Summary
Wir beschreiben hier die Verwendung einer pH-empfindlichen grünen fluoreszierenden Proteinvariante, pHLuorin, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Beratungsrezeptorenhandels an der Zelloberfläche zu untersuchen. Der pHluorin-markierte Rezeptor wird sowohl in der Zellkultur als auch in vivomit Elektroporation des Kükenembryons exprimiert.
Abstract
Während der Entwicklung spielen Axon-Beratungsrezeptoren eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Empfindlichkeit der Axone sowohl gegenüber attraktiven als auch abstoßenden Hinweisen. Tatsächlich ist die Aktivierung der Leitrezeptoren der erste Schritt der Signalmechanismen, die es Axonspitzen, den Wachstumskegeln, ermöglichen, auf die Liganden zu reagieren. Daher ist die Modulation ihrer Verfügbarkeit an der Zelloberfläche einer der Mechanismen, die an der Einstellung der Wachstumskegelempfindlichkeit beteiligt sind. Wir beschreiben hier eine Methode zur präzisen Visualisierung der räumlich-zeitlichen Zelloberflächendynamik eines Axon-Führungsrezeptors sowohl in vitro als auch in vivo im sich entwickelnden Kükenrückenmark. Wir nutzten die pH-abhängige Fluoreszenzeigenschaft einer Grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP), um gezielt den Anteil des Axon-Führungsrezeptors zu detektieren, der an die Plasmamembran adressiert ist. Wir beschreiben zunächst die In-vitro-Validierung solcher pH-abhängigen Konstrukte und beschreiben deren Verwendung in vivo,im Küken-Rückenakkord, um die räumlich-zeitliche Dynamik des Axon-Leitrezeptors von Interesse zu bewerten.
Introduction
Während ihrer Navigation integrieren Axone mehrere Umwelthinweise, die sie zu ihrem Ziel führen. Diese Hinweise aktivieren Leitrezeptoren an der Oberfläche von Axonklemmen, den Wachstumskegeln, die wiederum einen geeigneten Signalweg initiieren. Daher ist die zeitliche und räumliche Regulation der Zelloberflächenverteilung der Rezeptoren entscheidend, um die Empfindlichkeit des Wachstumskegels1einzustellen. In diesem Zusammenhang ist die Mittellinienüberquerung durch kommissarische Axone ein ausgezeichnetes Modell, um die Regulierung der Oberflächenebenen von Rezeptorzellen zu untersuchen. Im sich entwickelnden Rückenmark werden kommissarische Axone zunächst zur ventralen Bodenplatte hin angezogen, wo sie die Mittellinie überqueren. Nach der Überquerung verlieren sie ihre Reaktionsfähigkeit auf die Bodenplatten-Anziehungsmittel und gewinnen an Reaktion auf Bodenplattenabweisende, so dass sie die Bodenplatte verlassen und in Richtung ihres Endziels in der kontralateralen Seite des Nervensystems navigieren können2,3. Die Regulierung der Rezeptorverfügbarkeit an der Wachstumskegeloberfläche ist einer der Mechanismen, die dem Wechsel der Reaktionsfähigkeit auf Mittellinienhinweise 4,5zugrunde liegen. Daher ist die selektive Überwachung der Rezeptoren, die an der Plasmamembran von Wachstumskegeln vorhanden sind, von größter Bedeutung. Wir beschreiben hier eine Methode, die auf der pH-abhängigen Fluoreszenzeigenschaft einer grünen Fluoreszenzproteinvariante (GFP) basiert, um speziell die Axon-Führungsrezeptoren zu visualisieren, die an die Plasmamembran in vitro und in vivoim sich entwickelnden Kükenrückenmark adressiert sind.
