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Biology

Arabidopsis रूट Gravitropic प्रतिक्रिया के उच्च संकल्प समय व्यपगत छवियों को इकट्ठा करने के लिए flatbed स्कैनर का उपयोग करना

Published: January 25, 2014 doi: 10.3791/50878
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल वाणिज्यिक उपलब्ध flatbed स्कैनर का उपयोग कर एक गुरुत्वाकर्षण उत्तेजना का जवाब देने Arabidopsis seedlings की छवियों के तेजी से संग्रह के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है. विधि बहाव के विश्लेषण एल्गोरिदम के लिए उत्तरदायी उच्च संकल्प छवियों की सस्ती, उच्च मात्रा को पकड़ने के लिए अनुमति देता है.

Abstract

जीव विज्ञान में अनुसंधान प्रयासों तेजी से उच्च संकल्प डेटा की उच्च मात्रा संग्रह है कि सक्षम तरीके के इस्तेमाल की आवश्यकता होती है. प्रयोगशालाओं का सामना कर सकते हैं एक चुनौती इन तरीकों के विकास और प्राप्ति है. ब्याज की एक प्रक्रिया में phenotypes का अवलोकन जीन समारोह का अध्ययन अनुसंधान प्रयोगशालाओं का एक विशिष्ट उद्देश्य है और इस बार छवि पर कब्जा के माध्यम से हासिल की है. इमेजिंग तरीकों का उपयोग कर अवलोकन करने के लिए उत्तरदायी है कि एक विशेष प्रक्रिया गुरुत्वाकर्षण वेक्टर साथ संरेखण से विस्थापित किया गया है कि एक अंकुर जड़ से सुधारात्मक वृद्धि है. जड़ gravitropic प्रतिक्रिया को मापने के लिए इस्तेमाल किया इमेजिंग प्लेटफार्मों, महंगा throughput में अपेक्षाकृत कम है, और / या श्रम गहन हो सकता है. इन मुद्दों को सस्ती, अभी तक उच्च संकल्प, flatbed स्कैनर का उपयोग कर एक उच्च throughput छवि पर कब्जा पद्धति विकसित करके संबोधित किया गया है. इस विधि का प्रयोग, छवियों 4,800 डीपीआई पर हर कुछ मिनट पर कब्जा कर लिया जा सकता है. मौजूदा सेटअप 216 व्यक्ति आर के संग्रह में सक्षम बनाता हैदिन प्रति esponses. एकत्र छवि डेटा छवि विश्लेषण के लिए आवेदन पत्र पर्याप्त गुणवत्ता की है.

Introduction

उच्च संकल्प प्ररूपी डेटा के संग्रह जीवधारी समारोह 1,2 मध्यस्थता में आनुवांशिकी की परस्पर क्रिया और पर्यावरण को समझने के लिए कि उद्देश्य के अध्ययन में उपयोगी है. यह प्रकृति का अध्ययन यह भी आवश्यक इस संदर्भ में phenotypes को मापने के लिए नियोजित तरीके throughput 3,4 में उच्च किया कि है, जिससे बड़े पैमाने में भी स्वाभाविक रूप से बड़े हैं. Phenomics पैमाने पर अनुसंधान के लिए विधि की स्थापना में, throughput और इस संकल्प के बीच tradeoffs खेलने में आते हैं. Throughput में उच्च रहे हैं कि तरीकों में भी इसे और अधिक कठिन आनुवंशिकी या पर्यावरण का 5 छोटे प्रभाव का पता लगाने के लिए कर रही है, संकल्प में कम हो जाते हैं. वैकल्पिक रूप से, अधिक सावधानी से एक वांछित phenotype कि उपाय तरीकों में भी यह मुश्किल मोटे तौर पर आनुवांशिक और पर्यावरणीय प्रभावों का सर्वेक्षण करने के लिए बना throughput में कम हो जाते हैं. इसके अतिरिक्त, दृश्य निरीक्षण सहित बढ़ाता phenotypes, के लिए मैनुअल तरीके के कारण मानव प्रति में मतभेद के बदलाव के लिए विषय हो सकता हैception 6.

इमेजिंग तकनीकों प्ररूपी टिप्पणियों 7-9 प्राप्त करने में throughput और संकल्प के बीच एक उपयोगी पुल प्रदान कर सकते हैं. सामान्य तौर पर, एक छवि throughput की सुविधा, कब्जा करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, और पर्याप्त संकल्प में ले लिया, जब सूक्ष्म phenotypes 1,2,7 पता लगाया जा सकता है. इमेजिंग तकनीकों ब्याज की एक प्रणाली या प्रक्रिया को फिट करने के परिवर्तनीय हो जाते हैं और 10-12 आम तौर पर स्केलेबल हैं. इस वजह से, इमेजिंग तकनीकों जीवधारी समारोह का बड़े पैमाने पर अध्ययन के विकास के लिए आदर्श होते हैं.

