Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Bruk av pHluorin for å vurdere dynamikken i Axon-veiledningsreseptorer i cellekultur og i chick-embryoet

doi: 10.3791/50883 Published: January 12, 2014
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver her bruken av en pH-sensitiv grønn fluorescerende proteinvariant, pHluorin, for å studere den romlige-temporale dynamikken i axonveiledningsreseptorer som smugler på celleoverflaten. Den pHluorin-taggede reseptoren uttrykkes både i cellekultur og in vivo, ved hjelp av elektroporasjon av kyllingembryoet.

Abstract

Under utviklingen spiller axonveiledningsreseptorer en avgjørende rolle i å regulere axonenes følsomhet for både attraktive og frastøtende signaler. Faktisk er aktivering av veiledningsreseptorene det første trinnet i signalmekanismene som tillater axonspisser, vekstkjeglene, å svare på ligandene. Som sådan er moduleringen av deres tilgjengelighet på celleoverflaten en av mekanismene som deltar i å sette vekstkjeglefølsomheten. Vi beskriver her en metode for å visualisere den romlige-temporale celleoverflatedynamikken til en axonveiledningsreseptor både in vitro og in vivo i den utviklende kyllingens ryggmarg. Vi benyttet oss av den pH-avhengige fluorescensegenskapen til en grønn fluorescerende proteinvariant (GFP) for å spesifikt oppdage brøkdelen av axonveiledningsreseptoren som er adressert til plasmamembranen. Vi beskriver først in vitro-valideringen av slike pH-avhengige konstruksjoner, og vi beskriver ytterligere deres bruk in vivo, i kyllingens spinal akkord, for å vurdere den romlige-temporale dynamikken i axonveiledningsreseptoren av interesse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under navigasjonen integrerer axoner flere miljøsignaler som veileder dem mot målet. Disse signalene aktiverer veiledningsreseptorer på overflaten av axonterminaler, vekstkjeglene, som igjen starter en passende signalvei. Dermed er den tidsmessige og romlige reguleringen av celleoverflatefordelingen av reseptorene avgjørende for å sette følsomheten til vekstkjeglen1. I denne sammenhengen er midtlinjekryssing av kommissurale axoner en utmerket modell for å undersøke reguleringen av reseptorcelleoverflatenivåer. I den utviklende ryggmargen tiltrekkes kommissurale aksoner i utgangspunktet mot ventral gulvplate der de krysser midtlinjen. Etter kryssing mister de sin respons på gulvplatens tiltrekningsmidler og får respons på gulvplateavstøtende midler slik at de kan gå ut av gulvplaten og navigere mot deres endelige destinasjon i den kontralaterale siden av nervesystemet2,3. Regulering av reseptortilgjengelighet på vekstkjegleoverflaten er en av mekanismene som ligger til grunn for overgangen av respons til midtlinjesignaler4,5. Dermed er selektiv overvåking av reseptorene som er tilstede ved plasmamembranen av vekstkjegler av største betydning. Vi beskriver her en metode basert på den pH-avhengige fluorescensegenskapen til en grønn fluorescerende protein (GFP) -variant for å visualisere axonveiledningsreseptorene som er adressert til plasmamembranin vitro og in vivo, i den utviklende kyllingens ryggmarg.

Rothman og kolleger konstruert av punktmutasjoner pH-sensitive varianter av GFP inkludert ecliptic pHluorin6. Ecliptic pHluorin har egenskapen til å være ikke-påvirkende når den utsettes for sur pH (<6), samtidig som den er fluorescerende ved nøytral pH. Dette gjør det mulig å skille nonfluorescent reseptorer lokalisert i intracellulære sure rom (dvs. endosomer, trafficking vesicles) fra fluorescerende reseptorer innlemmet i plasmamembranen og dermed utsatt for den ekstracellulære nøytrale pH7. Vi benyttet oss av dette for å overvåke plasmamembranlokaliseringen av plexinA1, en axonveiledningsreseptor som formidler vekstkjegleresponsen til midtlinjeavstøtende semaphorin 3B5 (figur 1A). Vi beskriver her in vitro karakterisering av en pHluorin-plexinA1 konstruksjon, sammen med i ovo elektroporasjon8-10 av denne konstruksjonen i den utviklende kylling ryggmargen etterfulgt av mikroskopisk analyse av kryoseksjoner som gjør det mulig å følge axon veiledning reseptor dynamikken in vivo med både romlige og temporale oppløsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Kloning strategi for å merke PlexinA1 reseptor med pHluorin

