Summary
ونصف هنا استخدام متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس ل درجة الحموضة، وهو pHluorin، لدراسة الديناميات الزمانية للبصق لمستقبلات توجيه المحور العصبي التي تتاجر على سطح الخلية. يتم التعبير عن مستقبلات pHluorin الموسومة في كل من زراعة الخلايا وفي الجسم الحي، باستخدام الكهرومporation من جنين الفرخ.
Abstract
أثناء التطوير ، تلعب مستقبلات التوجيه المحوري دورا حاسما في تنظيم حساسية المحاور للإشارات الجذابة والبغيضة على حد سواء. في الواقع ، تفعيل مستقبلات التوجيه هو الخطوة الأولى من آليات الإشارات التي تسمح نصائح المحور المحور ، والمخاريط النمو ، للرد على ligands. على هذا النحو، وتعديل توافرها على سطح الخلية هي واحدة من الآليات التي تشارك في وضع حساسية مخروط النمو. نحن نصف هنا طريقة لتصور بدقة ديناميات سطح الخلية الصدغية من مستقبلات التوجيه المحوري على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي في الحبل الشوكي الفرخ النامية. لقد استفدنا من خاصية الفلورية المعتمدة على الحموضة لمتغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) للكشف على وجه التحديد عن جزء مستقبلات توجيه المحور الذي يتم توجيهه إلى غشاء البلازما. نحن أول وصف التحقق من صحة في المختبر من هذه البنى التي تعتمد على الحموضة ونحن مزيد من التفصيل استخدامها في الجسم الحي، في وتر العمود الفقري الفرخ ، لتقييم ديناميات spatio الزمنية لمستقبلات التوجيه المحورية من الفائدة.
Introduction
أثناء الملاحة، تدمج المحاور إشارات بيئية متعددة توجهها نحو هدفها. هذه الإشارات تنشيط مستقبلات التوجيه على سطح محطات المحور، والمخاريط النمو، والتي بدورها بدء مسار الإشارات المناسبة. وهكذا، فإن التنظيم الزمني والمكاني لتوزيع سطح الخلية من المستقبلات أمر بالغ الأهمية لضبطحساسية مخروطالنمو 1 . في هذا السياق، عبور خط الوسط بواسطة محاور المحور commissural هو نموذج ممتاز للتحقيق في تنظيم مستويات سطح الخلية مستقبلات. في الحبل الشوكي النامي ، تنجذب المحاور المفوضة في البداية نحو لوحة الأرضية البطنية حيث تعبر خط الوسط. بعد العبور ، يفقدون استجابتهم لمجذبات لوحة الأرضية ويكتسبون استجابة لطاردات لوحة الأرضية حتى يتمكنوا من الخروج من لوحة الأرضية والتنقل نحو وجهتهم النهائية في الجانب المقابل من الجهاز العصبي2،3. تنظيم توافر مستقبلات على سطح مخروط النمو هي واحدة من الآليات الكامنة وراء التحول من الاستجابة إلى العظة خط الوسط4,5. وهكذا، الرصد الانتقائي للمستقبلات الموجودة في غشاء البلازما من المخاريط النمو هو من الأهمية بمكان. نحن نصف هنا طريقة تستند إلى خاصية الفلورية المعتمدة على الرقم الحموضة لمتغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتصور مستقبلات توجيه المحور المحوري التي يتم توجيهها إلى غشاء البلازما في المختبر وفي الجسم الحي، في الحبل الشوكي الفرخ النامي.