एक गुरुत्वाकर्षण उत्तेजना को प्राथमिक रूट की प्रतिक्रिया एक आकृति विज्ञान के साधारण अंग के भीतर होता है कि एक जटिल शारीरिक प्रक्रिया है. प्रतिक्रिया जड़ अंग के माध्यम से प्रचार और इसकी प्रगति को पर्यावरण 12-14 से प्रभावित आनुवंशिक कारणों सहित पर्यावरण और आनुवंशिक कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है कि रास्ते संकेतन के सक्रियण शामिल 12,14,15 mediating कारकों में, वहाँ है. प्रतिक्रिया की गतिशीलता की एक विस्तृत समझ पाने सफलतापूर्वक एक दिया पर्यावरण 16 के भीतर स्थापित बनने के लिए पौधों की क्षमता में सुधार के लिए उपायों की खोज में महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, जड़ का आकार यह उत्तरदायी छवि प्रसंस्करण आवेदन 8,12,17 के लिए बनाता है. साथ में ले ली, जड़ gravitropic प्रतिक्रिया जीवधारी समारोह के जीनोमिक्स स्तर के अध्ययन के संचालन के उद्देश्य के लिए उच्च throughput इमेजिंग प्रौद्योगिकी के विकास के लिए एक आदर्श व्यवस्था है.

इस रिपोर्ट में, सस्ती, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध flatbed स्कैनर का उपयोग कर जड़ gravitropic प्रतिक्रिया की छवि को पकड़ने के लिए एक उच्च throughput, उच्च संकल्प विधि प्रस्तुत किया है. का अवलोकनप्रोटोकॉल चित्रा 1 में दिखाया गया है. अगर प्लेटों पर लगाए seedlings कस्टम Plexiglas प्लेट धारकों के साथ लगे खड़ी उन्मुख flatbed स्कैनर पर तैनात थे. छवियाँ 4,800 डीपीआई पर हर कुछ मिनटों एकत्र की है और एक स्थानीय ड्राइव या डेटा सर्वर पर बच गए. प्रत्येक छवि श्रृंखला के साथ संबद्ध मेटाडाटा एक डेटाबेस पर संग्रहीत किया जाता है और संग्रहीत छवियों कार्रवाई कर रहे हैं. दृष्टिकोण छवि को पकड़ने के लिए VueScan सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है. VueScan (सामग्री तालिका देखें) विंडोज, मैक या लिनक्स ऑपरेटिंग सिस्टम पर 2,100 से अधिक विभिन्न स्कैनर चलाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 4,800 डीपीआई के एक स्कैनर संकल्प तय सीसीडी कैमरों 1,8,12 का उपयोग पिछले अध्ययनों में हासिल संकल्प मैच के लिए इस आवेदन में इस्तेमाल किया गया था. आम अंतरफलक के साथ VueScan सॉफ्टवेयर का लचीलापन यह है कि यह उपयोगकर्ताओं को आसानी से इस अखबार में प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त संकल्प के किसी भी स्कैनर हार्डवेयर को अपनाने के लिए अनुमति देता है चलाता किसी भी स्कैनर के लिए उपयोग करता है. वर्तमान throughput की वसूली के लिए की अनुमति देता हैप्रति दिन 216 व्यक्ति हिमायती हैं. प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालयों को अनुसंधान के लिए उच्च विद्यालयों से लेकर संस्थानों में उपयोग के लिए अनुकूलनीय और स्केलेबल है. इसके अलावा, एकत्र छवियों छवि विश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के हैं.

Protocol

1. छवि अधिग्रहण प्रोटोकॉल

बातें:

एक अकेले काम करने के लिए यह संभव है, हालांकि यह प्रोटोकॉल सबसे अधिक कुशलता से, दो लोगों के साथ किया जाता है. इस प्रयोगशाला में सबसे अच्छा काम व्यवस्था स्कैनर स्थापना पर एक और काम करता है, तो दोनों स्कैनर में प्लेटें प्लेस और स्कैनिंग की प्रक्रिया शुरू करने के लिए एक साथ काम करते हैं, जबकि स्कैनिंग के लिए प्लेटें तैयार करने के लिए एक व्यक्ति के लिए था.

यह इस परियोजना में स्कैनर खड़ी स्कैनर पलकों स्कैनर की पीठ पर आराम के साथ कर रहे हैं उन्मुख भी ध्यान दें कि महत्वपूर्ण है. एक कस्टम समर्थन इस ऊर्ध्वाधर स्थिति में व्यंजन धारण करने के लिए बनाया गया था और 3M कमान स्ट्रिप्स के साथ flatbed सतह (चित्रा 2) से चिपका था. इस प्रोटोकॉल (एक Epson V700) में इस्तेमाल किया स्कैनर के साथ आता है कि हटाने योग्य दस्तावेज़ कवर काला लगा के साथ एक तरफ लाइन में खड़ा था. दस्तावेज़ कवर एक बंजी कॉर्ड के साथ flatbed के खिलाफ तैनात किया गया थाजगह में प्लेटें पकड़ और छवि के विपरीत (चित्रा 3) प्रदान करने के लिए.

पर्याप्त संकल्प के किसी भी स्कैनर छवि को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Epson पूर्णता V700 क्योंकि बिस्तर और ढक्कन दोनों से स्कैन करने के लिए और अवरक्त चैनल का उपयोग करने के लिए अपने वर्ग प्रोफाइल (यह आसान खड़ी की स्थिति के लिए बना रही है), अपने उच्च संकल्प, और अतिरिक्त विकल्पों में से चुना गया था. ये अतिरिक्त विकल्प इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल नहीं किया गया.

प्लेटों विकास कक्ष से हटा दिया गया है एक बार, यह प्रोटोकॉल अंत करने के लिए जारी रखना अनिवार्य है.