  1. Velg en passende uttrykksvektor som ryggrad (f.eks. musreseptoren plexinA1 som uttrykker vektor, en slags gave av Dr. Andreas Puschel11).
    Merk: Denne plexinA1-vektoren ble utviklet for å oppnå effektiv HA- eller VSV-merket reseptorinnsetting i plasmamembranen.
  2. Forsterke av PCR den ekliptiske pHluorin-kodesekvensen ved hjelp av tilstrekkelig plasmid som mal (f.eks. pHluorin-merket GABA A-reseptor, en slags gave av Dr. Jacob2). Om nødvendig, legg til et begrensningssted i 5'enden av primeren for å lette kloningstrinnet i ryggraden.
  3. Sett inn pHluorin-sekvensen i rammen mellom signalpeptidet og reseptorkodingssekvensen ved hjelp av begrensningsområder (f.eks.
    Merk: Fordi signalpeptidet som sikrer riktig målretting av reseptorene er spaltet, bør pHluorin plasseres etter det. Dette garanterer anerkjennelse av signalpeptidet og forhindrer spalting av pHluorin fra reseptoren av interesse.
  4. Sekvenser konstruksjonene som er oppnådd for å sikre at ingen mutasjon ble introdusert av PCR.

2. Karakterisering av pHluorin-taggede reseptorin vitro i COS7-celler

Fusjonsproteinets evne til å nå plasmamembranen og dets reversible tap av fluorescens når pH senkes, kan bekreftes ved hjelp av følgende prosedyre.

  1. Dag 1. Plate 1,5 x 105 COS7 celler i en glassbunn 35 mm tallerken i 2 ml komplett Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM - 10% Fetal Bovine Serum - 1 mM natrium pyruvat - 25 U/ml penicillin/stretomycin - 2,5 μg/ml Amphotericin B - pH 7.4).
  2. Dag 2. Transfekter celler:
    Merk: Celler skal være 70-80% sammenfallende.
    1. Forbered 200 μl NaCl 150 mM og tilsett 3 μg DNA dvs. Virvel forsiktig og spinn ned en kort stund.
      Merk: Et kart over pHluorin-plexinA1-vektoren som brukes i disse eksperimentene, vises i figur 1B.
    2. Tilsett 10 μl transfeksjonsreagens (eller riktig mengde reagens som brukes). Virvel umiddelbart.
    3. Inkuber 10 min på RT.
    4. Tilsett 200 μl transfeksjonsreagens/DNA-blanding til cellene.
    5. Beveg platen forsiktig for å oppnå partisjonering av blandingen og plasser cellene tilbake til 37 °C inkubatoren.
  3. Dag 3. Fjern transfeksjonsmediet og erstatt det med 2 ml fersk komplett DMEM.
  4. Dag 4. Utfør levende celleavbildning av COS7 pHluorin-plexinA1 transfekterte celler:
    1. Forbered to aliquots av DMEM komplett medium og juster pH til henholdsvis 3,5 og til 9,5.
      Merk: For en 35 mm plate er det nødvendig med 1,5 ml av hver oppløsning for å utføre eksperimentet.
    2. Fjern cellemediet og erstatt det med 1 ml DMEM komplett medium pH 7,4.
    3. Forbered en 5 ml sprøyte med en passende type rør for å injisere ulike komponenter direkte i cellekulturmediet uten å åpne mikroskopkammeret.
    4. Bruk en modul som tillater vedlikehold av en 37 °C, 5 %fuktig arbeidsatmosfære.
      Merk: En alternativ tilnærming til bruk av et CO2-kammer er å bruke HEPES-bufret medium (vanligvis i området 10-25 mM i henhold til celletypen).
    5. Plasser cellene i kammeret og juster slangen og sprøyten.
      Merk: Mikroskopet bør likevektes før du begynner å unngå mekanisk drift under innspillingen.
    6. Åpne bildebehandlingsprogramvaren og velg det flerdimensjonale anskaffelsesprogrammet.
    7. Finn transfected COS7 celler med 40X mål og markere posisjon i programvaren for hver av dem.
    8. Konfigurer Z-stakken for å få et dybdeanskaffelse på 15 μm (fokuset kan endres når du legger til medier i platen).
    9. Definer eksponering for GFP-filteret og fasen.
    10. Konfigurer tidsberegning for anskaffelse.
      Merk: For hele eksperimentet med 5 interessefelt, bør anskaffelse hvert 20.
    11. Start anskaffelsen og ta 5 kontrollbilder i DMEM pH 7.4 medium.
    12. Sett oppkjøpet på pause, injiser 1,25 ml pH 3,5 fullstendig DMEM for å oppnå en pH på 5,5 i kulturmediet, merk hendelsen i programvaren og fortsett oppkjøpet for 5 flere tidspunkter.
      Merk: Grønn fluorescens bør gradvis forsvinne.
    13. Sett oppkjøpet på pause, injiser 1,2 ml pH 9,5 fullstendig DMEM for å oppnå en pH 7,4 i kulturmediet, merk hendelsen i programvaren og fortsett oppkjøpet for 5 flere tidspunkter.
      Merk: Grønn fluorescens skal dukke opp igjen ved plasmamembranen.
    14. Analyser bilder.
      Figur 2 viser representative bilder som er oppnådd med en slik protokoll med pHluorin-plexinA1-konstruksjonen.

