Summary
We beschrijven hier het gebruik van een pH-gevoelige groene fluorescerende eiwitvariant, pHluorine, om de spatio-temporele dynamiek van axongeleidingsreceptoren aan het celoppervlak te bestuderen. De pHluorine-gelabelde receptor wordt zowel in celkweek als in vivouitgedrukt met behulp van elektroporatie van het kuikenembryo.
Abstract
Tijdens de ontwikkeling spelen axongeleidingsreceptoren een cruciale rol bij het reguleren van axongevoeligheid voor zowel aantrekkelijke als afstotende signalen. Inderdaad, activering van de geleidingsreceptoren is de eerste stap van de signaleringsmechanismen waardoor axonpunten, de groeikegels, kunnen reageren op de liganden. Als zodanig is de modulatie van hun beschikbaarheid aan het celoppervlak een van de mechanismen die deelnemen aan het instellen van de gevoeligheid van de groeikegel. We beschrijven hier een methode om de spatio-temporale celoppervlakdynamiek van een axongeleidingsreceptor zowel in vitro als in vivo in het zich ontwikkelende kuikenmerg precies te visualiseren. We hebben gebruik gemaakt van de pH-afhankelijke fluorescentie-eigenschap van een groene fluorescerende eiwit (GFP) variant om specifiek de fractie van de axongeleidingsreceptor te detecteren die is gericht op het plasmamembraan. We beschrijven eerst de in vitro validatie van dergelijke pH-afhankelijke constructies en we beschrijven verder het gebruik ervan in vivo, in het kuiken ruggenmergakkoord, om de spatio-temporele dynamiek van de axongeleidingsreceptor van belang te beoordelen.
Introduction
Tijdens hun navigatie integreren axonen meerdere omgevingssignalen die hen naar hun doel leiden. Deze signalen activeren geleidingsreceptoren aan het oppervlak van axonterminals, de groeikegels, die op hun beurt een geschikte signaleringsroute initiëren. De temporele en ruimtelijke regulatie van de celoppervlakverdeling van de receptoren is dus van cruciaal belang om de gevoeligheid van de groeikegel in te stellen1. In deze context is midline crossing door commissural axons een uitstekend model om de regulering van receptorceloppervlakniveaus te onderzoeken. In het zich ontwikkelende ruggenmerg worden commissural axonen in eerste instantie aangetrokken naar de ventrale vloerplaat waar ze de middellijn oversteken. Na het oversteken verliezen ze hun reactievermogen op de vloerplaattrekkers en krijgen ze reactie op vloerplaatafstotende middelen, zodat ze de vloerplaat kunnen verlaten en naar hun eindbestemming kunnen navigeren in de contralaterale kant van het zenuwstelsel2,3. Regulering van de beschikbaarheid van receptoren aan het groeikegeloppervlak is een van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de omschakeling van responsiviteit naar middellijnsignalen4,5. Selectieve monitoring van de receptoren die aanwezig zijn op het plasmamembraan van groeikegels is dus van het grootste belang. We beschrijven hier een methode gebaseerd op de pH-afhankelijke fluorescentie-eigenschap van een groene fluorescerende eiwit (GFP) variant om specifiek de axongeleidingsreceptoren te visualiseren die in vitro en in vivozijn gericht op het plasmamembraan , in het zich ontwikkelende kuikenmerg.
Rothman en collega's ontworpen door puntmutaties pH-gevoelige varianten van GFP met inbegrip van de ecliptica pHluorine6. Ecliptica pHluorine heeft de eigenschap nietfluorescent te zijn bij blootstelling aan zure pH (<6), terwijl het fluorescerend is bij een neutrale pH. Hierdoor kunnen niet-fluorescerende receptoren die gelokaliseerd zijn in intracellulaire zure compartimenten(d.w.z. endosomen, blaasjes) worden onderscheiden van fluorescerende receptoren die in het plasmamembraan zijn opgenomen en dus worden blootgesteld aan de extracellulaire neutrale pH7. We hebben hiervan gebruik gemaakt om de plasmamembraanlokalisatie van plexineA1 te controleren, een axongeleidingsreceptor die de reactie van de groeikegel op de middellijnafstotende semaphorine 3B5 (figuur 1A)bemiddelt. We beschrijven hier de in vitro karakterisering van een pHluorine-plexineA1 constructie, samen met in ovo elektroporatie8-10 van deze constructie in het zich ontwikkelende kuiken ruggenmerg gevolgd door de microscopische analyse van cryosecties die het mogelijk maken om de axongeleidingsreceptordynamiek in vivo te volgen met zowel ruimtelijke als temporele resoluties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloonstrategie om PlexinA1-receptor te taggen met pHluorine
- Kies een geschikte expressievector als ruggengraat(bijv. de muisreceptorplexineA1 die vector uitdrukt, een soort geschenk van Dr. Andreas Puschel11).