روثمان وزملاؤه هندستها نقطة الطفرات المتغيرات الحساسة لHP من GFP بما في ذلك pHluorin الكسوف6. PHluorin Ecliptic لديه خاصية كونها غير فلورية عندما تتعرض لhh الحمضية (<6)، في حين يجري الفلورسنت في درجة الحموضة محايدة. وهذا يسمح التمييز بين مستقبلات nonfluorescent المترجمة في المقصورات الحمضية داخل الخلايا(أي الاندوسومات، والاتجار الحويصلات) من مستقبلات الفلورسنت أدرجت في غشاء البلازما وبالتالي تتعرض لHH محايدة خارج الخلية7. لقد استفدنا من ذلك لمراقبة توطين غشاء البلازما من plexinA1 ، وهو مستقبل توجيه محور التوسط استجابة مخروط النمو لطارد خط الوسط سيمافورين 3B5 (الشكل 1A). نحن نصف هنا التوصيف المختبري لبناء pHluorin-plexinA1 ، جنبا إلى جنب مع في ovo electroporation8-10 من هذا البناء في الحبل الشوكي الفرخ النامية تليها التحليل المجهري للخلايا المبردة التي تمكن من اتباع ديناميات مستقبلات التوجيه المحوري في الجسم الحي مع كل من القرارات المكانية والزمنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. استراتيجية الاستنساخ إلى علامة مستقبلات PlexinA1 مع pHluorin
- اختيار ناقل التعبير المناسب باعتباره العمود الفقري(على سبيل المثال مستقبلات الماوس plexinA1 التعبير عن ناقلات، هدية نوع من الدكتور أندرياس Puschel11).
ملاحظة: تم تصميم هذا المتجه plexinA1 لتحقيق كفاءة HA- أو VSV الموسومة مستقبلات الإدراج في غشاء البلازما. - تضخيم بواسطة PCR تسلسل الترميز pHluorin ecliptic باستخدام البلازميد كافية كقالب (على سبيل المثال pHluorin الموسومة GABA A مستقبلات, هدية نوع من الدكتور يعقوب2). إذا لزم الأمر، إضافة موقع تقييد إلى نهاية 5 من التمهيدي من أجل تسهيل خطوة الاستنساخ في العمود الفقري.
- إدراج تسلسل pHluorin في إطار بين الببتيد إشارة وتسلسل الترميز مستقبلات باستخدام مواقع تقييد(على سبيل المثال NruI/Kpn2I مواقع تقييد كما هو موضح في الشكل 1B).
ملاحظة: لأن الببتيد إشارة يضمن هو مشقوق الاستهداف الصحيح للمستقبلات، وينبغي وضع pHluorin بعد ذلك. وهذا يبرر الاعتراف الببتيد إشارة ويمنع انشقاق من pHluorin من مستقبلات الفائدة. - تسلسل البنى التي تم الحصول عليها لضمان عدم إدخال أي طفرة من قبل PCR.
2. توصيف مستقبلات pHluorin الموسومة في المختبر في خلايا COS7
يمكن تأكيد قدرة بروتين الانصهار للوصول إلى غشاء البلازما وفقدانه القابل للعكس للفلورسينس مع خفض درجة الحموضة باستخدام الإجراء التالي.
- اليوم الأول. لوحة 1.5 × 105 خلايا COS7 في طبق 35 ملم الزجاج القاع في 2 مل من كامل Dulbecco تعديل النسر المتوسط (DMEM - 10٪ مصل البقر الجنيني - 1 mM الصوديوم بيروفات - 25 U/ml البنسلين / السترومايسين - 2.5 ميكروغرام / مل أمفوتريسين B - pH 7.4).
- اليوم الثاني. خلايا العدوى:
ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا التقاء 70-80٪.- إعداد 200 ميكرولتر NaCl 150 mM وإضافة 3 ميكروغرام DNA أي مستقبلات ترميز المتجهات الموسومة بالهلوورين. دوامة بلطف وتدور لفترة وجيزة.
ملاحظة: تظهر خريطة لمتجه pHluorin-plexinA1 المستخدم في هذه التجارب في الشكل 1B. - إضافة 10 ميكرولتر من كاشف العدوى (أو الكمية المناسبة من الكاشف المستخدم). دوامة على الفور.
- احتضان 10 دقيقة في RT.
- إضافة 200 ميكرولتر من خليط الكاشف/ الحمض النووي إلى الخلايا.
- حرك اللوحة برفق لتحقيق إعادة تقسيم المزيج ووضع الخلايا مرة أخرى إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
- إعداد 200 ميكرولتر NaCl 150 mM وإضافة 3 ميكروغرام DNA أي مستقبلات ترميز المتجهات الموسومة بالهلوورين. دوامة بلطف وتدور لفترة وجيزة.
- اليوم الثالث. إزالة متوسطة transfection واستبداله 2 مل من DMEM كاملة جديدة.