प्लेट तैयारी

पारदर्शी माध्यम के 10 एमएल और एक थाली के बीच में लगाए 9 बीज युक्त स्टैंडर्ड पेट्री डिश में इस्तेमाल किया गया. : थाली लेबलिंग, मीडिया तैयारी और रोपण के लिए प्रक्रिया में पाया जा सकता http://www.doane.edu/doane-phytomorph

  1. एक Kimwipe साथ ढकने के लिए ट्राइटन X-100 (एक डिटर्जेंट) लागू करें - उदार हो.
    (ट्राइटन X-100 प्लेट स्कैन किया जाता है के रूप ढक्कन पर संक्षेपण के buildup को रोकने में मदद करता है ध्यान दें. एक उदार आवेदन (पर्याप्त ढक्कन सतह पर एक फिल्म बनाने के लिए) ढक्कन पूरे स्कैनर चलाने भर पारदर्शी रहता है सुनिश्चित बनाने में मदद मिलेगी .)
  2. ढक्कन सुरक्षित करने के लिए micropore टेप के साथ प्लेट लपेटें, और वेंटिलेशन के लिए अनुमति देने के लिए.

स्कैनर सेटअप और छवि संग्रह

इस प्रोटोकॉल से अधिक 1 स्कैनर का इस्तेमाल किया जा रहा है जो मानता है, और एक ही कंप्यूटर से कई स्कैनर शुरू करने के निर्देश प्रदान करता है.

