducerade vi våra protokoll för att förse praktiker med detaljerad information för att förstå och lätt att genomföra testet.
Frysning beteende kvantifierades genom direkt observation av mänskliga praktiker. En vältränad försöks förväntas ge tillförlitliga och stabila resultat över observationer. Dock innebär den här metoden potentiella problem, som till exempel skillnader i observationsmetoden, observatörs fördomar och enkla kvantifiering misstag, vilket gör det svårt att direkt jämföra resultaten från oberoende praktiker och olika laboratorier. Ett automatiskt system dator mätning photobeam baserade har också använts 26,30-32. Men detta system innebär också potentiella problem i att mäta frysning beteenden. På grund av sensorarrangemanget, kan detta system inte kan upptäcka små huvudrörelser som skulle Typically görs som "aktiv" genom mänsklig observation. Dessutom darr under frysning kan betraktas som nonfreezing eftersom när ett djur fryser, intermittenta avbrott i photobeam observeras som en följd av skakningar. Som en alternativ metod, har automatiserade bild-och videoanalyssystem utvecklats 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 beskrivs några system med bildanalys programvara som har god validitet och göra mål fryser väl 17,20,37-38. Men de flesta av dessa system och analysprogram måste erhållas från kommersiella leverantörer och är vanligtvis kostsamma. Vi utvecklade den ImageFZ programvara för analys av frys beteende, och detta program distribueras som fri programvara. ImageFZ känner av musen som en samling bildpunkter (en partikel) och diskriminerar subtila musrörelser som "fryser" eller "icke-fryser", beroende på mängdenområde nonoverlapping regioner mellan partiklar av varje par av bilder i följd. Såsom visas i de representativa resultat, mätningar med ImageFZ programmet överensstämmer med eller mer exakt än som erhålls med användning av andra metoder. Således mäter ImageFZ programmet automatiskt det beteende som observatörer bedömer som frysning med hjälp av definierade kriterier. Dessutom beräknar ImageFZ programmet den sträcka (cm) före, under och efter footshock exponering, underlätta en bedömning av stötkänslighet och analys av den frysning beteende.
Metodologiska skillnader mellan laboratorierna. Dessa skillnader kan leda till svårigheter att jämföra data mellan laboratorier och replikera resultat i olika laboratorier. För att få mer stabila och jämförbara uppgifter, är det nödvändigt att standardisera testprotokollet så mycket som möjligt. Analyssystem med ImageFZ leder till automatisering av testprocedurer, som kan bidra tillstandardisering av protokoll som används över laboratorier.
Flera beteendemässiga svar måste beaktas när man analyserar frysning beteende. Först när djuren står inför en fruktansvärd situation, kan de fly istället för att frysa 39. Flyr är ett av rädslan svar och dess förekomst kommer att leda till en underskattning rädsla minne. För det andra, kan frysning bero på en allmän aktivitetsnivå, och aktivitetsnivån i försöks-och kontrollmöss måste undersökas. Till exempel, även möss som saknar M1 muskarinacetylkolinreceptorn visade sänkta nivåer av frysning jämfört med vildtyp möss, olika beteendetester indikerade att resultaten kan tillskrivas deras hyperaktivitet fenotyp istället för deras minne nedskrivningar 18. ImageFZ beräknar avståndet (cm) rest av försökspersonerna. Uppgifterna finns tillgängliga för att undersöka om det finns skillnader i de allmänna aktivitetsnivå mellan ämnen. Om det finns en grupp skillnad itillryggalagd sträcka, en möjlig lösning på problemet är att betrakta den sträcka under den första 2 min utbildning som baslinje aktivitet och att använda en dämpning ratio (suppression ratio = (aktivitet under testet) / (aktivitet under baslinjen + aktivitet under provning)) som en sekundär index på rädsla 17,40. Slutligen kan en skillnad i smärtkänslighet, vilket inducerar förändringar i reaktivitet till en elektrisk fotchock, om någon, resultera i variationer i frysbeteendet. ImageFZ beräknar också den sträcka (cm) i detalj från 2 sekunder innan en exponering av en 2 sek fotchock till 2 sekunder efter exponeringen (för 6 sek), som kan användas som ett index på footshock känslighet.