Opmerking: Deze plexinA1-vector is ontworpen om een efficiënte HA- of VSV-gelabelde receptorinvoeging in het plasmamembraan te bereiken. - Versterken door PCR de ecliptica pHluorin coderingssequentie met behulp van de adequate plasmide als sjabloon(bijv. pHluorin-gelabeld GABA A receptor, een soort geschenk van Dr. Jacob2). Voeg indien nodig een beperkingsplaats toe aan het 5'-uiteinde van de primer om de kloonstap in de ruggengraat te vergemakkelijken.
- Plaats de pHluorine-sequentie in het frame tussen het signaalpeptide en de receptorcoderingssequentie met behulp van restrictiesites (bijv. NruI/Kpn2I-beperkingssites zoals beschreven in figuur 1B).
Opmerking: Omdat het signaalpeptide dat zorgt voor de juiste targeting van de receptoren is gespleten, moet de pHluorine er achteraan worden geplaatst. Dit rechtvaardigt de herkenning van het signaalpeptide en voorkomt splitsing van de pHluorine van de receptor van belang. - Volg de verkregen constructies om ervoor te zorgen dat pcr geen mutatie heeft geïntroduceerd.
2. Karakterisering van pHluorine-gelabelde receptor in vitro in COS7-cellen
Het vermogen van het fusie-eiwit om het plasmamembraan te bereiken en het omkeerbare verlies van fluorescentie als de pH wordt verlaagd, kan worden bevestigd met behulp van de volgende procedure.
- Dag 1. Plaat 1,5 x 105 COS7 cellen in een glazen schaal van 35 mm in 2 ml complete Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM - 10% Foetale Runderserum - 1 mM natriumpy pyruvaat - 25 U/ml penicilline/stretomycine - 2,5 μg/ml Amphotericine B - pH 7,4).
- Dag 2. Transfecte cellen:
Opmerking: Cellen moeten 70-80% samenvloeien.- Bereid 200 μl NaCl 150 mM voor en voeg 3 μg DNA toe, d.w.z. de vectorcodering met pHluorine-gelabelde receptor. Draai voorzichtig en draai kort naar beneden.
Opmerking: Figuur 1Bgeeft een kaart weer van de pHluorine-plexineA1-vector die bij deze experimenten wordt gebruikt. - Voeg 10 μl transfectiereagens (of de juiste hoeveelheid van het gebruikte reagens) toe. Vortex onmiddellijk.
- Incubeer 10 min bij RT.
- Voeg 200 μl van de transfectiereagens/DNA-mix toe aan de cellen.
- Beweeg de plaat voorzichtig om de mix opnieuw te delen en plaats de cellen terug naar de incubator van 37 °C.
- Bereid 200 μl NaCl 150 mM voor en voeg 3 μg DNA toe, d.w.z. de vectorcodering met pHluorine-gelabelde receptor. Draai voorzichtig en draai kort naar beneden.
- Dag 3. Verwijder het transfectiemedium en vervang het door 2 ml verse volledige DMEM.
- Dag 4. Voer live celbeeldvorming uit van COS7 pHluorine-plexineA1 doorschijnende cellen:
- Bereid twee aliquots DMEM compleet medium voor en stel de pH in op respectievelijk 3,5 en 9,5.
Opmerking: Voor één plaat van 35 mm is 1,5 ml van elke oplossing nodig om het experiment uit te voeren. - Verwijder het celmedium en vervang het door 1 ml DMEM complete medium pH 7.4.
- Bereid een spuit van 5 ml voor met een geschikt type slang om verschillende componenten rechtstreeks in het celkweekmedium te injecteren zonder de microscoopkamer te openen.
- Gebruik een module die onderhoud van een vochtige werksfeer van 37 °C en 5% CO2 mogelijk maakt.