  1. प्रत्येक स्कैनर से छवियों को संग्रहीत करने के लिए फ़ोल्डर बनाएँ. प्रत्येक स्कैनर दो प्लेटें पकड़, ताकि फ़ोल्डरों बनाते समय यह ध्यान में रखना होगा. एकऐसी अनूठी प्रत्येक थाली के लिए आईडी, अंकुर उम्र, बीज आकार, और लगाए शेयरों की आईडी के रूप में फ़ाइल नाम के घटकों के रूप में मेटाडाटा का उपयोग करने के लिए चुन सकते हैं. इन मेटाडाटा युक्त डेटा संग्रह में इस्तेमाल एक फ़ोल्डर नाम का एक उदाहरण "1652-2 -एस.एम.-9-92-17-1653-2-LG-88-79-161" है.
  2. नामित एकत्रित समय के लिए आउटलेट टाइमर सेट (9 घंटा इस प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया था). तैयारी के लिए अतिरिक्त समय (या तो एक घंटे) स्थापित करने के लिए सुनिश्चित करें.
    VueScan सॉफ्टवेयर एक उपयोगकर्ता को बार बार छवियों को इकट्ठा करने के लिए अनुमति देता है (. स्कैनर अधिग्रहण के समय सेट करने के क्रम में आउटलेट टाइमर में खामियों को दूर किया जाना चाहिए ध्यान दें कि, यह उपयोगकर्ता इंगित करने के लिए अनुमति नहीं है कि कितने एकत्र करने के लिए छवियों या कैसे के लिए छवियों को इकट्ठा करने के लिए लंबे समय तक .)
  3. पहले स्कैनर चालू करें और अपने प्रारंभिक गर्म अप के माध्यम से जाने के लिए स्कैनर के लिए लगभग 10 मिनट रुको.
  4. एक बार VueScan प्रोग्राम खोलें. VueScan संस्करण 9.0.20 (सामग्री तालिका देखें) इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था, यद्यपि अधिक हाल के संस्करण थोड़ा modific के साथ प्रयोग किया जा सकता हैसमझना. 'अधिक' बटन नीचे वर्णित मेनू विकल्प प्रदर्शित करने के लिए यूजर इंटरफेस के नीचे पैनल पर दबा दिया गया है सुनिश्चित करें.
  5. ऑटो दोहराने निर्धारित करें: ड्रॉप डाउन बक्से कोई नहीं पर सेट पूर्वावलोकन क्षेत्र इनपुट टैब के तहत और फसल टैब के तहत अधिकतम करने के लिए (चित्रा 4). प्रेस 'पूर्वावलोकन'.
  6. क्लिक करें और पूर्वावलोकन छवि पर ब्याज की पूरे क्षेत्र में खींचें करने के लिए माउस का उपयोग करके ब्याज के क्षेत्र पर कब्जा होगा कि एक फसल बॉक्स बनाएँ. सेटिंग्स फसल टैब में रुचि के क्षेत्र के लिए परिवर्तित किया जा सकता है. फसल बॉक्स के लिए इस्तेमाल विशिष्ट सेटिंग्स थे: 0.675 एक्स ऑफसेट, Y-ऑफसेट यह प्रत्येक स्कैनर के लिए अंकुर क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए समायोजित किया गया है, हालांकि में 1.924. प्रयोग किया जाता फसल बॉक्स आकार (चित्रा 5) लंबा में 1.1 से विस्तृत में 7.246 था.
  7. माउस के साथ खींचते समय फसल बॉक्स करने के लिए कदम, शिफ्ट कुंजी पकड़. फसल बॉक्स सभी स्कैन किया जाना seedlings के साथ साथ एक लेबल (चित्रा 5) पर काबू पाया जा सकता है कि किसी भी वांछित मेटाडाटा शामिल सुनिश्चित करें.
  8. फसल टैब के तहत, पूर्वावलोकन क्षेत्र सेट: फसल बॉक्स और प्रेस 'पूर्वावलोकन' के लिए.
  9. आउटपुट टैब पर जाएं और स्कैनर के लिए सही फ़ाइल (चित्रा 5) का चयन करें.
  10. दोहराएँ एक कंप्यूटर के लिए सभी स्कैनर पर 1.7-1.12 कदम. VueScan की एक से अधिक उदाहरण खोलने के लिए जब पूछा कि क्या 'हां' विकल्प चुनें.
  11. प्रत्येक टैब के माध्यम से जाओ और सेटिंग्स सही हैं सत्यापित. (सभी विशेषताओं छवि रंग, संकल्प, आदि सहित एक व्यक्ति प्रयोगशाला की जरूरतों को फिट करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है ध्यान दें. हालांकि, इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया सेटिंग्स सीधे देहात के लिए लागू किया जा सकता हैrticular कारण VueScan सॉफ्टवेयर की आम अंतरफलक के लिए दिए गए प्रयोगशाला के हार्डवेयर स्कैनिंग. VueScan संस्करण 9.0.20 का उपयोग कर इस परियोजना में इस्तेमाल किया मानकों,) देखने के लिए संलग्न विनिर्देशों सूची देखें.
  12. इनपुट टैब के तहत ऑटो दोहराने में सतत चयन: क्षेत्र, या अगर वांछित छवियों के बीच एक लंबे समय के अंतराल का चयन करें. समय अंतराल स्कैनर पिछले छवि को बचाने और अगले छवि के संग्रह की शुरुआत के बाद रुक जाता है समय की लंबाई है. सतत मोड में, 3-4 मिनट संकल्प 4800 डीपीआई पर प्राप्त किया जा सकता है.
  13. दोहराएँ एक ही कंप्यूटर से जुड़े स्कैनर के आराम के लिए 1.14-1.15 कदम.
  14. क्षैतिज उन्मुख seedlings के साथ सही स्कैनर (gravistimulate नहीं है) में तैयार प्लेटें प्लेस.
  15. अस्थायी रूप से वे Plexiglas टेम्पलेट से गिर नहीं है इसलिए प्लेटों के खिलाफ पृष्ठभूमि लगा, एक काले रंग की जगह है. सभी स्कैन के लिए दोहराएँners.
    (नोट: इस परियोजना में, लगा के काले मोहरों दस्तावेज़ चमक को रोकने के लिए और जड़ ऊतक के खिलाफ विपरीत प्रदान करने के लिए उपकरणों के साथ प्रदान कवर से जुड़े थे प्रयुक्त विशिष्ट पृष्ठभूमि रंग ऊतक imaged किया जा रहा है के रंग पर निर्भर करेगा.).
  16. एक व्यक्ति (प्लेटों इस प्रोटोकॉल में वामावर्त कर दिया गया) प्लेटें 90 डिग्री बारी और तुरंत महसूस पृष्ठभूमि की जगह है.
  17. वे तुरंत 'स्कैन' बटन प्रेस कर सकते हैं ताकि अन्य व्यक्ति कंप्यूटर पर खड़ा किया जाना चाहिए.
  18. एक बंजी कॉर्ड (चित्रा 3) के साथ स्कैनर के लिए पृष्ठभूमि सुरक्षित. एक व्यक्ति दूसरे पदों बंजी कॉर्ड, जबकि जगह में पृष्ठभूमि पकड़ है.
    (नोट: तुरंत gravistimulation (90 ° द्वारा प्लेटों के रोटेशन) और महसूस किया पृष्ठभूमि की नियुक्ति के बाद, 'स्कैन' दबाया जाना चाहिए).
  19. दोहराएँ एक ही कंप्यूटर पर स्कैनर के आराम के लिए 1.17-1.21 कदमोंएर.
  20. दोहराएँ यदि लागू हो स्कैनर के अगले सेट के लिए 1.6-1.22 कदम.
  21. कई छवियों वे सही ढंग से बचत कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए एकत्र किया गया है जब तक स्कैनर मत छोड़ो.
  22. यह नामित स्कैन समय के लिए गड़बड़ी से मुक्त हो जाएगा कि एक क्षेत्र में स्कैनर रखने के लिए आदर्श है. यह आदर्श प्ररूपी प्रतिक्रियाओं सुनिश्चित करने के लिए स्कैनिंग क्षेत्र में पर्यावरण की स्थिति पर विचार करने के लिए भी समझदारी है.
  23. डेटा संग्रह पूर्ण होने पर, प्रत्येक स्कैनर के साथ मेल खाता है कि प्रत्येक VueScan खिड़की पर हरे गर्भपात बटन दबाएँ.
  24. कंप्यूटर पर सभी कार्यक्रमों के बाहर बंद.
  25. कंप्यूटर को पुनरारंभ करें और छवि संग्रह के दूसरे दौर की शुरुआत से पहले सभी स्कैनर बंद.