Rothman und Kollegen entwickelt durch Punktmutationen pH-sensitive Varianten von GFP einschließlich der Ekliptik pHluorin6. Ekliptisches pHluorin hat die Eigenschaft, nicht fluoreszierend zu sein, wenn es einem sauren pH-Wert (<6) ausgesetzt ist, während es bei neutralem pH-Wert fluoreszierend ist. Dies ermöglicht die Unterscheidung von nichtfluoreszierenden Rezeptoren, die in intrazellulären sauren Kompartimenten lokalisiert sind(d.h. Endosomen, Handelsvesikeln) von fluoreszierenden Rezeptoren, die in die Plasmamembran integriert und somit dem extrazellulären neutralen pH7ausgesetzt sind. Wir nutzten dies, um die Plasmamembranlokalisierung von plexinA1 zu überwachen, einem Axon-Führungsrezeptor, der die Wachstumskegelreaktion auf das Mittellinien-repellens Semaphorin 3B5 vermittelt (Abbildung 1A). Wir beschreiben hier die In-vitro-Charakterisierung eines pHluorin-plexinA1-Konstrukts, zusammen mit der ovo Elektroporation8-10 dieses Konstrukts im sich entwickelnden Kükenrückenmark, gefolgt von der mikroskopischen Analyse von Kryosektionen, die es ermöglichen, die Axon-Führungsrezeptordynamik in vivo mit räumlichen und zeitlichen Auflösungen zu verfolgen.
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Protocol
1. Cloning-Strategie zur Tag PlexinA1-Rezeptor mit pHluorin
- Wählen Sie einen geeigneten Expressionsvektor als Rückgrat(z.B. der MausrezeptorplexinA1-Expressionsvektor, ein Freundliches Geschenk von Dr. Andreas Puschel11).
Hinweis: Dieser PlexinA1-Vektor wurde entwickelt, um eine effiziente HA- oder VSV-markierte Rezeptor-Einfügung in die Plasmamembran zu erreichen. - Amplify per PCR die ekliptische pHluorin-Codierungssequenz mit dem entsprechenden Plasmid als Vorlage(z.B. pHluorin-getaggter GABA-A-Rezeptor, ein Art Geschenk von Dr. Jacob2). Fügen Sie bei Bedarf eine Restriktionsstelle am 5' Ende des Primers hinzu, um den Klonschritt im Backbone zu erleichtern.
- Fügen Sie die pHluorin-Sequenz im Rahmen zwischen dem Signalpeptid und der Rezeptorcodierungssequenz mithilfe von Restriktionsstellen ein(z. B. NruI/Kpn2I-Restriktionsstellen, wie in Abbildung 1Bbeschrieben).
Hinweis: Da das Signalpeptid, das die richtige Ausrichtung der Rezeptoren sicherstellt, gespaltet ist, sollte das pHluorin danach platziert werden. Dies rechtfertigt die Erkennung des Signalpeptids und verhindert eine Spaltung des pHluorins vom Rezeptor des Interesses. - Sequenzieren Sie die erhaltenen Konstrukte, um sicherzustellen, dass keine Mutation durch PCR eingeführt wurde.
2. Charakterisierung von pHluorin-getaggten Rezeptoren in vitro in COS7-Zellen
Die Fähigkeit des Fusionsproteins, die Plasmamembran zu erreichen, und sein reversibler Fluoreszenzverlust, wenn der pH-Wert gesenkt wird, können mit dem folgenden Verfahren bestätigt werden.
- Tag 1. Platte 1,5 x 105 COS7-Zellen in einer glasunteren 35-mm-Schale in 2 ml komplettem Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM - 10% Fetal Bovine Serum - 1 mM Natriumpyruvat - 25 U/ml Penicillin/Stretomycin - 2,5 g/ml Amphotericin B - pH 7.4).
- Tag 2. Transfektien Zellen:
Hinweis: Zellen sollten 70-80% konfluent sein.- Bereiten Sie 200 l NaCl 150 mM vor und fügen Sie 3 g DNA, d.h. den vektorkodierenden pHluorin-getaggten Rezeptor hinzu. Sanft wirbeln und kurz nach unten drehen.
Anmerkung: Eine Karte des in diesen Experimenten verwendeten pHluorin-plexinA1-Vektors ist in Abbildung 1Bdargestellt. - Fügen Sie 10 l Transfektionsreagenz (oder die entsprechende Menge des verwendeten Reagenzes) hinzu. Wirbel sofort.
- 10 min bei RT inkubieren.
- Fügen Sie den Zellen 200 l des Transfektionsreagenz/DNA-Mix hinzu.
- Bewegen Sie die Platte sanft, um eine Neuaufteilung der Mischung zu erreichen, und legen Sie die Zellen wieder auf den 37 °C-Inkubator.