Video-analyssystem har utvecklats för att mäta frys beteende albino, svart, agouti, och späd bruna möss. ImageFZ använder en svart golv bricka och svarta galler för att undersöka vita möss (se Figur 1B). De svarta Gallren är tillverkade av speci ally bearbetade metaller med belagt svart färg och har en elektrisk ledningsförmåga som liknar den i de noncoated metallgaller, vilka typiskt används för svarta möss. ImageFZ analyserar också frysning beteende hos råttor och andra gnagare genom justeringar av programparametrarna. I den aktuella versionen av ImageFZ är beteendet hos ämnet registrerades med användning av en videokamera från den övre väggen för att analysera frysning. ImageFZ skulle också kunna användas i en installation där bilderna är tagna från sidan av kammaren. Dessutom ImageFZ styr maximalt fyra anordningar. Denna funktion gör att forskare att samtidigt undersöka 4 möss, vilket sparar tid och minskar den potentiella påverkan från skillnader i den tid det tar för varje ämne och test ordning på beteendet. Således ImageFZ förenklar testproceduren och analys av frys beteende, och detta program underlättar testning med mindre arbete och utan någon utbildning för de beteendemässiga experiment.
e_content "> I Miyakawa labbet, har vi bedömt mer än 110 stammar av genetiskt modifierade möss och vildtyp kontroll möss i den kontextuella och cued rädsla konditione testet med hjälp av videoanalyssystem för att belysa effekterna av en viss gen på inlärning och minne 41-42 Vi har fått en stor mängd rådata för mer än 5000 möss Den rådata som användes för publicerade forskningsartiklar 4-16 ingår i "Mus Fenotyp Database" som en offentlig databas (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Denna film artikel ger detaljerad information om detaljerna i vår experimentella förfarandet och främjar förståelsen av diskrimineringstester.Disclosures
Vi bekräftar att det inte finns några kända intressekonflikter i samband med denna publikation och det har skett någon betydande ekonomiskt stöd för detta arbete som kan ha påverkat resultatet.
Acknowledgments
En del av de som uppges här erhölls i laboratoriet av Dr Jacqueline N. Crawley i US National Institute of Mental Health och vi vill tacka henne för att tillåta oss att visa data i tidningen. Vi tackar också Kazuo Nakanishi för hans hjälp med att utveckla ImageFZ program för beteendeanalys. Denna forskning stöds av Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning (B) (21.300.121), Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning om innovativa områden (Comprehensive Brain Science Network) från ministeriet för utbildning, vetenskap, sport och kultur i Japan , bevilja från Neuroinformatics Japan Center (NIJC), och bidrag från CREST av Japan Science and Technology Agency (JST).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageFZ program | Developed by Tsuyoshi Miyakawa | This program is available through O'Hara & Co., Tokyo, Japan and for free download at http://www.mouse-phenotype.org/. This software runs on 32-bit Windows XP/Vista/7. | |
| Conditioning chamber | O’Hara & Co., Japan | CL-3002L | For mouse. |
| Cued test chamber | O’Hara & Co., Japan | CLT-3002L | For mouse. |
| Interface | O’Hara & Co., Japan | CL-1040 | The interface includes a white noise/tone generator, which can be controlled by ImageFZ program. |
| Scrambled shock generator | O’Hara & Co., Japan | SGA-2040 | The shock generator can be controlled by ImageFZ program. |
| Shock grid tester (ammeter) | O’Hara & Co., Japan | SG-T | |
| USB video capture device | XLR8 | USB2IVOSX | |
| Quad image splitter | Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Japan | 400AS | |
| Soundproof room | O’Hara & Co., Japan | CL-4210 | |
| Freeze Monitor | San Diego Instruments, Inc., CA, USA | 16 x 16 photbeam array ( 2.5 cm spacing) |
References
- Crawley, J. N. What's wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , John Wiley & Sons. New York. (2007).
- Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
- Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
- Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
- Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
- Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
- Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
- Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
- Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
- Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
- Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
- Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
- Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
- Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
- Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
- Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
- Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
- Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
- Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
- Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
- Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
- Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
- Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
- Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
- Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
- Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
- Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
- Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
- Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
- Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
- Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
- Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
- Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
- Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).