Representative Results

प्रतिनिधि छवियाँ

यह दृष्टिकोण Arabidopsis अंकुर विकास के उच्च संकल्प समय श्रृंखला का तेजी से उत्पादन में सक्षम बनाता है. एक स्कैनर रन की पहली और आखिरी छवियों आंकड़े 7A और 7B में दिखाया गया. 7C और 7 दिन एक पूर्ण स्कैनर छवि के आधे से इष्टतम परिणाम दिखाने के आंकड़े. छवि गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं कि कुछ मुद्दों आंकड़े 7A और 7B में दिखाया गया. इन मुद्दों अंकुरण में भिन्नता, रन के शुरू में विकास पथ अंकुर में भिन्नता है, और स्कैनिंग के दौरान संक्षेपण के buildup शामिल हैं. संघनन काफी हद तक थाली ढक्कन के अंदर करने के लिए लागू ट्राइटन X-100 की राशि में वृद्धि करके हल किया जा सकता है. सही छवि संग्रह को बाधित कर सकता है कि अन्य कारकों वे फसल बॉक्स के लिए सम्मान के साथ विषम रहे हैं कि इस तरह की थाली की स्थिति और स्थिति प्लेटों के संबंध में फसल बॉक्स की गलत विन्यास कर रहे हैं.

छवि विश्लेषण आवेदन: छवि संपीड़न
स्कैनर छवियों का एक समय अनुक्रम प्राप्त हो जाने के बाद इसे सुरक्षित छवि विश्लेषण की सुविधा के लिए एक नेटवर्क सुलभ तरीके से संग्रहित किया जाना चाहिए. एक व्यक्ति स्कैनर चलाने के साथ जुड़े छवि फ़ाइलों को हार्ड ड्राइव अंतरिक्ष की एक महत्वपूर्ण राशि पर कब्जा. 4800 डीपीआई पर एकत्र एकल झगड़ा फाइल के बारे में 220 एमबी है और एक ठेठ स्कैनर रन 200 छवि फ़ाइलों को उत्पन्न करता है. इसलिए, हार्ड ड्राइव अंतरिक्ष के बारे में 44 जीबी रन प्रति आवश्यक है. छवि विश्लेषण के साथ जुड़े भंडारण और नेटवर्क के प्रसारण की लागत को कम करने के लिए यह एक ही समय में डेटा नुकसान को कम करते हुए दुकान छवि डेटा के लिए आवश्यक स्थान की मात्रा को कम करने के लिए वांछनीय है. डाउनस्ट्रीम विश्लेषण एक प्रयोगात्मक रन के साथ जुड़ा बाद छवि फ़ाइलों में प्रत्येक अंकुर की पहचान शामिल होगी. इसलिए, स्कैनर छवि से एकल seedlings के बाहर segmenting बहाव के विश्लेषण की सुविधा कर सकते हैं. क्योंकि दूर वीं के बाकी हिस्सों से अंकुर का विभाजनई छवि भी काफी अनावश्यक पृष्ठभूमि पिक्सल के भंडारण को कम कर सकते हैं, इस दृष्टिकोण भी डेटा आकार में उल्लेखनीय कमी की ओर जाता है. बहाव के विश्लेषण जड़ ऊतक पर केंद्रित है इसके अलावा, अगर यह जड़ पिक्सल उनके रंग अंतरिक्ष में अपेक्षाकृत संकीर्ण हैं क्योंकि रंग जानकारी बनाए रखने के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है. एक कंप्यूटर छवि प्रसंस्करण प्रोटोकॉल और दोनों व्यक्तिगत seedlings के बाहर segmenting और बड़े पैमाने ग्रे छवियों में कनवर्ट करके डेटा के आकार को कम करने के लिए कोड विकसित किया गया है. दृष्टिकोण भंडारण अंतरिक्ष आवश्यकताओं में एक 60% की कमी का परिणाम है.

इस डेटा संपीड़न प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया कार्यप्रवाह निम्न चरणों में वर्णित है:

  1. एक एकल फ़ोल्डर में स्कैनर छवि फ़ाइलों का एक समय श्रृंखला के साथ शुरू करो.
  2. प्रत्येक छवि के लिए, (8 चित्रा, ऊपर) पैमाने ग्रे को एक आरजीबी से परिवर्तित.
  3. बाएँ और दाएँ पक्ष में छवि को विभाजित.
  4. अपनी फ़ाइल (8 चित्रा) में छवि से प्रत्येक अंकुर निकालें.इस काले या सफेद और फिर प्रत्येक छवि पंक्ति की कुल पिक्सेल तीव्रता की गणना करने के लिए पिक्सल परिवर्तित करने के लिए एक सीमा लागू करने के द्वारा किया जाता है. उच्चतम तीव्रता के साथ पंक्ति में पहचान की है और प्रत्येक पिक्सेल 'संयंत्र' या अपने पड़ोसियों की तीव्रता के आधार पर 'nonplant' के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. इस पंक्ति के भीतर प्रत्येक 'संयंत्र' के केंद्र में पाया जाता है और उस जगह से एक पूर्व निर्धारित आकार की एक फसल बॉक्स (8 चित्रा, नीचे) तैयार की है.
  5. व्यक्तिगत समय श्रृंखला छवि फ़ाइलों के भंडारण के लिए प्रत्येक अंकुर के लिए अलग सबफ़ोल्डर्स साथ छवि (बाएं और दाएं) के प्रत्येक पक्ष के लिए एक अलग फ़ोल्डर बनाएँ.
  6. एक संकुचित ज़िप फ़ाइल में जिसके परिणामस्वरूप फ़ोल्डरों संग्रह.