- Bereiten Sie 200 l NaCl 150 mM vor und fügen Sie 3 g DNA, d.h. den vektorkodierenden pHluorin-getaggten Rezeptor hinzu. Sanft wirbeln und kurz nach unten drehen.
- Tag 3. Entfernen Sie das Transfektionsmedium und ersetzen Sie es durch 2 ml frisches komplettes DMEM.
- Tag 4. Durchführung einer Live-Zell-Bildgebung von COS7 pHluorin-plexinA1 transfizierten Zellen:
- Bereiten Sie zwei Aliquots des DMEM-Gesamtmediums vor und stellen Sie den pH-Wert auf 3,5 bzw. 9,5 ein.
Hinweis: Für eine 35-mm-Platte werden 1,5 ml jeder Lösung benötigt, um das Experiment durchzuführen. - Entfernen Sie das Zellmedium und ersetzen Sie es durch 1 ml DMEM-Gesamtmedium pH 7.4.
- Bereiten Sie eine 5 ml Spritze mit einem geeigneten Schlauchtyp vor, um verschiedene Komponenten direkt in das Zellkulturmedium zu injizieren, ohne die Mikroskopkammer zu öffnen.
- Verwenden Sie ein Modul, das die Wartung einer 37 °C, 5%CO2 feuchten Arbeitsatmosphäre ermöglicht.
Anmerkung: Ein alternativer Ansatz für die Verwendung einerCO2-Kammer ist die Verwendung von HEPES-gepufferten Medien (in der Regel im Bereich von 10-25 mM je nach Zelltyp). - Legen Sie die Zellen in die Kammer und stellen Sie den Schlauch und die Spritze ein.
Hinweis: Das Mikroskop sollte ausgeglichen werden, bevor es beginnt, mechanische Drift während der Aufnahme zu vermeiden. - Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware, und wählen Sie das multidimensionale Erfassungsprogramm aus.
- Finden Sie transfizierte COS7-Zellen mit dem 40X-Objektiv und markieren Sie die Position in der Software für jede von ihnen.
- Konfigurieren Sie den Z-Stack so, dass eine Tiefenerfassung von 15 m erreicht wird (der Fokus kann sich beim Hinzufügen von Medien in der Platte ändern).
- Einrichten der Belichtung für den GFP-Filter und die Phase.
- Konfigurieren Sie das Erfassungstiming.
Hinweis: Für das gesamte Experiment mit 5 Interessensgebieten sollte der Erwerb alle 20 Sek. für 10 min ausreichen. - Starten Sie die Erfassung und nehmen Sie 5 Steuerbilder in DMEM pH 7.4 medium.
- Pause-Erfassung, injizieren 1,25 ml pH 3,5 komplette DMEM, um einen pH-Wert von 5,5 im Kulturmedium zu erreichen, markieren Ereignis in der Software und Wiederaufnahme der Erfassung für 5 weitere Zeitpunkte.
Hinweis: Grüne Fluoreszenz sollte nach und nach verschwinden. - Pause-Erfassung, injizieren 1,2 ml pH 9,5 komplette DMEM, um einen pH 7,4 im Kulturmedium zu erreichen, markieren Ereignis in der Software und Wiederaufnahme der Erfassung für 5 weitere Zeitpunkte.
Hinweis: Grüne Fluoreszenz sollte an der Plasmamembran wieder auftauchen. - Analysieren Sie Bilder.
Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder, die mit einem solchen Protokoll mit dem pHluorin-plexinA1-Konstrukt erhalten wurden.
- Bereiten Sie zwei Aliquots des DMEM-Gesamtmediums vor und stellen Sie den pH-Wert auf 3,5 bzw. 9,5 ein.
3. In ovo Elektroporation von pHluorin-plexinA1 Konstrukt
- Umgang mit Eiern vor der Elektroporation:
- Befruchtete Eier bis eine Woche vor der Inkubation bei 14 °C im Kühlschrank aufbewahren.
- Inkubieren Sie Eier bei 38,5 °C (101,3 °F) in einem Inkubator mit gesättigter Luftfeuchtigkeit für 50-52 stunden, bis die Embryonen das Stadium HH1412erreichen.
Hinweis: Die Eier müssen während der Inkubation horizontal platziert werden, damit der Embryo für die Elektroporation richtig positioniert ist und auf der Oberseite des Dotters schwebt. DAS HH14-Stadium eignet sich zur Expression der Plasmide in differenzierten Neuronen im Rückenmark und im Dorsalwurzelganglimit mit einer angemessenen Überlebensrate.
- Elektroporate Embryonen8-10:
- Vorbereiten der Elektroporation:
- Bereiten Sie endotoxinfreie DNA-Plasmide mit einer Konzentration von mehr als 2 g/l vor, um sie als gewünschte Konzentration verdünnen zu können.
- Ziehen Sie genügend Glaskapillaren, um die verschiedenen DNA-Lösungen zu injizieren.
- Bereiten Sie steriles PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml Penicillin/Streptomycin und Gleichgewicht bei 38,5 °C vor.
- Sterilisieren Sie die Kapuze, gekrümmte Schere und feine Zange.
- Steuern Sie den Elektrodenabstand.
Hinweis: Es wird in der Regel ein Abstand von 4 mm zwischen den Elektroden verwendet.
- Fenster das Ei13 (Abbildung 3A):
- Verwenden Sie eine gekrümmte Schere, um die Schale auf der stumpfen Seite des Eis zu durchbohren.
- 2 ml Albumen mit einer 0,9 mm x 25 mm Nadel und einer 5 ml Spritze entfernen. Richten Sie die Nadel vertikal aus, um eine Beschädigung des Eigelbsacks zu vermeiden.
- Bedecken Sie die Oberseite des Eis mit Klebeband, um die Integrität der Schale zu erhalten.
- Mit einer gekrümmten Schere die Schale in der Mitte des Bandes durchstechen, um den Druck auszugleichen, wenn 2 ml Albumen aus dem Ei entfernt werden. Schneiden Sie dann ein Fenster, das groß genug ist, um den Embryo zu visualisieren und daran arbeiten zu können.
- Fügen Sie 2 ml sterile warme PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml Penicillin/Streptomycin hinzu, um eine Austrocknung des Embryos zu vermeiden und ihn dem Manipulator zugänglicher zu machen.
- DNA injizieren und den Embryo elektropoatieren
- Verdünnung des Plasmids in PBS (-Ca2+; -Mg2+)auf eine Konzentration zwischen 0,5-2 g/l und schnelle grüne Farbstoffe hinzufügen, um eine endgültige 0,025% Konzentration zu erreichen. Laden Sie den DNA-Mix in eine Kapillare. Die Verwendung eines Injektors wird empfohlen.
Anmerkung: Überprüfen Sie, ob die Kapillarresistenz weder zu groß (d. h. es könnte Schwierigkeiten bei der Injektion von Embryonen geben) noch zu klein ist (d. h., die Kapillare könnte zu groß sein und den Embryo beschädigen). Auch die Konzentration von Nukleinsäuren von mehr als 2 g/l kann unspezifische Wirkungen verursachen und muss kontrolliert werden. - Punktieren Sie den Eigelbsack und das Neuralrohr an der kaudalen Seite mit der geladenen Kapillare. Betreten Sie das Neuralrohr mit einem flachen Winkel und füllen Sie das Lumen vom Schwanz bis zum Kopf mit dem DNA-Mix (Abbildung 3B).
Hinweis: Schnelles Grün ermöglicht die Steuerung der Genauigkeit der Injektion. - Stellen Sie die 4 mm Platinelektroden schnell auf beiden Seiten des Neuralrohrs auf die Ebene, die Sie elektroporatieren möchten, und wenden Sie 3 Impulse bei 31 V für 50 msec mit 500 msec Intervallen auf (Abbildung 3C).
Hinweis: Vermeiden Sie es, die Elektroden auf das Herz oder auf große extra embryonale Gefäße zu legen, um eine Beschädigung des sich entwickelnden Embryos zu vermeiden. Blasen sollten sich auf den Elektroden bilden. - Mit der Nadel, entfernen Sie 2 ml Albumen, um den Pegel in der Schale zu verringern.
- Versiegeln Sie das Fenster und die stumpfe Seite hermetisch mit Klebeband.
- Legen Sie die Eier wieder bei 38,5 °C in den Brutkasten, bis sie das gewünschte Stadium erreichen.