Opmerking: Een alternatieve benadering van het gebruik van een CO2-kamer is het gebruik van HEPES-gebufferd medium (meestal in het bereik van 10-25 mM afhankelijk van het celtype). - Plaats cellen in de kamer en pas de slang en de spuit aan.
Opmerking: De microscoop moet worden geëquilibreerd voordat u begint met het vermijden van mechanische drift tijdens de opname. - Open de imaging-software en selecteer het multidimensionale acquisitieprogramma.
- Zoek getransfecteerde COS7-cellen met de 40X-doelstelling en markeer de positie in de software voor elk van hen.
- Configureer de Z-stack om een diepteverwerving van 15 μm te hebben (de focus kan veranderen bij het toevoegen van media in de plaat).
- Stel belichting in voor het GFP-filter en de fase.
- Acquisitietiming configureren.
Opmerking: Voor het hele experiment met 5 interessegebieden moet acquisitie elke 20 sec gedurende 10 minuten voldoende zijn. - Start de acquisitie en maak 5 besturingsbeelden in DMEM pH 7.4 medium.
- Pauzeer acquisitie, injecteer 1,25 ml pH 3,5 volledige DMEM om een pH van 5,5 in het cultuurmedium te bereiken, markeer de gebeurtenis in de software en hervat de acquisitie voor nog eens 5 tijdpunten.
Opmerking: Groene fluorescentie moet geleidelijk verdwijnen. - Pauzeer acquisitie, injecteer 1,2 ml pH 9,5 volledige DMEM om een pH 7,4 in het cultuurmedium te bereiken, markeer de gebeurtenis in de software en hervat de acquisitie voor nog eens 5 tijdpunten.
Opmerking: Groene fluorescentie moet opnieuw verschijnen op het plasmamembraan. - Analyseer afbeeldingen.
Figuur 2 toont representatieve beelden verkregen met een dergelijk protocol met de pHluorine-plexineA1 constructie.
- Bereid twee aliquots DMEM compleet medium voor en stel de pH in op respectievelijk 3,5 en 9,5.
3. In ovo Elektroporatie van pHluorin-plexineA1 Construeren
- Behandeling van eieren vóór elektroporatie:
- Bewaar bevruchte eieren in een koelkast bij 14 °C tot een week voor incubatie.
- Incubeer eieren bij 38,5 °C in een incubator met verzadigde vochtigheid gedurende 50-52 uur totdat de embryo's stadium HH1412bereiken.
Opmerking: De eieren moeten tijdens de incubatie horizontaal worden geplaatst, zodat het embryo goed is gepositioneerd voor elektroporatie en op de bovenkant van de dooier drijft. HH14 stadium is geschikt om expressie van de plasmiden te verkrijgen in gedifferentieerde neuronen in het ruggenmerg en in het dorsale wortel ganglion met een geschikte overlevingskans.
- Elektroporaatembryo's8-10:
- Elektroporatie voorbereiden:
- Bereid endotoxinevrije DNA-plasmiden met een concentratie die hoger is dan 2 μg/μl, om het als de gewenste concentratie te kunnen verdunnen.
- Trek voldoende glazen haarvaten om de verschillende DNA-oplossingen te injecteren.
- Bereid steriel PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicilline/streptomycine en equilibreren bij 38,5 °C.
- Steriliseer de kap, gebogen schaar en fijne tang.
- Controleer de elektrodeafstand.
Opmerking: Er wordt over het algemeen een ruimte van 4 mm tussen de elektroden gebruikt.
- Venster het ei13 (Figuur 3A):
- Gebruik een gebogen schaar om de schaal aan de stompe kant van het ei te doorboren.
- Verwijder 2 ml albumen met een naald van 0,9 mm x 25 mm en een spuit van 5 ml. Oriënteer de naald verticaal om beschadiging van de dooierzak te voorkomen.
- Bedek de bovenkant van het ei met tape om de integriteit van de schaal te behouden.
- Prik met een gebogen schaar de schaal in het midden van de tape om de druk te egaliseren bij het verwijderen van 2 ml albumen uit het ei. Snijd vervolgens een venster dat groot genoeg is om het embryo te visualiseren en eraan te kunnen werken.