- اليوم الرابع إجراء تصوير حي للخلايا من الخلايا المصابة COS7 pHluorin-plexinA1:
- إعداد اثنين من aliquots من متوسطة كاملة DMEM وضبط درجة الحموضة إلى 3.5 و 9.5، على التوالي.
ملاحظة: بالنسبة إلى لوحة واحدة مقاس 35 مم، يلزم 1.5 مل من كل محلول لإجراء التجربة. - إزالة الخلية المتوسطة واستبدالها 1 مل من DMEM كاملة متوسطة الحموضة 7.4.
- إعداد حقنة 5 مل مع نوع مناسب من الأنابيب من أجل حقن مكونات مختلفة مباشرة في وسط ثقافة الخلية دون فتح غرفة المجهر.
- استخدم وحدة تسمح بصيانة جو عمل رطب 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
ملاحظة: هناك نهج بديل لاستخدامغرفة ثاني أكسيد الكربون هو استخدام وسيطة ذات تخزين مؤقت HEPES (عادة في نطاق 10-25 mM وفقا لنوع الخلية). - ضع الخلايا في الحجرة وضبط الأنابيب والمحقنة.
ملاحظة: يجب أن يكون المجهر متساويا قبل البدء في تجنب الانجراف الميكانيكي أثناء التسجيل. - افتح برنامج التصوير وحدد برنامج الاستحواذ متعدد الأبعاد.
- العثور على خلايا COS7 المصابة مع الهدف 40X ووضع علامة في البرنامج لكل واحد منهم.
- تكوين مكدس Z من أجل الحصول على عمق 15 ميكرومتر (يمكن أن يتغير التركيز عند إضافة وسائط في اللوحة).
- إعداد التعريض الضوئي لمرشح GFP والمرحلة.
- تكوين توقيت الاستحواذ.
ملاحظة: للتجربة بأكملها مع 5 مجالات الاهتمام، واقتناء كل 20 ثانية لمدة 10 دقيقة ينبغي أن تكون كافية. - ابدأ عملية الاستحواذ واضبط 5 صور تحكم في درجة الحموضة DMEM 7.4 متوسطة.
- وقفة الاستحواذ، وحقن 1.25 مل من درجة الحموضة 3.5 DMEM كاملة لتحقيق درجة الحموضة من 5.5 في وسط الثقافة، بمناسبة الحدث في البرنامج واستئناف الاستحواذ على 5 نقاط زمنية أخرى.
ملاحظة: يجب أن تختفي الفلورسينس الخضراء تدريجيا. - وقفة اقتناء، وحقن 1.2 مل من درجة الحموضة 9.5 DMEM كاملة لتحقيق درجة الحموضة 7.4 في وسط الثقافة، بمناسبة الحدث في البرنامج واستئناف الاستحواذ على 5 نقاط زمنية أخرى.
ملاحظة: يجب أن يظهر الفلورسينس الأخضر مرة أخرى في غشاء البلازما. - تحليل الصور.
ويبين الشكل 2 الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها باستخدام بروتوكول من هذا القبيل مع بناء pHluorin-plexinA1.
- إعداد اثنين من aliquots من متوسطة كاملة DMEM وضبط درجة الحموضة إلى 3.5 و 9.5، على التوالي.
3. في أوفو الكهربائية من pHluorin-plexinA1 بناء
- التعامل مع البيض قبل الكهرومporation:
- تخزين البيض المخصب في الثلاجة في 14 درجة مئوية حتى أسبوع واحد قبل الحضانة.
- احتضان البويضات عند 38.5 درجة مئوية (101.3 درجة فهرنهايت) في حاضنة ذات رطوبة مشبعة لمدة 50-52 ساعة حتى تصل الأجنة إلى المرحلة HH1412.
ملاحظة: يجب وضع البويضات أفقيا أثناء الحضانة بحيث يتم وضع الجنين بشكل صحيح للكهرومporation ، العائمة على الجزء العلوي من الصفار. HH14 المرحلة مناسبة للحصول على التعبير عن البلازميدات في الخلايا العصبية المتمايزة في الحبل الشوكي وفي العقدة الجذر الظهري مع معدل البقاء على قيد الحياة المناسبة.