- Verdünnung des Plasmids in PBS (-Ca2+; -Mg2+)auf eine Konzentration zwischen 0,5-2 g/l und schnelle grüne Farbstoffe hinzufügen, um eine endgültige 0,025% Konzentration zu erreichen. Laden Sie den DNA-Mix in eine Kapillare. Die Verwendung eines Injektors wird empfohlen.
- Vorbereiten der Elektroporation:
4. Einbetten und Kryosektionen von Embryonen
- 48 Stunden nach Elektroporation, sorgfältig elektorierte Embryonen (HH24-Stadium) ernten. Schneiden Sie das Band und die Hälfte der Chorioallantoidmembran. Um zu verhindern, dass Embryonen im Eigelb versinken, positionieren Sie einen Kolander unter dem Embryo und schneiden Sie die zweite Hälfte der Chorioallantoidmembran.
- Übertragen Sie den Embryo in eine Mitesektionsschale gefüllte Mit eiskaltem PBS.
- Überprüfen Sie die Elektroporationseffizienz, indem Sie mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop nach Fluoreszenz im Neuralrohr suchen.
Hinweis : Die Koelektroporation eines Kontrollplasmids, das für das RFP kodiert, kann helfen, den elektroporated Bereich zu visualisieren. - Sezieren Sie Embryonen mit einem Mikroskalpell, um den elektropoierten Bereich des Rückenmarks auszuwählen.
- Sezierte Embryonen auf eine 24-Well-Platte übertragen und in pH 7,4 4% Paraformaldehyd (PFA) - Phosphatpuffer-Saline (PBS), O/N bei 4 °C fixieren.
Hinweis: Der Fixationsschritt ist entscheidend, um die Stabilisierung von pHluorin in seiner "lebenden" Konformation zu ermöglichen und somit pHluorin in festem/permeabilisiertem Gewebe verwenden zu können. Obwohl die Fixierung die pH-abhängige Fluoreszenzveränderung drastisch verlangsamt, muss berücksichtigt werden, dass Konformations-/Protonationsänderungen auch nach der Fixierung auftreten können. Daher muss das folgende Protokoll (Einbettung, Kryosektionen und Beobachtung) innerhalb von 3 Tagen nach dem Fixierungsschritt mit allen Puffern bei pH 7 durchgeführt werden. Wenn keine Fixierung erforderlich ist, wird die Durchführung von Beobachtungen an LebendenGewebeabschnitten empfohlen. - 4% PFA entfernen und Embryonen in pH 7,4 PBS waschen.
- Inkubieren Sie Embryonen in PBS-15% Saccharose und halten Sie bei 4 °C, bis die Embryonen sinken.
- Inkubieren Sie feste Embryonen in pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose für 45 min bei 37 °C, so dass Embryonen vollständig eingebettet sind.
- Einbettformen auf Eis legen und 400 l pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose hinzufügen, um eine solide 2 mm Basis zu erreichen.
- Den eingebetteten Embryo mit einer geschnittenen Spitze ansaugen und den Embryo auf die feste Gelatinebasis legen.
- Abdeckung mit pH 7,4 7,5% Gelatine - 15% Saccharose und positionieren Sie den Embryo mit Zangen, bevor die Gelatine erstarrt.
- Sobald die Gelatine fest ist, bereiten Sie ein -40 °C Isopropanolbad (trockenes Eis oder flüssigen Stickstoff verwenden) und frieren Sie den Gelatineblock für 5 min ein.
- Halten Sie die gefrorenen Blöcke bei -80 °C.
- Legen Sie den gefrorenen Block 1 Std. auf -20 °C.
- Entfernen Sie die Form und fixieren Sie den Block auf einem Futter mit einem Polyethylenglykolmedium.
- Sobald der Block fest befestigt ist, legen Sie das Futter in das Kryostatsystem.
Hinweis: Verwenden Sie beschichtete Dias, um Gewebeverluste während der Färbung zu vermeiden. - Führen Sie serielle Kryosektionen durch (in der Regel werden 20 m Kryosektionen durchgeführt).
- Lassen Sie die Kryosektionen 15 min bei RT trocknen.
Hinweis: Kryosektionen sollten vor unnötiger Lichtexposition geschützt werden, um eine Bleichenung der GFP-Fluoreszenz zu vermeiden.