- Voeg ~2 ml steriel warm PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicilline/streptomycine toe om uitdroging van het embryo te voorkomen en toegankelijker te maken voor de manipulator.
- Injecteer DNA en elektroporate het embryo
- Verdun plasmide in PBS (-Ca2+; -Mg2+) tot een concentratie tussen 0,5-2 μg/μl en voeg snelgroene kleurstof toe om een uiteindelijke concentratie van 0,025% te bereiken. Laad de DNA-mix in een capillair. Het gebruik van een injector wordt aanbevolen.
Opmerking: Controleer of de capillaire weerstand niet te groot is (wat betekent dat er problemen kunnen zijn bij het injecteren van embryo's) of te klein (wat betekent dat het capillair te groot kan zijn en het embryo kan beschadigen). Ook kan de concentratie nucleïnezuren hoger dan 2 μg/μl aspecifieke effecten veroorzaken en moet worden gecontroleerd. - Prik de dooierzak en de neurale buis aan de staartzijde door met het geladen capillair. Voer de neurale buis in met een ondiepe hoek en vul het lumen van de staart naar het hoofd met de DNA-mix(figuur 3B).
Opmerking: Snel groen maakt het mogelijk om de nauwkeurigheid van de injectie te regelen. - Plaats de 4 mm platina elektroden snel aan weerszijden van de neurale buis op het niveau dat u wilt elektroporate en breng 3 pulsen aan bij 31 V gedurende 50 msec met intervallen van 500 msec (Figuur 3C).
Opmerking: Plaats de elektroden niet op het hart of op grote extra embryonale vaten om beschadiging van het zich ontwikkelende embryo te voorkomen. Er moeten bellen op de elektroden ontstaan. - Verwijder met de naald 2 ml albumen om het niveau in de schaal te verlagen.
- Sluit het raam en de stompe kant hermetisch af met tape.
- Leg de eieren terug op 38,5 °C in de broedmachine tot ze de gewenste fase bereiken.
- Verdun plasmide in PBS (-Ca2+; -Mg2+) tot een concentratie tussen 0,5-2 μg/μl en voeg snelgroene kleurstof toe om een uiteindelijke concentratie van 0,025% te bereiken. Laad de DNA-mix in een capillair. Het gebruik van een injector wordt aanbevolen.
- Elektroporatie voorbereiden:
4. Embryo's inbedding en cryosectioning
- 48 uur na elektroporatie, oogst zorgvuldig geëlektropoeerde embryo's (HH24-stadium). Snijd de tape en de helft van het chorioallantoïde membraan door. Om te voorkomen dat embryo's in de dooier zinken, plaatst u een vergiet onder het embryo en snijdt u de tweede helft van het chorioallantoïde membraan door.
- Breng het embryo over in een dissectieschaal gevuld met ijskoud PBS.
- Controleer de elektroporatie-efficiëntie door te zoeken naar fluorescentie in de neurale buis met een fluorescentie-stereomicroscoop.
Opmerking : Co-elektrotroporatie van een controleplasmide die codeert voor de RFP kan helpen om het geëlektroporated gebied te visualiseren. - Ontleed embryo's met behulp van een microscalpel om het geëlektroposte gebied van het ruggenmerg te selecteren.
- Breng ontlede embryo's over op een 24-putplaat en fixeer in pH 7,4 4% Paraformaldehyde (PFA) - Fosfaatbufferzoutlijn (PBS), O/N bij 4 °C.
Opmerking: Fixatiestap is cruciaal om de stabilisatie van pHluorine in zijn "levende" conformatie mogelijk te maken en zo pHluorine in vast/gepermeabiliseerd weefsel te kunnen gebruiken. Hoewel fixatie de pH-afhankelijke verandering van fluorescentie drastisch vertraagt, moet men er rekening mee houden dat conformationele/protonatieveranderingen nog steeds kunnen optreden na fixatie. Het volgende protocol (inbedding, cryosecties en observatie) moet dus binnen 3 dagen na de fixatiestap worden uitgevoerd, waarbij alle buffers bij pH 7. Als fixatie niet nodig is, wordt observatie op levende weefselsecties aanbevolen. - Verwijder 4% PFA en was embryo's in pH 7,4 PBS.
- Incubeer embryo's in PBS-15% sacharose en houd ze bij 4 °C totdat de embryo's zinken.