इन चरणों accomplishes एक कोड प्रोग्रामिंग भाषा अजगर 20 का उपयोग कर विकसित किया गया है. एल्गोरिथ्म डेटा आकार में लगभग 60% की कमी के लिए अनुमति देता है और स्कैनर imag के 90% में सभी व्यक्तिगत seedlings की पहचान करने में करने में सफल हैई फ़ाइलें इस प्रकार अब तक का विश्लेषण किया. कोड (सामग्री तालिका देखें) ग्नू जनरल पब्लिक लाइसेंस संस्करण 3 के तहत डाउनलोड के लिए आसानी से उपलब्ध हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. स्कैनिंग प्रक्रिया बीज रोपण (प्रति प्लेट में नौ Arabidopsis बीज) के साथ शुरू होता है और डेटा भंडारण और छवि प्रसंस्करण के साथ समाप्त होता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
पेट्री डिश समर्थन के निर्माण के लिए चित्रा 2. टी emplate. मिसाल xiglas चौड़ाई (इस मामले में 227 मिमी) flatbed कि फिट ऐसे में कटौती और लंबाई 128 मिमी था. एक 88 मिमी व्यास के साथ दो हलकों वे समान रूप से समर्थन की चौड़ाई और लंबाई के साथ वितरित किए गए है कि इस तरह शेष टुकड़ा से बाहर काट रहे थे. समर्थन 3M कमान स्ट्रिप्स के साथ flatbed से चिपका था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
Seedlings gravistimulated किया गया है और दस्तावेज़ कवर तैनात चित्रा 3. स्कैनर विन्यास के बाद. इस स्कैनर सेटअप और छवि संग्रह के कदम 1.21 पर स्कैनर का विन्यास है."_blank"> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
स्कैनर सेटअप और छवि संग्रह के कदम 1.8 के लिए चयनित सेटिंग्स की चित्रा 4. स्क्रीन शॉट. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
नीले बॉक्स के लिए विशिष्ट सेटिंग्स पर प्रकाश डाला गया है, जबकि चित्रा 5. कदम 1.9 और स्कैनर सेटअप और छवि संग्रह के 1.10 दौरान VueScan सॉफ्टवेयर की स्क्रीन शॉट. लाल बॉक्स फसल आकार पर प्रकाश डाला गया आर एक्स और वाई ऑफसेट seedlings और लेबल जानकारी पर कब्जा करने के क्रम में प्रयोग किया जाता है. स्कैन करने के लिए flatbed के क्षेत्र पूर्वावलोकन क्षेत्र में एक बिंदीदार रेखा के रूप में दिखाया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 6
चित्रा 6. स्कैनर सेटअप और छवि संग्रह के कदम 1.12 के लिए गंतव्य फ़ोल्डर का चयन. अगले डिफ़ॉल्ट फ़ोल्डर संवाद बॉक्स (लाल तीर) के लिए @ बटन दबाने उपयोगकर्ता उचित गंतव्य फ़ोल्डर का चयन करने के लिए अनुमति देता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 7 (ई.). ऊपर चित्र इस पत्र में वर्णित विधि का उपयोग कर एकत्र उन के उदाहरण हैं. पैनलों ए, बी और सी, डी एक भी स्कैन अवधि से क्रमश: पहला और अंतिम छवियों,, कर रहे हैं. ए, बी दिखाने पूर्ण सी, डी एक ही थाली दिखा, स्कैन किए गए क्षेत्र के एक फसली क्षेत्र हैं, जबकि क्षेत्र को छान डाला. कई विसंगतियों मनाया जा सकता है. पैनल एक अंकुरण में और विकास के पथ में बदलाव को दर्शाता है. पैनल बी (छवि एक के रूप में ही seedlings, 9 घंटा बाद) प्लेटें संक्षेपण जमा कर सकते हैं कि पता चलता है. पैनलों सी और डी के मजबूत विकास के ओ की वजह से अच्छे परिणाम माना जाता हैच seedlings और चलाने भर में छवि गुणवत्ता. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

8 चित्रा
चित्रा 8. विकसित छवि संपीड़न एल्गोरिथ्म पैमाने (ऊपर) ग्रे को एक स्कैनर छवि धर्मान्तरित. छवि सही और बाएँ हिस्सों में बांटा गया है और छवि सीमाओं () नहीं दिखाया हटा रहे हैं. प्रत्येक आधे पर व्यक्तिगत पौधों की स्थितियों को सबसे बड़ा कुल पिक्सेल तीव्रता के साथ पंक्ति खोजने के द्वारा पहचाने जाते हैं. उन पदों प्लेट (नीचे) पर सभी seedlings के लिए लागू नई फसल क्षेत्र, परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

सटीक प्ररूपी अवलोकन एक जीव के भीतर जीन समारोह की अभिव्यक्तियों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. प्ररूपी जानकारी प्राप्त करने के लिए एक तरह से उच्च संकल्प छवि डेटा का कब्जा के माध्यम से है. विकसित स्कैनर आधारित प्लेटफॉर्म घंटे के एक नंबर पर उच्च संकल्प (4800 डीपीआई) में कई छवियों का संग्रह (200 छवियों / स्कैन अवधि) के लिए सक्षम है. इसके अतिरिक्त, इस मंच आसानी वजह से एक आम अंतरफलक 18 का उपयोग करते हुए विभिन्न स्कैनर के हजारों चलाने के लिए VueScan सॉफ्टवेयर के लचीलेपन के लिए प्रयोगशाला और कक्षा वातावरण की एक किस्म के लिए अनुकूल है.

यहाँ प्रस्तुत विधि बड़े पैमाने phenotyping सुविधाओं और एक भी प्रयोगशाला में लागू स्वचालित प्रणाली से फैली कि उच्च throughput छवि पर कब्जा में एक शून्य भरता है. वर्तमान में उपलब्ध उच्च throughput प्लेटफार्मों पी के उच्च संकल्प छवियों पर कब्जा करने के लिए, रोबोट समर्थन करता है पर घुड़सवार कैमरों सहित विशेष इमेजिंग हार्डवेयर, का उपयोग करते हैंrimarily जमीन संयंत्र के ऊतकों (LemnaTec द्वारा संयंत्र एकीकृत प्रौद्योगिकी और Scanalyzer एचटीएस के लिए जैसे केंद्र) 20,21 ऊपर. वे मिट्टी पर्यावरण (प्लांट एकीकृत प्रौद्योगिकी के लिए जैसे केंद्र) 11,22,23 में बढ़ने के रूप में एक्स - रे और एमआरआई प्रौद्योगिकियों का उपयोग विशेष इमेजिंग सिस्टम भी उल्लेखनीय संकल्प के साथ मैदान ऊतकों नीचे की छवि के लिए विकसित किया गया है. अधिक विशिष्ट प्रौद्योगिकी के इस विकास गतिशील प्ररूपी पढ़ाई और अधिक कठिन बना रही है, की लागत पर आम तौर पर है. महत्वपूर्ण बात, इन उच्च अंत प्लेटफार्मों के लिए लागत और बुनियादी सुविधाओं की जरूरत छोटे प्रयोगशालाओं में कार्यान्वयन के लिए उन्हें अधिकतर unfeasible बना.

प्लेटफार्म भी अधिक मानक छवि पर कब्जा प्रौद्योगिकी का उपयोग करें और अच्छी तरह से इस तरह के एक गुरुत्वाकर्षण उत्तेजना को जड़ प्रतिक्रिया के रूप में गतिशील प्रतिक्रियाओं की माप के लिए अनुकूल हैं, जो विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, सीसीडी कैमरों उच्च पर प्रकाश और गुरुत्वाकर्षण के लिए व्यक्तिगत अंकुर प्रतिक्रियाओं पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैस्थानिक और अस्थायी समाधान 1,8,12. अन्य प्रणालियों एक एकल छवि (iPlant सहयोगात्मक द्वारा जैसे RootTipMulti) 17,24 से कई जड़ों की जड़ टिप उन्मुखीकरण की माप की अनुमति विकसित किया गया है. पूर्व मामले में, throughput अपेक्षाकृत कम उत्तरार्द्ध मामले में throughput अधिक है, जबकि केवल एक अंकुर एक समय में प्रत्येक कैमरे ने उतारी है कि दिए गए, लेकिन आम तौर पर संकल्प की कीमत पर है.

इस पत्र में उल्लिखित प्रक्रिया उपकरण और आसानी से उपलब्ध है और अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे हैं कि सॉफ्टवेयर के साथ उच्च throughput में उच्च संकल्प छवियों पर कब्जा करने के लिए एक मंच प्रस्तुत करता है. इस स्थापना का उपयोग, 1,080 व्यक्ति जड़ प्रतिक्रियाओं छह स्कैनर के एक बैंक से लैस एक भी प्रयोगशाला में प्रत्येक सप्ताह एकत्र किया जा सकता है. प्रति सप्ताह 864 व्यक्ति प्रतिक्रियाओं के एक औसत इकट्ठा करने के 15 महीनों में 41,625 पौधों की एक कुल एक जीनोमिक्स के अध्ययन के लिए स्कैन किया गया. व्यक्तिगत संग्रह का लगभग 15% की वजह से सेटअप त्रुटि, netwo करने में विफलआर.के. विफलता या उपकरण की खराबी. एक और 22% की प्रतिक्रियाएं एक विकास प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना करने के कारण अंकुरण या अपर्याप्त जड़ विकास की कमी के कारण विफल रहा. अंतिम डेटा सेट 163 पुनः संयोजक जन्मजात लाइनों से एक गुरुत्वाकर्षण प्रोत्साहन के लिए 27475 व्यक्ति अंकुर प्रतिक्रियाओं के साथ साथ 99 के पास isogenic लाइनों के होते हैं. डेटा यह एक बहुत ही उच्च throughput दृष्टिकोण है, जिससे एक भी प्रयोगशाला में एकत्र किए गए थे. यहां तक ​​कि अधिग्रहण के लिए उपकरणों का इस्तेमाल किया यह भी भारी उपयोग के साथ दो साल के लिए मज़बूती से काम कर रही है, अपेक्षाकृत सस्ती है कि दिए गए.