5. Mikroskopische Analyse von Kryosektionen
- Rehydrat-Kryosections in pH 7,4 PBS bei RT für 10 min.
Hinweis: Bei Bedarf können Kerne mit Hoechst befleckt werden. - Verwenden Sie eine 0,5-mm/ml-Hoechst-Lösung in PBS und inkubieren Sie Kryosektionen für 15 min.
- Spülen Sie die Dias 3x mit pH 7,4 PBS für 5 min.
- Fahren Sie mit der Schiebemontage fort. Eine pH 7,4 (oder mehr grundlegende) Polyvinyl-Alkohol-Montagelösung, die O/N aushärtet, kann verwendet werden: Positionieren Sie den Deckelrutsch sorgfältig, um die Bildung von Luftblasen zwischen dem Schlitten und dem Deckelschlupf zu vermeiden.
- Lassen Sie das Montagemedium O/N bei 4 °C im Dunkeln aushärten.
- Verwenden Sie ein invertiertes konfokales Mikroskop, um das pHluorin-plexinA1-Fusionsprotein präzise zu visualisieren: Führen Sie z-stack bei optimaler Loch- und optischer Auflösung durch und verwenden Sie eine 20X (NA 0.75) oder 40X (NA 1.3) Linse.
Hinweis: pHluorin ist mit den gleichen Parametern nachweisbar, die zur Detektion von GFP verwendet werden(d. h. Emissionsspitzen bei 509 nm). Die Einstellungen für Wellenlängenanregungs- und Detektionsfilter werden durch die Bildverarbeitungssoftware optimal definiert. Hoechst wird zwischen 425-460 nm (Erregung ist bei 405 nm), GFP oder pHluorin zwischen 485-545 nm (Erregung liegt bei 473 nm) und RFP zwischen 575-675 nm (Erregung liegt bei 559 nm) nachgewiesen.
Repräsentative Bilder von pHluorin-plexinA1 und eGFP-Expression im Küken-Embryo-Rückenmark sind in Abbildung 4dargestellt.
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Representative Results
Abbildung 1. A. Schema der pHluorin-plexinA1-Fluoreszenzeigenschaften in einem zellulären Kontext. PHluorin ist nicht fluoreszierend in intrazellulären Kompartimenten, in denen der pH-Wert sauer ist (<6), z. B. bei Handelsvesikeln oder in Endosomen, und fluoreszierend, wenn es dem extrazellulären Medium ausgesetzt ist, in dem der pH-Wert neutral ist. Dies ermöglicht die Visualisierung nur des Zelloberflächenpools des pHluorin-plexinA1-Rezeptors. B. Karte des Klonplatzes pBK-CMV-pHluorin-plexinA1. Als Rückgrat wurde ein MausrezeptorplexinA1-Exemitvektor verwendet. Dieser Vektor wurde entwickelt, um eine effiziente VSV-markierte Rezeptorinsertion an der Plasmamembran zu erreichen. Um dies zu tun, Semaphorin 3a Peptid-Signal und Spaltung Sekelstelle wurden vor dem VSV-getaggten Rezeptor von seinem eigenen Signal Peptid und Spaltung Seactid und Spaltung Seactium-Site ablated verschmolzen. Durch PCR wurde die pHluorin-Sequenz im Frame zwischen VSV-Tag und PlxnA1-Codierungssequenzen mit NruI/Kpn2I-Einschränkungsstellen eingefügt. Einzelne Restriktionsstellen sind für die Gestaltung der Klonstrategie anderer Rezeptoren angezeigt. Das Schema ist aus bioinformatischer Software adaptiert.
Abbildung 2. Die Charakterisierung des pHluorin-plexinA1 konstruieren pH-abhängige fluoreszierende Eigenschaften in COS7-Zellen. A. COS7-Zellen, die mit dem pHluorin-plexinA1-Konstrukt transfiziert wurden, wo sie mit einem konfokalen Mikroskop beobachtet wurden, das die Visualisierung der pHluorin-PlexinA1-Fluoreszenz an der Plasmamembran ermöglicht. Scale bar: 20 M. B. COS7-Zellen, die mit dem pHluorin-plexinA1-Konstrukt transfiziert werden, wo durch Live-Bildgebung in einem pH 7,4-Kulturmedium, nach Versauerung des Kulturmediums bis pH 5,5 und nach Wiederherstellung von pH 7,4 im Kulturmedium beobachtet wird. Zellumrisse werden mit einer gestrichelten Linie bei der GFP-Fluoreszenzerfassung angezeigt. Maßstabsleiste: 10 M. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
Abbildung 3. In ovo Elektroporation Verfahren. A. 1. Albumen Entfernung von der größten Seite der Schale. 2. Fenster der Eierschale, um zugang zum Embryo zu erhalten. B. DNA/Fast Green Mix Injektion in das Neuralrohr. C. Platzieren von Elektroden auf beiden Seiten des Neuralrohrs, Vermeidung des Herzens und der großen Gefäße und Elektroporation des Kükenembryons.
Abbildung 4. Mikroskopische Analyse von Küken-Neuralrohr-Kryosektionen nach pHluorin-PlexinA1-Elektroporation. Ein Vergleich zwischen eGFP (obere Paneele) und pHluorin-plexinA1 (untere Platten) Expressionsmuster im elektroporated Küken Rückenmark wird gezeigt. Vergrößerte Tafeln zeigen die membranöse Fluoreszenz von pHluorin-plexinA1 (a') im Vergleich zur diffusen subzellulären Lokalisierung von eGFP (a). In Bezug auf plexinA1 zeigt die vergrößerte Platte, dass dieser Rezeptor bei der Bodenplattenüberquerung (b') speziell an der Plasmamembran angereichert wird, was bei eGFP, das vor und nach der Bodenplattenüberquerung gleich ausgedrückt wird, nicht der Fall ist (b). Skalenstäbe: 100 M. FP: Bodenplatte; Pre: Precrossing; Post: Postcrossing. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll bietet ein schrittweises Verfahren, um die Dynamik eines Axon-Führungsrezeptors sowohl in der Zellkultur als auch im Entwicklungskontext des Kükenembryonals Rückenmarks zu verfolgen.
Um ein de novo pHluorin-markiertes Protein zu entwerfen, müssen zwei Punkte in Bezug auf die Klonstrategie berücksichtigt werden. Zunächst sollte das pHluorin-Tag dem Lumen der sauren Endosomen und damit dem extrazellulären Fach ausgesetzt werden, um den Plasmamembranrezeptorpool zu visualisieren. Somit hängt die korrekte Positionierung der pHluorin-Sequenz in Bezug auf die Rezeptorsequenz direkt von der Art des untersuchten Rezeptors ab(d.h. ob der N-Terminal oder der C-terminale Teil des Rezeptors dem extrazellulären Kompartiment ausgesetzt ist). Zweitens sollte, wie im Protokoll erläutert, die Position der pHluorin-Sequenz relativ zum Signalpeptid in Betracht gezogen werden, um eine spätere Spaltung zwischen dem pHluorin und dem Rezeptor zu vermeiden.
Eine Einschränkung der Technik ist mit dem Handel mit den Rezeptoren nach ihrer Aktivierung an der Plasmamembran verbunden. Üblicherweise werden Rezeptoren verinnerlicht und fortschreiten durch den endozytischen Weg, der aus funktionell und physikalisch unterschiedlichen Fächern besteht15. Aufgrund von ATP-getriebenen Protonenpumpen halten Endosomen bei frühen Endosomen einen sauren pH-Wert von 6, bei späten Endosomen etwa 5, bei Lysosomen weniger als 5, aber nur etwa 6,4 bei Recycling-Endosomen oder 7,0 bei Caveosomen, die Fluoreszenz in diesen beiden endosomischen Kompartimenten ermöglichen. Dieses Problem kann in vitro mit der totalen inneren Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF) gelöst werden16. Eine zweite Einschränkung, die dieser Technik innewohnt, ist, dass pHluorin-Tag aufgrund seiner relativ großen Größe die Rezeptoraktivität stören könnte, abhängig von der Tag-Einfügestelle.