3. I ovo-elektroporasjon av pHluorin-plexinA1-konstruksjon

  1. Håndtering av egg før elektroporasjon:
    1. Oppbevar befruktede egg i kjøleskap ved 14 °C opp til en uke før inkubasjon.
    2. Inkuber egg ved 38,5 °C i en inkubator med mettet fuktighet i 50-52 timer til embryoene når stadium HH1412.
      Merk: Eggene må plasseres horisontalt under inkubasjon slik at embryoet er riktig plassert for elektroporasjon, som flyter på toppen av eggeplommen. HH14 stadium er egnet til å oppnå uttrykk for plasmidene i differensierte nevroner i ryggmargen og i dorsalrot ganglion med en passende overlevelsesrate.
  2. Elektroporat embryoer8-10:
    1. Forbered elektroporasjon:
      1. Forbered endotoksinfrie DNA-plasmider med en konsentrasjon som er overlegen 2 μg/μl, for å kunne fortynne det som ønsket konsentrasjon.
      2. Trekk nok glasskapillærer til å injisere de forskjellige DNA-løsningene.
      3. Forbered steril PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicillin/streptomycin og likevekt ved 38,5 °C.
      4. Steriliser hetten, buet saks og fine tang.
      5. Kontroller elektrodeavstanden.
        Merk: Et 4 mm mellomrom mellom elektrodene brukes vanligvis.
    2. Vindu egget13 (Figur 3A):
      1. Bruk buet saks for å pierce skallet på den stumpe siden av egget.
      2. Fjern 2 ml albumen med en 0,9 mm x 25 mm kanyle og en 5 ml sprøyte. Plasser nålen vertikalt for å unngå å skade eggeplommesekken.
      3. Dekk toppen av egget med tape for å opprettholde skallets integritet.
      4. Bruk buet saks, pierce skallet i midten av båndet for å utjevne trykket når du fjerner 2 ml albumen fra egget. Klipp deretter et vindu som er stort nok til å visualisere embryoet og kunne jobbe med det.
      5. Tilsett ~2 ml steril varm PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicillin/streptomycin for å unngå dehydrering av embryoet og gjøre det mer tilgjengelig for manipulatoren.
    3. Injiser DNA og elektroporate embryoet
      1. Fortynn plasmid i PBS (-Ca2+; -Mg2+) til en konsentrasjon mellom 0,5-2 μg/μl og tilsett Raskt grønt fargestoff for å nå en endelig konsentrasjon på 0,025%. Last DNA-blandingen i en kapillær. Bruk av en injektor anbefales.
        Merk: Kontroller at kapillærmotstanden verken er for stor (noe som betyr at det kan være vanskeligheter ved injeksjon av embryoer) eller for liten (noe som betyr at kapillæren kan være for stor og kan skade embryoet). Også konsentrasjonen av nukleinsyrer høyere enn 2 μg / μl kan forårsake uspesifiserte effekter og må kontrolleres.
      2. Punkter eggeplommesekken og nevralrøret på kaudalsiden med den lastede kapillæren. Gå inn i nevralrøret med en grunn vinkel og fyll lumen fra halen til hodet med DNA-blandingen (Figur 3B).
        Merk: Rask grønn gjør det mulig å kontrollere nøyaktigheten av injeksjonen.
      3. Plasser raskt de 4 mm platinaelektrodene på hver side av nevralrøret på det nivået du ønsker å elektroporate og påfør 3 pulser ved 31 V i 50 ms med 500 msek intervaller (Figur 3C).
        Merk: Unngå å plassere elektrodene på hjertet eller på store ekstra embryonale kar for å unngå å skade det utviklende embryoet. Bobler skal dannes på elektrodene.
      4. Med nålen, fjern 2 ml albumen for å redusere nivået i skallet.
      5. Forsegle vinduet og den stumpe siden hermetisk med tape.
      6. Sett eggene tilbake på 38,5 °C i inkubatoren til de når ønsket stadium.