इस प्रोटोकॉल इस समूह के अनुसंधान उद्देश्य के लिए बहुत उपयोगी हो गया है, वहीं कुछ सीमाएं अभी भी मौजूद हैं. क्योंकि दिन प्रति असम्पीडित छवि डेटा के बारे में 50 जीबी के throughput के, यह प्रभावी संपीड़न योजनाओं विकसित किया जा सकता जब तक कि अंतरिक्ष की एक बड़ी राशि घर छवियों की जरूरत थी कि स्पष्ट किया गया था. भंडारण की समस्या अस्थायी रूप से प्रत्येक कंप्यूटर के लिए बाहरी हार्ड ड्राइव खरीद के द्वारा हल किया गया था. इसके अलावा, दो 10 टीबी नेटवर्क जुड़ा भंडारण उपकरणों खरीदे गए थे. ऊपर वर्णित के रूप में बाद में, संपीड़न एल्गोरिदम करने के लिए 60% (चित्रा 8) द्वारा डेटा के आकार को कम करने में मदद कर सकते हैं, जो विकसित किए गए. यह डेटा एक नेटवर्क जुड़ा भंडारण युक्ति को बचाया जा सकता है जिस गति से नेटवर्क कनेक्शन की गति पर निर्भर है कि नोट करना महत्वपूर्ण है. संपीड़न योजनाओं के कारण भी छवि डेटा की हानि को रोकने के लिए इच्छा के लिए विवश किया गया है.

एक स्कैनर आधारित इमेजिंग सिस्टम के लिए विशिष्ट अन्य सीमाओं पर भी विचार किया जा रहा है. उदाहरण के लिए, एक स्कैनर आधारित दृष्टिकोण में पौधों प्रत्येक स्कैन के दौरान सफेद और संभावित अवरक्त पर्वतमाला में उच्च तीव्रता प्रकाश के संपर्क में हैं. Seedlings अभी भी (चित्रा 7) एक गुरुत्वाकर्षण उत्तेजना को मजबूत प्रतिक्रियाओं से गुजरना करने के लिए मनाया जा सकता है, हालांकि यह संभावना, अंकुर विकास को प्रभावित करता है. एक भविष्य सुधार केवल अवरक्त एल ई डी सक्रिय हैं कि इस तरह के स्कैनर प्रोग्रामिंग शामिल सकता है. सक्रिय शहरी में एक क्षेत्रटी अच्छी तरह से इन छवि डेटा के संकल्प और throughput के लिए मिलान विश्लेषण एल्गोरिदम का सृजन है. इस स्कैनर आधारित पद्धति का उपयोग कर उत्पन्न बड़े डेटा सेट अंकुर छवियों के उच्च throughput phenotyping के लिए मजबूत उपकरण के विकास के लिए आदर्श रहा है. 7 चित्र में दिखाया गया है कि इन छवियों पर कार्यरत संपीड़न एल्गोरिथ्म वे छवि विश्लेषण अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी हैं कि दावे का समर्थन करता है. इसके अतिरिक्त, जनित छवियों वे कम संकल्प (कम से कम 1,200 डीपीआई) में एकत्र कर रहे हैं, तो पहले प्रकाशित एल्गोरिथ्म, RootTrace 17,24 से विश्लेषण किया जा सकता है, और व्यक्तिगत seedlings के विश्लेषण से पहले ऊपर वर्णित संपीड़न एल्गोरिथ्म का उपयोग कर छवि से खंडित कर रहे हैं. जड़ विकास डेटा टिप कोण डेटा 900 डीपीआई (अप्रकाशित अवलोकन) के लिए कम छवियों से निकाला जा सकता है, जबकि 1200 डीपीआई को कम छवियों से निकाला जा सकता है.

इस पत्र में उल्लिखित प्रक्रिया Roo की दुनिया में अपने खुद के आला में फिट बैठता हैअभी भी अपेक्षाकृत सस्ती जा रहा है, जबकि यह उच्च throughput और उच्च संकल्प है कि टी इमेजिंग. इस दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि आसानी से एक विशेष अनुसंधान समूह की इमेजिंग जरूरतों को पूरा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (पुरस्कार संख्या IOS-1031416) से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया और नाथन मिलर, लोगान जॉनसन और विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय के एडगर Spalding और ब्रायन Bockelman, कार्ल Lundstedt और दाऊद Swanson के सहयोग से आयोजित किया गया है नेब्रास्का हॉलैंड कम्प्यूटिंग सेंटर के विश्वविद्यालय.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epson Perfection V700 Photo Scanners Epson B11B178011 -
Plexiglas Scanner Template - - Custom made. See Figure 2.
Smart Strap Bungee Cords SmartStraps Wal-Mart 1079478
Brinks Digital Outdoor Timers Brinks Wal-Mart 42-1014-2
VueScan Software Hamrick Software http://www.hamrick.com
Segmentation Software Chris Wentworth, Doane College https://sites.google.com/a/doane.edu/compphy-doane/projects/root-gravitropism/image-segmentation
3M Micropore Tape Fisher Scientific 19-061-655 -
Holding racks - - Custom made by gluing two cookie racks together.

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 83 जड़ gravitropism Arabidopsis उच्च throughput phenotyping flatbed स्कैनर छवि विश्लेषण अनुसंधान स्नातक
Arabidopsis रूट Gravitropic प्रतिक्रिया के उच्च संकल्प समय व्यपगत छवियों को इकट्ठा करने के लिए flatbed स्कैनर का उपयोग करना
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Smith, H. C., Niewohner, D. J.,More

Smith, H. C., Niewohner, D. J., Dewey, G. D., Longo, A. M., Guy, T. L., Higgins, B. R., Daehling, S. B., Genrich, S. C., Wentworth, C. D., Durham Brooks, T. L. Using Flatbed Scanners to Collect High-resolution Time-lapsed Images of the Arabidopsis Root Gravitropic Response. J. Vis. Exp. (83), e50878, doi:10.3791/50878 (2014).

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