Trotz seiner Vorteile, pHluorin ist nicht weit verbreitet, um die Dynamik und Regulierung von Membranproteinen während der Axon-Navigation zu studieren. Seminale Arbeiten haben pHluorin verwendet, um die räumlich-zeitliche Dynamik der Exozytose während des Wachstumskegeldrehens in vitro17zu untersuchen. Im vorliegenden Protokoll veranschaulichen wir, wie pHluorin verwendet werden könnte, um die Verteilung von Rezeptoren an der Plasmamembran von Axonen in vivozu untersuchen. Da pHluorine genetisch kodiert sind, eignen sie sich besonders für die In-vivo-Analyse. Obwohl wir seine Verwendung bei Küken nach in ovo Elektroporation beschreiben, kann dieser Ansatz in anderen Arten verwendet werden. Tatsächlich funktioniert die Elektroporation in verschiedenen Tiermodellen effizient18,19. Darüber hinaus wurden pHluorine erfolgreich in C. elegans, Drosophilaoder Maus transgene Tiere20-23verwendet.
Da pH-abhängige Veränderungen im Millisekundenbereich auftreten, sind die pHluorine speziell für die Live-Bildgebung6,24geeignet. Die PHluorin-Fusion wurde beispielsweise zur Überwachung der In-vivo-Dynamik der Synaptobrevin-Exozytose in olfaktorischen sensorischen Neuronen von transgenen Mäusen23verwendet. Die In-vivo-Live-Bildgebung von pHluorin-Fusionen ist vielversprechend, da konfokale Mikroskope, die an die Live-Bildgebung angepasst sind (schnelle Bildgebung und geringe Phototoxizität), effizienter und zugänglicher werden25. Live-Bildgebung in vivo könnte auch mit Fluoreszenz-Recovery nach Photobleichung (FRAP) kombiniert werden, so dass Exozytose oder Diffusion direkter bewertet werden könnte26.
Der Einsatz anderer pH-empfindlicher Varianten und deren Kombinationen kann das Anwendungsspektrum weiter erweitern. Die dynamische Verteilung des Rezeptors in verschiedenen Organellen konnte mit hilfe eines ratiometrischen pHluorins überwacht werden, das die Fluoreszenz entsprechend dem pH-Wert des Fachs6,27verändert. Ebenso könnte die Zugabe eines pH-unempfindlichen fluoreszierenden Proteins zu einem Membranprotein, das mit einem ekliptischen pHluorin verschmolzen wird, wichtige Einblicke in seinen Handel liefern28. Darüber hinaus wird das kürzliche Klonen von pHtomato29 die Gleichzeitige Überwachung von zwei Rezeptoren ermöglichen. Dies könnte wichtige Einblicke in die Bildung von Rezeptorkomplexen liefern. Da pHluorin kann auch verwendet werden, um Anleitung Hinweise30, Dual-Bildgebung des Liganden, und sein Rezeptor ist auch machbar.
In diesem Protokoll ist die Expressionsrate des Fusionsproteins ein kritischer Punkt und hängt insbesondere von der Stärke des Promotors, der Stabilität des Fusionsproteins und der Menge des Plasmids ab, das zur Transfektion der Zellen verwendet wird. Tatsächlich können sich Fusionsproteine bei Überexprimierter Weise in intrazellulären Vesikeln ansammeln und ein fluoreszierender Hintergrund auftreten. Daher können mehrere Optimierungen erforderlich sein, um eine präzise Visualisierung des pHluorin-geschmolzenen Proteins an der Zelloberfläche zu erreichen. Darüber hinaus erfordert die Verwendung von pHluorin-Fusionsprotein in festem Gewebe besondere Sorgfalt während und nach der Fixierung. Tatsächlich kann die Stabilisierung der Konformationen von pHluorin-Fusionsproteinen nur vorübergehend sein. Daher muss der pH-Wert über 7 gehalten werden, um einen Verlust des pHluorin-Signals zu verhindern. Darüber hinaus müssen Beobachtungen kurz nach der Fixierung durchgeführt werden. Das optimale Timing muss möglicherweise von den Anwendern entsprechend ihrem jeweiligen pHluorin-Fusionsprotein definiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Homaira Nawabi, Frederic Moret und Isabelle Sanyas für ihre Hilfe. Diese Arbeit wird unterstützt von CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA bis V.C.; C.D-B und A.J werden von einem La Ligue contre le cancer bzw. Labex DevWeCan Stipendien unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
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