4. Embryoer Innbygging og kryoosectioning

  1. 48 timer etter elektroporasjon, forsiktig høst elektroporated embryoer (HH24 stadium). Klipp båndet og halvparten av chorioallantoidmembranen. For å forhindre at embryoer synker ned i eggeplommen, plasser en kolander under embryoet og kutt andre halvdel av chorioallantoidmembranen.
  2. Overfør embryoet til en disseksjonsfat fylt med iskald PBS.
  3. Kontroller elektroporasjonseffektiviteten ved å se etter fluorescens i nevralrøret med et fluorescenssterekroskop.
    Merk: Coelectroporation av en kontroll plasmid koding RFP kan bidra til å visualisere det elektroporated området.
  4. Disseker embryoer ved hjelp av et mikroskalpel for å velge det elektroporerte området i ryggmargen.
  5. Overfør dissekerte embryoer til en 24-brønns plate og fest i pH 7,4 4% Paraformaldehyd (PFA) - Fosfatbuffer saltvann (PBS), O / N ved 4 °C.
    Merk: Fikseringstrinn er avgjørende for å tillate stabilisering av pHluorin i sin "levende" konformasjon og dermed kunne bruke pHluorin i fast / permeabilisert vev. Selv om fiksering bremser drastisk pH-avhengig endring av fluorescens, må man ta hensyn til at konformasjons- / protonasjonsendringer fortsatt kan oppstå etter fiksering. Dermed må følgende protokoll (innebygging, kryoser og observasjon) utføres innen 3 dager etter fikseringstrinnet, med alle buffere ved pH 7. Hvis fiksering ikke er nødvendig, anbefales det å utføre observasjon på levende vevsseksjoner.
  6. Fjern 4 % PFA og vask embryoer i pH 7,4 PBS.
  7. Inkuber embryoer i PBS-15% sukrose og hold ved 4 °C til embryoene synker.
  8. Inkuber faste embryoer i pH 7,4 7,5% gelatin- 15% sukrose i 45 min ved 37 °C, slik at embryoer er helt innebygd.
  9. Legg innstøpningsformer på is og tilsett 400 μl pH 7,4 7,5% gelatin- 15% sukrose for å oppnå en solid 2 mm base.
  10. Aspirer det innebygde embryoet med en kuttet spiss og legg embryoet på den faste gelatinbasen.
  11. Dekk med pH 7,4 7,5% gelatin- 15% sukrose og plasser embryoet med tang før gelatinet størkner.
  12. Når gelatinet er fast, lag et -40 °C isopropanolbad (bruk tørris eller flytende nitrogen) og frys gelatinblokken i 5 minutter.
  13. Hold de frosne blokkene ved -80 °C.
  14. Plasser den frosne blokken ved -20 °C i 1 time.
  15. Fjern formen og fest blokken på en chuck med et polyetylenglykolmedium.
  16. Når blokken er tett festet, plasser chucken i kryostatsystemet.
    Merk: Bruk belagte lysbilder for å unngå vevstap under farging.
  17. Utfør serielle kryoser (20 μm kryoser utføres vanligvis).
  18. La kryosksjonene tørke i 15 min på RT.
    Merk: kryoser bør beskyttes mot unødvendig lyseksponering for å unngå bleking av GFP-fluorescensen.