- Incubeer vaste embryo's in pH 7,4 7,5% gelatine- 15% sacharose gedurende 45 minuten bij 37 °C, zodat embryo's volledig zijn ingebed.
- Plaats inbeddingsvormen op ijs en voeg 400 μl pH 7,4 7,5% gelatine toe- 15% sacharose om een stevige basis van 2 mm te bereiken.
- Aspireer het ingebedde embryo met een snijpunt en plaats het embryo op de vaste gelatinebasis.
- Dek af met pH 7,4 7,5% gelatine- 15% sacharose en plaats het embryo met een tang voordat de gelatine stolt.
- Zodra de gelatine vast is, bereidt u een isopropanolbad van -40 °C (gebruik droogijs of vloeibare stikstof) en vriest u het gelatineblok gedurende 5 minuten in.
- Houd de bevroren blokken op -80 °C.
- Plaats het bevroren blok gedurende 1 uur op -20 °C.
- Verwijder de mal en bevestig het blok op een boorkop met een polyethyleenglycolmedium.
- Zodra het blok goed vastzit, plaatst u de boorkop in het cryostaatsysteem.
Opmerking: Gebruik gecoate dia's om weefselverlies tijdens het kleuren te voorkomen. - Voer seriële cryosecties uit (20 μm cryosecties worden meestal uitgevoerd).
- Laat de cryosecties 15 minuten drogen bij RT.
Opmerking: cryosecties moeten worden beschermd tegen onnodige blootstelling aan licht om bleken van de GFP-fluorescentie te voorkomen.
5. Microscopische analyse van cryosecties
- Rehydrateer cryosecties in pH 7,4 PBS bij RT gedurende 10 min.
Opmerking: Indien nodig kunnen kernen worden gekleurd met Hoechst. - Gebruik een Hoechst-oplossing van 0,5 μg/ml in PBS en incubeer cryosecties gedurende 15 minuten.
- Spoel de dia's 3x af met een pH van 7,4 PBS gedurende 5 min.
- Ga verder met de montage van de schuif. Een pH 7.4 (of meer basis) polyvinylalcoholmontageoplossing die O/N uithardt, kan worden gebruikt: plaats de afdeklip zorgvuldig om de vorming van luchtbellen tussen de glijbaan en de afdeklip te voorkomen.
- Laat het montagemedium O/N uitharden bij 4 °C in het donker.
- Gebruik een omgekeerde confocale microscoop om het fusie-eiwit pHluorin-plexinA1 nauwkeurig te visualiseren: voer z-stack uit met de optimale pinhole en optische resolutie en gebruik een 20X (NA 0,75) of 40X (NA 1.3) lenzen.
Opmerking: pHluorine is detecteerbaar met dezelfde parameters die worden gebruikt om GFP(d.w.z. emissiepiek bij 509 nm) te detecteren. Golflengte excitatie en detectie filter instellingen worden optimaal gedefinieerd door de imaging software. Hoechst wordt gedetecteerd tussen 425-460 nm (excitatie is bij 405 nm), GFP of pHluorine wordt gedetecteerd tussen 485-545 nm (excitatie is bij 473 nm) en RFP wordt gedetecteerd tussen 575-675 nm (excitatie is bij 559 nm).
Representatieve afbeeldingen van pHluorine-plexineA1 en eGFP expressie in het ruggenmerg van het kuikenembryo zijn weergegeven in figuur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1. A. Schema van de pHluorine-plexineA1 fluorescentie-eigenschappen in een cellulaire context. PHluorine is nietfluorescent in intracellulaire compartimenten waar de pH zuur is (<6), zoals bij het verhandelen van vesicules of in endosomen en fluorescerend is wanneer het wordt blootgesteld aan het extracellulaire medium waar de pH neutraal is. Hierdoor kan alleen de celoppervlaktepool van de pHluorine-plexineA1-receptor worden gevisualiseerd. B. Kaart van de pBK-CMV-pHluorin-plexinA1 kloonsite. MuisreceptorplexineA1 die vector uitdrukt, werd gebruikt als ruggengraat. Deze vector is ontworpen om een efficiënte VSV-gelabelde receptorinvoeging op het plasmamembraan te bereiken. Om dit te doen, semaphorin 3a peptide signaal en decolleté site werden gesmolten stroomopwaarts van de VSV-gelabelde receptor ablated van zijn eigen signaal peptide en decolleté site. Door PCR werd pHluorine-sequentie ingevoegd in frame tussen VSV-tag en PlxnA1-coderingssequenties met behulp van NruI / Kpn2I-beperkingssites. Enkele beperkingsplaatsen zijn geïndiceerd voor het ontwerpen van de kloonstrategie van andere receptoren. Het schema is aangepast van bio-informatische software.
Figuur 2. Karakterisering van de pHluorine-plexineA1 construeren pH-afhankelijke fluorescerende eigenschappen in COS7-cellen. A. COS7-cellen getransfecteerd met de pHluorine-plexinA1 constructie waargenomen met een confocale microscoop waardoor visualisatie van pHluorine-plexineA1 fluorescentie op het plasmamembraan mogelijk is. Schaalbalk: 20 μM. B. COS7-cellen doorschijnend met de pHluorine-plexineA1-constructie waargenomen door levende beeldvorming in een pH 7,4-kweekmedium, na verzuring van het kweekmedium tot pH 5,5 en na herstel van pH 7,4 in het kweekmedium. Celcontouren worden aangegeven met een stippellijn op GFP-fluorescentieverwerving. Schaalbalk: 10 μM. Klik hier om grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. In ovo elektroporatie procedure. A. 1. Albumen verwijderen van de grootste kant van de schaal. 2. Venster maken van de eierschaal om toegang te krijgen tot het embryo. B. DNA/Fast Green mix injectie in de neurale buis. C. Het plaatsen van elektroden aan weerszijden van de neurale buis, het vermijden van het hart en grote vaten, en elektroporatie van het kuikenembryo.
Figuur 4. Microscopische analyse van kuiken neurale buis cryosecties na pHluorine-plexinA1 elektroporatie. Een vergelijking tussen eGFP (bovenste panelen) en pHluorine-plexineA1 (onderste panelen) expressiepatroon in het elektroporated kuiken ruggenmerg wordt getoond. Vergrote panelen tonen de vlieze fluorescentie van pHluorine-plexineA1 (a') in vergelijking met de diffuse subcellulaire lokalisatie van eGFP (a). Wat plexineA1 betreft, toont het vergrote paneel aan dat deze receptor specifiek is verrijkt op het plasmamembraan bij vloerplaatovergang (b'), wat niet het geval is voor eGFP dat gelijkelijk wordt uitgedrukt voor en na vloerplaatovergang (b). Schaalbalken: 100 μM. FP: Vloerplaat; Voor: Precrossing; Bericht: Postcrossing. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure om de dynamiek van een axongeleidingsreceptor te volgen, zowel in celkweek als in de ontwikkelingscontext van het ruggenmerg van het kuikenembryo.
Om een de novo pHluorine gelabeld eiwit te ontwerpen, moeten twee punten worden overwogen met betrekking tot de kloonstrategie. Ten eerste moet de pHluorine-tag worden blootgesteld aan het lumen van de zure endosomen en bijgevolg aan het extracellulaire compartiment om de plasmamembraanreceptorpool te visualiseren. De juiste positionering van de pHluorine-sequentie met betrekking tot de receptorsequentie is dus direct afhankelijk van het type receptor dat wordt bestudeerd(d.w.z. of de N-terminal of het C-terminale deel van de receptor wordt blootgesteld aan het extracellulaire compartiment). Ten tweede, zoals uitgelegd in het protocol, moet de positie van de pHluorine-sequentie ten opzichte van het signaalpeptide worden overwogen om latere splitsing tussen de pHluorine en de receptor van belang te voorkomen.
Een beperking van de techniek is gekoppeld aan de handel in de receptoren na hun activering op het plasmamembraan. Gewoonlijk worden receptoren geïnternaliseerd en vorderen ze door het endocytische pad dat bestaat uit functioneel en fysiek verschillendecompartimenten 15. Als gevolg van ATP-aangedreven protonpompen handhaven endosomen een zure pH rond 6 in vroege endosomen, ongeveer 5 bij late endosomen, lager dan 5 bij lysosomen, maar slechts rond 6,4 bij het recyclen van endosomen of 7,0 bij caveosomen die fluorescentie in deze twee endosoma's mogelijk maken. Dit probleem kan in vitro worden opgelost met behulp van totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) microscopie16. Een tweede beperking inherent aan deze techniek is dat, vanwege zijn relatief grote formaat, pHluorin tag de receptoractiviteit kan verstoren, afhankelijk van de site voor het invoegen van de tag.
Ondanks de voordelen is pHluorine niet veel gebruikt om de dynamiek en regulatie van membraaneiwitten tijdens axonnavigatie te bestuderen. Zaadfabrieken hebben pHluorine gebruikt om de spatio-temporele dynamiek van exocytose tijdens het draaien van groeikegels in vitrotebestuderen 17. In dit protocol illustreren we hoe pHluorine kan worden gebruikt om de verdeling van receptoren op het plasmamembraan van axonen in vivote onderzoeken . Aangezien pHluorines genetisch gecodeerd zijn, zijn ze bijzonder geschikt voor in vivo analyse. Hoewel we het gebruik ervan bij kuiken na in ovo-elektroporatie beschrijven, kan deze aanpak bij andere soorten worden gebruikt. Elektroporatie werkt inderdaad efficiënt in verschillende diermodellen18,19. Bovendien zijn pHluorins met succes gebruikt bij C. elegans, Drosophila, of muis transgene dieren20-23.
Aangezien pH-afhankelijke verandering optreedt in het millisecondebereik, zijn de pHluorines speciaal aangepast voor live beeldvorming6,24. PHluorinefusie is bijvoorbeeld gebruikt om de in vivo dynamiek van synaptobrevin exocytose in reukzintuigneuronen van transgene muizen te monitoren23. In vivo live beeldvorming van pHluorine fusies heeft een aanzienlijke belofte als confocale microscopen aangepast aan live beeldvorming (snelle beeldvorming en lage fototoxiciteit) efficiënter en toegankelijker worden25. Live beeldvorming in vivo kan ook worden gecombineerd met fluorescentieherstel na fotobleaching (FRAP), zodat exocytose of diffusie directer kan worden beoordeeld26.
Het gebruik van andere pH-gevoelige varianten en hun combinaties kan het scala aan toepassingen verder uitbreiden. De dynamische verdeling van de receptor in verschillende organellen kan worden gecontroleerd met behulp van ratiometrische pHluorine die de fluorescentie verandert volgens de pH van hetcompartiment 6,27. Evenzo kan de toevoeging van een pH-ongevoelig fluorescerend eiwit aan een membraaneiwit dat is gesmolten met een ecliptica pHluorine belangrijke inzichten verschaffen in de handelin 28. Bovendien zal het recente klonen van pHtomato29 het mogelijk maken om twee receptoren tegelijkertijd te monitoren. Dit kan belangrijke inzichten geven in de vorming van receptorcomplexen. Aangezien pHluorine ook kan worden gebruikt om geleidingssignalen30te taggen, is dubbele beeldvorming van de ligand en de receptor ervan ook haalbaar.
In dit protocol is de expressiesnelheid van het fusie-eiwit een kritiek punt en hangt vooral af van de sterkte van de promotor, de stabiliteit van het fusie-eiwit en de hoeveelheid plasmide die wordt gebruikt om de cellen te transfecteren. Inderdaad, wanneer overexpressie, fusie-eiwitten kunnen zich ophopen in intracellulaire blaasjes en een fluorescerende achtergrond kan verschijnen. Er kunnen dus verschillende optimalisaties nodig zijn om een nauwkeurige visualisatie van het met pHluorine gesmolten eiwit aan het celoppervlak te bereiken. Bovendien vereist het gebruik van pHluorine-fusion-eiwit in vast weefsel bijzondere zorg tijdens en na fixatie. De stabilisatie van de conformaties van pHluorine-fusie-eiwitten kan slechts tijdelijk zijn. De pH moet dus boven 7 worden gehouden om verlies van het pHluorine-signaal te voorkomen. Bovendien moeten de waarnemingen kort na de fixatie worden uitgevoerd. Optimale timing kan worden gedefinieerd door gebruikers op basis van hun specifieke pHluorine fusie-eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We danken Homaira Nawabi, Frederic Moret en Isabelle Sanyas voor hun hulp. Dit werk wordt ondersteund door CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B en A.J worden ondersteund door respectievelijk een La Ligue contre le cancer en Labex DevWeCan fellowships.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