- الأجنة الكهربائية8-10:
- إعداد الكهرومبورات:
- إعداد البلازميدات الحمض النووي خالية من السموم الداخلية مع تركيز متفوقة على 2 ميكروغرام / ميكرولتر، لتكون قادرة على تمييعه كما التركيز المطلوب.
- سحب ما يكفي من الشعيرات الدموية الزجاجية لحقن حلول الحمض النووي المختلفة.
- إعداد برنامج تلفزيوني معقم (-Ca2+؛ -Mg2+) - 100 U/ml البنسلين/الستربتومايسين والاعتدال عند 38.5 درجة مئوية.
- تعقيم غطاء محرك السيارة، مقص منحني والمملقط الدقيق.
- التحكم في تباعد القطب الكهربائي.
ملاحظة: يتم استخدام مسافة 4 مم بين الأقطاب الكهربائية بشكل عام.
- نافذة البيض13 (الشكل 3A):
- استخدام مقص منحني لثقب قذيفة على الجانب الحاد من البيض.
- إزالة 2 مل من الألبومين باستخدام إبرة 0.9 ملم × 25 ملم وحقنة 5 مل. توجيه الإبرة عموديا من أجل تجنب إتلاف كيس صفار.
- تغطية الجزء العلوي من البيض مع الشريط للحفاظ على سلامة قذيفة.
- باستخدام مقص منحني، اخترق قذيفة في منتصف الشريط لتحقيق المساواة في الضغط عند إزالة 2 مل من الألبومين من البيض. ثم، قطع نافذة كبيرة بما يكفي لتصور الجنين وتكون قادرة على العمل على ذلك.
- إضافة ~ 2 مل عقيمة برنامج تلفزيوني دافئ (-Ca2+؛ -Mg2+) - 100 U/ml البنسلين / streptomycin لتجنب جفاف الجنين وجعله أكثر سهولة للمتلاعب.
- حقن الحمض النووي و electroporate الجنين
- تمييع البلازميد في برنامج تلفزيوني (-Ca2+; -Mg2+) إلى تركيز بين 0.5-2 ميكروغرام / ميكرول وإضافة صبغة خضراء سريعة للوصول إلى تركيز نهائي 0.025٪. قم بتحميل مزيج الحمض النووي في الشعرية. ينصح باستخدام حاقن.
ملاحظة: تحقق من أن مقاومة الشعرية ليست كبيرة جدا (مما يعني أنه قد تكون هناك صعوبات عند حقن الأجنة) ولا صغيرة جدا (مما يعني أن الشعرية يمكن أن تكون كبيرة جدا ويمكن أن تلحق الضرر بالجنين). أيضا، تركيز الأحماض النووية أعلى من 2 ميكروغرام / ميكرولتر قد يسبب آثار غير محددة ويحتاج إلى السيطرة عليها. - ثقب كيس الصفار والإنبوب العصبي في الجانب caudal مع الشعيرات الدموية المحملة. أدخل الأنبوب العصبي بزاوية ضحلة وملء التجويف من الذيل إلى الرأس بمزيج الحمض النووي(الشكل 3B).
ملاحظة: يسمح اللون الأخضر السريع بالتحكم في دقة الحقن. - بسرعة وضع أقطاب البلاتين 4 ملم على جانبي الأنبوب العصبي في المستوى الذي ترغب في electroporate وتطبيق 3 نبضات في 31 V لمدة 50 msec مع فترات 500 msec (الشكل 3C).
ملاحظة: تجنب وضع الأقطاب الكهربائية على القلب أو على الأوعية الجنينية الإضافية الكبيرة لتجنب إتلاف الجنين النامي. يجب أن تتشكل الفقاعات على الأقطاب الكهربائية. - مع الإبرة، وإزالة 2 مل من الألبومين لتقليل مستوى في قذيفة.
- ختم النافذة والجانب حادة بإحكام مع الشريط.
- ضع البيض مرة أخرى عند 38.5 درجة مئوية في الحاضنة حتى تصل إلى المرحلة المطلوبة.
- تمييع البلازميد في برنامج تلفزيوني (-Ca2+; -Mg2+) إلى تركيز بين 0.5-2 ميكروغرام / ميكرول وإضافة صبغة خضراء سريعة للوصول إلى تركيز نهائي 0.025٪. قم بتحميل مزيج الحمض النووي في الشعرية. ينصح باستخدام حاقن.
- إعداد الكهرومبورات:
4. تضمين الأجنة والتبريد
- 48 ساعة بعد الكهرومporation، حصاد الأجنة الكهربائية بعناية (مرحلة HH24). قطع الشريط ونصف من غشاء المشيمية. لمنع الأجنة من الغرق في صفار، وضع مصفاة تحت الجنين وقطع النصف الثاني من غشاء chorioallantoid.
- نقل الجنين إلى طبق تشريح مليئة الجليد البارد PBS.
- تحقق من كفاءة الكهرومporation من خلال البحث عن الفلورسينس في الأنبوب العصبي مع مجهر ستيريو مضان.
ملاحظة: قد يساعد الكهروضوئية من بلازميد التحكم ترميز RFP لتصور المنطقة electroporated. - تشريح الأجنة باستخدام ميكروسكالبيل من أجل تحديد المنطقة الكهربية من الحبل الشوكي.
- نقل الأجنة تشريح إلى لوحة 24 جيدا وإصلاح في درجة الحموضة 7.4٪ بارافورمالديهايد (PFA) - الفوسفات العازلة المالحة (PBS)، O / N في 4 درجة مئوية.
ملاحظة: خطوة التثبيت أمر بالغ الأهمية للسماح بتثبيت pHluorin في تشكيل "العيش" ، وبالتالي لتكون قادرة على استخدام pHluorin في الأنسجة الثابتة / permeabilized. على الرغم من أن التثبيت يبطئ التغيير المعتمد على الرقم الهيدروجيني بشكل كبير في الفلورسينس ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار أن التغيرات التوافقية / البروتونات لا تزال تحدث بعد التثبيت. وهكذا، يجب تنفيذ البروتوكول التالي (تضمين و cryosections و المراقبة) في غضون 3 أيام بعد خطوة التثبيت، مع كافة المخازن المؤقتة في 7 pH. إذا لم يكن التثبيت مطلوبا ، يوصى بإجراء مراقبة على أقسام الأنسجة الحية. - إزالة 4٪ PFA وغسل الأجنة في pH 7.4 PBS.
- احتضان الأجنة في برنامج تلفزيوني-15٪ السكروز والحفاظ على 4 درجة مئوية حتى تغرق الأجنة.
- احتضان الأجنة الثابتة في درجة الحموضة 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية حتى يتم تضمين الأجنة تماما.
- وضع قوالب تضمين على الجليد وإضافة 400 ميكروغرام من درجة الحموضة 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز لتحقيق قاعدة صلبة 2 ملم.
- يستنشق الجنين المضمن بطرف مقطوع ووضع الجنين على قاعدة الجيلاتين الصلبة.
- تغطية مع pH 7.4 7.5٪ الجيلاتين- 15٪ السكروز ووضع الجنين مع ملقط قبل الجيلاتين يقوي.
- مرة واحدة الجيلاتين الصلبة، وإعداد -40 درجة مئوية حمام ايزوبروبانول (استخدام الثلج الجاف أو النيتروجين السائل) وتجميد كتلة الجيلاتين لمدة 5 دقائق.
- إبقاء الكتل المجمدة عند -80 درجة مئوية.
- ضع الكتلة المجمدة عند -20 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
- إزالة القالب وإصلاح كتلة على تشاك مع متوسط غليكول البولي ايثيلين.
- مرة واحدة يتم إصلاح كتلة بإحكام، ووضع تشاك في نظام cryostat.
ملاحظة: استخدم الشرائح المغلفة لتجنب فقدان الأنسجة أثناء التلطيخ. - إجراء عمليات بكاء تسلسلية (عادة ما يتم إجراء عمليات 20 ميكرومترا من عمليات التبريد).
- دع عمليات التبريد تجف لمدة 15 دقيقة في RT.
ملاحظة: يجب حماية عمليات الشفط بالتبريد من التعرض للضوء غير الضروري لتجنب تبييض مضان GFP.
5. التحليل المجهري للكريوزات
- إعادة ترطيب cryosections في رقم الحموضة 7.4 برنامج تلفزيوني في RT لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن أن تكون ملطخة نواة مع Hoechst. - استخدام محلول Hoechst 0.5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني واحتضان cryosections لمدة 15 دقيقة.
- شطف الشرائح 3x مع pH 7.4 برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- انتقل إلى تصاعد الانزلاق. يمكن استخدام محلول تركيب الكحول البولي فينيل 7.4 (أو أكثر أساسية) الذي يصلب O / N: ضع غطاء الغطاء بعناية لتجنب تكوين فقاعات الهواء بين الشريحة والأغطية.
- السماح للتصاعد المتوسطة تصلب O / N في 4 درجة مئوية في الظلام.
- استخدم مجهرا كونفوكوكال مقلوبا لتصور بروتين الاندماج pHluorin-plexinA1 بدقة: قم بإجراء z-stack عند الثقب الأمثل والدقة البصرية واستخدم عدسات 20X (NA 0.75) أو 40X (NA 1.3).
ملاحظة: يمكن اكتشاف الهولورين بنفس المعلمات المستخدمة للكشف عن GFP(أي ذروة الانبعاثات عند 509 نانومتر). يتم تعريف إعدادات الإثارة الموجية ومرشح الكشف بشكل مثالي من خلال برنامج التصوير. يتم الكشف عن Hoechst بين 425-460 نانومتر (الإثارة في 405 نانومتر), يتم الكشف عن GFP أو pHluorin بين 485-545 نانومتر (الإثارة في 473 نانومتر) ويتم الكشف عن RFP بين 575-675 نانومتر (الإثارة في 559 نانومتر).
وتظهر الصور التمثيلية لpHluorin-plexinA1 والتعبير eGFP في الحبل الشوكي الجنين فرخ في الشكل 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 أ. مخطط خصائص الفلورية pHluorin-plexinA1 في سياق خلوي. PHluorin غير فلوورسينت في المقصورات داخل الخلايا حيث درجة الحموضة حمضية (<6) مثل في الحويولات الاتجار أو في الاندوسومات والفلورسنت عندما تتعرض لوسط خارج الخلية حيث درجة الحموضة محايدة. وهذا يسمح تصور فقط تجمع سطح الخلية من مستقبلات pHluorin-plexinA1. باء - ال 20 في المائ خريطة لموقع استنساخ pBK-CMV-pHluorin-plexinA1. تم استخدام مستقبلات الماوس plexinA1 التعبير عن ناقلات كعمود فقري. تم تصميم هذا المتجه لتحقيق كفاءة VSV الموسومة مستقبلات الإدراج في غشاء البلازما. للقيام بذلك، تم دمج إشارة الببتيد semaphorin 3a وموقع الانقسام المنبع من مستقبلات VSV الموسومة اجتثاث من الببتيد إشارة الخاصة بها وموقع الانقسام. بواسطة PCR، تم إدراج تسلسل pHluorin في إطار بين VSV-tag وتسلسل ترميز PlxnA1 باستخدام مواقع تقييد NruI/Kpn2I. ويشار إلى مواقع تقييد واحدة لتصميم استراتيجية استنساخ مستقبلات أخرى. تم تكييف المخطط من البرامج المعلوماتية الحيوية.
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم توصيف pHluorin-plexinA1 بناء خصائص الفلورسنت تعتمد على الحموضة في خلايا COS7. أ. خلايا COS7 المصابة مع بناء pHluorin-plexinA1 حيث لوحظ مع المجهر confocal السماح تصور pHluorin-plexinA1 مضان في غشاء البلازما. شريط المقياس: 20 ميكرومترا. ب. خلايا COS7 المصابة ببنية pHluorin-plexinA1 حيث لوحظ من خلال التصوير الحي في درجة الحموضة 7.4 وسط الثقافة، بعد تحمض متوسط الثقافة تصل إلى درجة الحموضة 5.5 وبعد استعادة درجة الحموضة 7.4 في وسط الثقافة. يشار إلى الخطوط العريضة للخلية بخط متقطع على اكتساب الفلورية GFP. شريط المقياس: 10 ميكرومتر.
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن في إجراء الكهرومporation أوفو. أ. 1. إزالة الألبومين من الجانب الأكبر من قذيفة. 2. نافذة قذيفة البيض للوصول إلى الجنين. باء - ال 20 في المائ الحمض النووي / حقن مزيج الأخضر السريع في الأنبوب العصبي. جيم - الدوائر التي لا يمكن أن وضع أقطاب كهربائية على جانبي الأنبوب العصبي، وتجنب القلب والأوعية الكبيرة، والكهرومporation الجنين فرخ.
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال التحليل المجهري للأنابيب العصبية الفرخ cryosections بعد pHluorin-plexinA1 الكهربائية. تظهر مقارنة بين نمط التعبير eGFP (الألواح العلوية) ونمط التعبير pHluorin-plexinA1 (الألواح السفلية) في الحبل الشوكي للفرخ المكهرب. تظهر الألواح الموسعة الفلورة المضخمة ل pHluorin-plexinA1 (a') بالمقارنة مع التعريب الفرعي المنتشر ل eGFP (أ). وفيما يتعلق plexinA1، لوحة الموسع يظهر أن يتم إثراء هذه المستقبلات على وجه التحديد في غشاء البلازما عند عبور لوحة الكلمة (ب') وهو ليس هو الحال بالنسبة لeGFP التي يتم التعبير عنها على قدم المساواة قبل وبعد عبور لوحة الكلمة (ب). أشرطة المقياس: 100 ميكرومتر في الثانية: لوحة أرضية؛ قبل: قبل عبور; آخر: ما بعد عبور. انقر هنا لعرض صورة أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لمتابعة ديناميكيات مستقبلات توجيه المحور في كل من زراعة الخلايا وفي السياق التنموي للنخاع الشوكي للجنين الفرخ.
لتصميم بروتين دي نوفو pHluorin الموسومة، هناك نقطتين تحتاج إلى النظر فيما يتعلق باستراتيجية الاستنساخ. أولا، يجب أن تتعرض علامة pHluorin لتجويف الانسوم الحمضي، وبالتالي، إلى المقصورة خارج الخلية من أجل تصور تجمع مستقبلات غشاء البلازما. وهكذا، فإن تحديد المواقع الصحيح لتسلسل pHluorin فيما يتعلق بتسلسل المستقبلات يعتمد بشكل مباشر على نوع المستقبلات المدروسة(أي ما إذا كان الجزء N-terminal أو C-terminal من المستقبلات يتعرض للمقصورة خارج الخلية). ثانيا، كما هو موضح في البروتوكول، ينبغي النظر في موقف تسلسل pHluorin بالنسبة للببتيد إشارة لتجنب الانقسام اللاحقة بين pHluorin ومستقبلات الفائدة.
ويرتبط الحد من هذه التقنية إلى الاتجار في المستقبلات بعد تفعيلها في غشاء البلازما. عادة، يتم استيعاب المستقبلات والتقدم من خلال مسار الغدد الصماء تتألف من مقصورات متميزة وظيفيا وجسديا15. بسبب مضخات البروتون التي يحركها ATP ، تحافظ الاندوسومات على درجة حموضة حمضية حوالي 6 في الاندوسومات المبكرة ، حوالي 5 في أواخر الاندوسومات ، أقل من 5 في الليسوسومات ، ولكن فقط حوالي 6.4 في إعادة تدوير الإنوسومات أو 7.0 في الكهروسومات التي تسمح بالفلورسينس في هاتين المقصورتين الإنضوائية. يمكن حل هذه المشكلة في المختبر باستخدام مضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) المجهر16. القيد الثاني الملازم لهذه التقنية هو أنه نظرا لحجمها الكبير نسبيا ، يمكن أن تعطل علامة pHluorin نشاط المستقبلات ، اعتمادا على موقع إدراج العلامة.
على الرغم من مزاياه، لم يتم استخدام pHluorin على نطاق واسع لدراسة ديناميات وتنظيم بروتينات الأغشية أثناء الملاحة المحورية. وقد استخدمت الأعمال المنوية pHluorin لدراسة الديناميات spatio الزمنية من exocytosis خلال مخروط النمو تحول في المختبر17. في هذا البروتوكول، نوضح كيف يمكن استخدام pHluorin للتحقيق في توزيع المستقبلات في غشاء البلازما من المحاور في الجسم الحي. وبما أن ال بهلورينات مشفرة وراثيا، فهي مناسبة بشكل خاص لتحليل الجسم الحي. على الرغم من أننا نصف استخدامه في الفرخ بعد في ovo electroporation ، يمكن استخدام هذا النهج في أنواع أخرى. في الواقع يعمل electroporation بكفاءة في نماذج حيوانية مختلفة18،19. وبالإضافة إلى ذلك، وقد استخدمت بنجاح pHluorins في C. elegans، Drosophila،أو الحيوانات المعدلة وراثيا الماوس20-23.
منذ التغير تعتمد على الحموضة يحدث في نطاق ميلي ثانية، يتم تكييفها بشكل خاص pHluorins للتصوير الحي6،24. وقد تم استخدام الاندماج PHluorin، على سبيل المثال، لرصد ديناميات في الجسم الحي من exocytosis synaptobrevin في الخلايا العصبية الحسية الشمية من الفئران المعدلةوراثيا 23. في التصوير الحي في الجسم الحي من الانصهار pHluorin يحمل وعدا كبيرا والمجاهر confocal تكييفها للتصوير الحي (التصوير السريع والسمية الضوئية منخفضة) تصبح أكثر كفاءة ويمكن الوصول إليها25. ويمكن أيضا أن يقترن التصوير الحي في الجسم الحي مع الانتعاش مضان بعد photobleaching (FRAP) بحيث يمكن تقييم exocytosis أو نشر أكثر مباشرة26.
استخدام المتغيرات الحساسة الأخرى لhh وتركيباتها يمكن أن تزيد من توسيع نطاق التطبيقات. ويمكن رصد التوزيع الديناميكي للمستقبلات في العضيات المختلفة باستخدام pHluorin نسبة أن يتغير مضان وفقا لHH من المقصورة6,27. وبالمثل، فإن إضافة بروتين فلوري غير حساس لhH إلى بروتين غشاء تنصهر إلى pHluorin الكسوف يمكن أن توفر رؤى هامة في الاتجار بها28. وبالإضافة إلى ذلك، فإن استنساخ pHtomato29 مؤخرا سيمكن من رصد مستقبلين في وقت واحد. وهذا يمكن أن يوفر رؤى هامة في تشكيل مجمعات مستقبلات. منذ pHluorin يمكن أيضا أن تستخدم لوضع علامة العظة التوجيه30, التصوير المزدوج للليجاند, ومستقبلاته هو أيضا ممكن.
في هذا البروتوكول، معدل التعبير عن بروتين الانصهار هو نقطة حرجة ويعتمد بشكل خاص على قوة المروج، واستقرار بروتين الانصهار وكمية البلازميد المستخدمة لتدوين الخلايا. في الواقع، عندما يتم التعبير عنها بشكل مفرط، قد تتراكم بروتينات الاندماج في الحويصلات داخل الخلايا وقد تظهر خلفية فلورية. وهكذا، قد تكون هناك عدة تحسينات ضرورية لتحقيق تصور دقيق للبروتين المنصهر pHluorin على سطح الخلية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام بروتين حمأورين الانصهار في الأنسجة الثابتة يتطلب عناية خاصة أثناء وبعد التثبيت. في الواقع، قد يكون تثبيت تشكيلات بروتينات الانصهار pHluorin مؤقتة فقط. وبالتالي، يجب أن تبقى الحموضة فوق 7 لمنع فقدان إشارة pHluorin. وعلاوة على ذلك، يتعين إجراء الملاحظات بعد التثبيت بوقت قصير. قد يحتاج التوقيت الأمثل إلى تعريف من قبل المستخدمين وفقا لبروتين الاندماج الخاص بهم pHluorin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ونشكر هوميرا نوابي وفريدريك موريت وإيزابيل سانياس على مساعدتهم. ويدعم هذا العمل من قبل CNRS، جمعية فرانسيز contre ليه Myopathies (AFM)، ANR YADDLE، لابيكس DevWeCan، لابكس القشرة، ERC يودا إلى V.C. يتم دعم C.D-B و A.J من قبل La Ligue contre le cancer وزمالات Labex DevWeCan على التوالي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