5. Mikroskopisk analyse av kryoser

  1. Rehydrer kryoser i pH 7.4 PBS ved RT i 10 min.
    Merk: Om nødvendig kan kjerner farges med Hoechst.
  2. Bruk en 0,5 μg/ml Hoechst-oppløsning i PBS og inkuber kryonser i 15 minutter.
  3. Skyll lysbildene 3x med pH 7,4 PBS i 5 min.
  4. Fortsett med å skyve monteringen. En pH 7.4 (eller mer grunnleggende) polyvinylalkoholmonteringsløsning som herdes O/ N kan brukes: Plasser dekslene forsiktig for å unngå dannelse av luftbobler mellom lysbildet og dekslene.
  5. La monteringsmediet herde O/N ved 4 °C i mørket.
  6. Bruk et invertert konfokalt mikroskop for å visualisere pHluorin-plexinA1-fusjonsproteinet nøyaktig: Utfør z-stack ved optimal pinhole og optisk oppløsning og bruk en 20X (NA 0,75) eller 40X (NA 1.3) linser.
    Merk: pHluorin kan påvises med de samme parametrene som brukes til å oppdage GFP (dvs. utslippstopp ved 509 nm). Bølgelengdeeksitasjons- og deteksjonsfilterinnstillinger er optimalt definert av bildebehandlingsprogramvaren. Hoechst oppdages mellom 425-460 nm (eksitasjon er på 405 nm), GFP eller pHluorin oppdages mellom 485-545 nm (eksitasjon er på 473 nm) og RFP oppdages mellom 575-675 nm (eksitasjon er på 559 nm).

Representative bilder av pHluorin-plexinA1 og eGFP-uttrykk i kyllingembryoens ryggmarg er vist i figur 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figure 1
Figur 1. A. Ordningen med pHluorin-plexinA1 fluorescensegenskapene i en cellulær kontekst. PHluorin er ikke-påvirkende i intracellulære rom der pH er sur (<6) som i menneskehandel vesicules eller i endosomer og er fluorescerende når den utsettes for det ekstracellulære mediet der pH er nøytral. Dette gjør det mulig å visualisere bare celleoverflatebassenget til pHluorin-plexinA1-reseptoren. B. Kart over pBK-CMV-pHluorin-plexinA1 kloningssted. Mus reseptor plexinA1 uttrykker vektor ble brukt som ryggrad. Denne vektoren ble konstruert for å oppnå effektiv VSV-merket reseptorinnsetting ved plasmamembranen. For å gjøre dette ble semaphorin 3a peptidsignal og spaltingssted smeltet oppstrøms for den VSV-taggede reseptoren som ble ablated fra sitt eget signalpeptid og spaltingssted. Av PCR ble pHluorin-sekvens satt inn i rammen mellom VSV-tag og PlxnA1-kodesekvenser ved hjelp av NruI/ Kpn2I-begrensningsområder. Enkeltbegrensningssteder er indikert for å designe kloningsstrategi for andre reseptorer. Ordningen er tilpasset fra bioinformatisk programvare.

Figure 2
Figur 2. Karakterisering av pHluorin-plexinA1 konstruerer pH-avhengige fluorescerende egenskaper i COS7-celler. A. COS7-celler transfektert med pHluorin-plexinA1-konstruksjonen der de observeres med et konfokalt mikroskop som tillater visualisering av pHluorin-plexinA1 fluorescens ved plasmamembranen. Skalastang: 20 μM. B. COS7-celler transfektert med pHluorin-plexinA1-konstruksjonen der de observeres gjennom levende avbildning i et pH 7.4-kulturmedium, etter forsuring av kulturmediet opp til pH 5,5 og etter restaurering av pH 7,4 i kulturmediet. Celleomriss er indikert med en stiplet linje på GFP fluorescensoppkjøp. Skalalinje: 10 μM. Klikk her for å se større bilde.

Figure 3
Figur 3. I ovo elektroporasjon prosedyre. A. 1. Fjerning av albumen fra den største siden av skallet. 2. Vindu eggeskallet for å få tilgang til embryoet. B. DNA/Fast Green mix injeksjon i nevralrøret. C. Plassere elektroder på hver side av nevralrøret, unngå hjertet og store kar, og elektroporasjon av kyllingembryoet.

Figure 4
Figur 4. Mikroskopisk analyse av nevrale tube cryosections etter pHluorin-plexinA1 elektroporasjon. En sammenligning mellom eGFP (øvre paneler) og pHluorin-plexinA1 (nedre paneler) uttrykksmønster i den elektroporerte kyllingens ryggmarg vises. Forstørrede paneler viser membranøs fluorescens av pHluorin-plexinA1 (a') sammenlignet med diffus subcellulær lokalisering av eGFP (a). Når det gjelder plexinA1, viser forstørret panel at denne reseptoren er spesielt beriket ved plasmamembranen ved gulvplatekryssing (b') som ikke er tilfelle for eGFP som er like uttrykt før og etter gulvplatekryssing (b). Skalastenger: 100 μM. FP: Gulvplate; Pre: Precrossing; Innlegg: Postcrossing. Klikk her for å vise større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne protokollen gir en trinnvis prosedyre for å følge dynamikken i en axonveiledningsreseptor både i cellekultur og i utviklingskonteksten til kyllingembryoens ryggmarg.

For å designe et de novo pHluorin-merket protein, må to punkter vurderes angående kloningsstrategien. For det første bør pHluorin-taggen eksponeres for lumen av de sure endosomene, og følgelig til det ekstracellulære rommet for å visualisere plasmamembranreseptorbassenget. Dermed er riktig posisjonering av pHluorin-sekvensen angående reseptorsekvensen direkte avhengig av hvilken type reseptor som studeres (dvs. om N-terminalen eller C-terminaldelen av reseptoren er utsatt for det ekstracellulære rommet). For det andre, som forklart i protokollen, bør posisjonen til pHluorin-sekvensen i forhold til signalpeptid vurderes for å unngå etterfølgende spalting mellom pHluorin og reseptoren av interesse.

En begrensning av teknikken er knyttet til smugling av reseptorene etter aktivering ved plasmamembranen. Vanligvis internaliseres reseptorer og utvikler seg gjennom den endokytiske banen som består av funksjonelt og fysisk forskjellige rom15. På grunn av ATP-drevne protonpumper opprettholder endosomer en sur pH rundt 6 i tidlige endosomer, rundt 5 i sene endosomer, lavere enn 5 i lysosomer, men bare rundt 6,4 i resirkulering endosomer eller 7,0 i caveosomer som tillater fluorescens i disse to endosomiske rommene. Dette problemet kan løses in vitro ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi16. En annen begrensning som er knyttet til denne teknikken er at pHluorin-taggen på grunn av sin relativt store størrelse kan forstyrre reseptoraktiviteten, avhengig av kodens innsettingssted.

Til tross for fordelene har pHluorin ikke blitt mye brukt til å studere dynamikken og reguleringen av membranproteiner under axonnavigasjon. Seminale verk har brukt pHluorin til å studere den romlige-temporale dynamikken i eksocytose under vekstkjegle som blir in vitro17. I den nåværende protokollen illustrerer vi hvordan pHluorin kan brukes til å undersøke fordelingen av reseptorer ved plasmamembranen til axoner in vivo. Siden pHluorins er genetisk kodet, er de spesielt egnet til in vivo-analyse. Selv om vi beskriver bruken i kylling etter i ovo-elektroporasjon, kan denne tilnærmingen brukes i andre arter. Faktisk fungerer elektroporasjon effektivt i ulike dyremodeller18,19. I tillegg har pHluorins blitt brukt i C. elegans, Drosophilaeller mus transgene dyr20-23.

Siden pH-avhengig endring skjer i millisekundområdet, er pHluorinene spesielt tilpasset levende bildebehandling6,24. PHluorin fusjon har for eksempel blitt brukt til å overvåke in vivo dynamikken i synaptobrevin exocytosis i olfaktoriske sensoriske nevroner fra transgene mus23. In vivo live bildebehandling av pHluorin fusjoner holder betydelig løfte som konfekt mikroskoper tilpasset levende bildebehandling (rask bildebehandling og lav fototoksisitet) blir mer effektiv og tilgjengelig25. Levende avbildning in vivo kan også kombineres med fluorescens utvinning etter fotobleaching (FRAP) slik at eksocytose eller diffusjon kan vurderes mer direkte26.

Bruken av andre pH-sensitive varianter og deres kombinasjoner kan ytterligere utvide bruksområdet. Den dynamiske fordelingen av reseptoren i forskjellige organeller kan overvåkes ved hjelp av ratiometric pHluorin som endrer fluorescens i henhold til pH i rommet6,27. På samme måte kan tilsetningen av et pH-ufølsomt fluorescerende protein til et membranprotein smeltet til et ekliptisk pHluorin gi viktig innsikt imenneskehandelen 28. I tillegg vil den nylige kloningen av pHtomato29 muliggjøre overvåking av to reseptorer samtidig. Dette kan gi viktig innsikt i dannelsen av reseptorkomplekser. Siden pHluorin også kan brukes til å merke veiledningssignaler30, er dobbel bildebehandling av liganden, og reseptoren også mulig.

I denne protokollen er uttrykkshastigheten til fusjonsproteinet et kritisk punkt og avhenger spesielt av styrken til promotoren, stabiliteten til fusjonsproteinet og mengden plasmid som brukes til å transfekte cellene. Faktisk, når de er overekspresserte, kan fusjonsproteiner akkumuleres i intracellulære vesikler, og en fluorescerende bakgrunn kan oppstå. Dermed kan flere optimaliseringer være nødvendige for å oppnå en presis visualisering av pHluorin smeltet protein på celleoverflaten. Videre krever bruk av pHluorin-fusjonsprotein i fast vev spesiell forsiktighet under og etter fiksering. Faktisk kan stabiliseringen av konformasjonene av pHluorin fusjonsproteiner bare være midlertidig. Dermed må pH holdes over 7 for å forhindre tap av pHluorin-signalet. Videre må observasjoner utføres kort tid etter fiksering. Optimal timing må kanskje defineres av brukere i henhold til deres spesielle pHluorin fusjonsprotein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Homaira Nawabi, Frederic Moret og Isabelle Sanyas for deres hjelp. Dette arbeidet støttes av CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA til V.C.; C.D-B og A.J støttes av henholdsvis la Ligue contre le cancer og Labex DevWeCan fellowships.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COS7 cells ATCC CRL-1651
DMEM GlutaMAX GIBCO 61965-026
Sodium pyruvate GIBCO 11360-039
Amphotericin B Sigma A2942
Fetal bovine serum GIBCO 10270-106
Penicillin/Streptomycin GIBCO 15140-122
Exgen500 reagent Euromedex Fermentas ET0250
PBS -Ca2+ -Mg2+ GIBCO 14190-094
Fast green dye Sigma F7252
32% Paraformaldehyde aqueous solution Electron Microscopy 15714-S Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution
Gelatin from cold water fish skin Sigma G7041
Sucrose Sigma S0389
Cryomount Histolab 00890
Hoechst 34580 Invitrogen H21486
Mowiol 4-88 Fluka 81381
Consumables
Bottom-glass 35 mm dish MatTek P35G-1.5-14-C
5 ml Syringe Terumo SS-05S
Needles 0.9 mm x 25 mm Terumo NN-2025R
Capillaries CML PP230PO capillaries are stretched manually in the flame
Superfrost Plus Slides Thermo Scientific 4951PLUS
Material
Curved scissors FST 129-10
Microscalpel FST 10316-14
Forceps FST Dumont #5 REF#11254
Equipment/software
Time lapse microscope Zeiss Observer 1
Temp module S PECON for Zeiss
CO2 module S PECON for Zeiss
Metamorph software Metamorph
Eggs incubator Sanyo MIR154
Electroporator apparatus Nepa Gene CO., LTD CUY21
Electrodes Nepa Gene CO., LTD CUY611P7-4 4 mm platinum electrodes
Fluorescence stereomicroscope LEICA MZ10F
Cryostat MICROM HM550
Confocal microscope Olympus FV1000, X81
Fluoview software Olympus
CLC Main Workbench software CLC Bio

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
  2. Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
  3. Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
  4. Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
  5. Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
  6. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  7. Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
  8. Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
  9. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
  10. Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
  11. Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
  12. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
  14. Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
  15. Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
  16. Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
  17. Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
  18. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
  19. Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7, (107), (2007).
  20. Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
  21. Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
  22. Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
  23. Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
  24. Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
  25. Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
  26. Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
  27. Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
  28. Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
  29. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
  30. de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
Bruk av pHluorin for å vurdere dynamikken i Axon-veiledningsreseptorer i cellekultur og i chick-embryoet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Delloye-Bourgeois, C., Jacquier, A., Falk, J., Castellani, V. Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (83), e50883, doi:10.3791/50883 (2014).More

Delloye-Bourgeois, C., Jacquier, A., Falk, J., Castellani, V. Use of pHluorin to Assess the Dynamics of Axon Guidance Receptors in Cell Culture and in the Chick Embryo. J. Vis. Exp. (83), e50883, doi:10.3791/50883 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter