Summary
Vi beskriver här användningen av en pH-känsliga gröna fluorescerande protein variant, pHluorin, att studera spatio-temporal dynamiken i axon vägledning receptorer handel vid cell ytan. Den pHluorin-märkta receptorn uttrycks både i cellkultur och in vivo, med hjälp av elektroporering av kycklingembryon.
Abstract
Under utvecklingen spelar axon guidance receptorer en avgörande roll för att reglera axons känslighet för både attraktiva och motbjudande signaler. Aktivering av vägledningsreceptorerna är faktiskt det första steget i signalmekanismerna som gör det möjligt för axonspetsar, tillväxtkonerna, att svara på liganderna. Som sådan är modulering av deras tillgänglighet vid cellytan en av de mekanismer som deltar i att ställa in tillväxtkonkänsligheten. Vi beskriver här en metod för att exakt visualisera spatio-temporal cell ytan dynamiken i en axon vägledning receptor både in vitro och in vivo i den utvecklande chick ryggmärgen. Vi utnyttjade den pH-beroende fluorescensegenskapen hos en grön fluorescerande proteinvariant (GFP) för att specifikt upptäcka den del av axonvägledningsreceptorn som är adresserad till plasmamembranet. Vi beskriver först in vitro-valideringen av sådana pH-beroende konstruktioner och vi beskriver vidare deras användning in vivo, i kyckling spinal ackord, för att bedöma spatio-temporal dynamiken i axon vägledning receptorn av intresse.
Introduction
Under navigeringen integrerar axoner flera miljösignaler som vägleder dem mot sitt mål. Dessa signaler aktiverar styrreceptorer vid axonterminalernas yta, tillväxtkonerna, som i sin tur initierar en lämplig signalväg. Således är den tidsmässiga och rumsliga regleringen av receptorernas cellytafördelning avgörande för att ställa in känsligheten hos tillväxtkonen1. I detta sammanhang är midline korsning av commissural axons en utmärkt modell för att undersöka regleringen av receptor cell ytnivåer. I den utvecklande ryggmärgen lockas commissural axons initialt mot ventrala golvplattan där de korsar mittlinjen. Efter korsning förlorar de sin lyhördhet till golvplattans attractants och får svar på golvplåtsavstötningar så att de kan lämna golvplattan och navigera mot sin slutdestination i nervsystemets kontralaterala sida2,3. Reglering av receptortillgänglighet vid tillväxtkonytan är en av de mekanismer som ligger till grund för bytet av responsivitet till mellanlinjesignaler4,5. Således är selektiv övervakning av de receptorer som finns vid plasmamembranet av tillväxtkoner av största vikt. Vi beskriver här en metod baserad på den pH-beroende fluorescensegenskapen hos en grön fluorescerande protein (GFP) variant för att specifikt visualisera axon vägledning receptorer som är adresserade till plasmamembran in vitro och in vivo, i den utvecklande kyckling ryggmärgen.
Rothman och kollegor konstruerade av punktmutationer pH-känsliga varianter av GFP inklusive förmörkelse pHluorin6. Ekliptisk pHluorin har egenskapen att vara icke-fluorescerande när den utsätts för surt pH (<6), samtidigt som det fluorescerande vid neutralt pH. Detta gör det möjligt att skilja icke-fluorescerande receptorer lokaliserade i intracellulära sura fack(dvs. endosomer, trafficking vesiklar) från fluorescerande receptorer som ingår i plasmamembranet och därmed utsätts för det extracellulära neutrala pH7. Vi utnyttjade detta för att övervaka plasmamembranlokaliseringen av plexinA1, en axon guidance receptor medla tillväxt kon svar på mittlinjen repellent semaphorin 3B5 (Figur 1A). Vi beskriver här in vitro karakterisering av en pHluorin-plexinA1 konstruktion, tillsammans med in ovo elektroporation8-10 av denna konstruktion i den utvecklande kyckling ryggmärg följt av mikroskopisk analys av cryosections som gör det möjligt att följa axon vägledning receptor dynamik in vivo med både rumsliga och tidsmässiga upplösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloningsstrategi för att märka PlexinA1-receptor med pHluorin
- Välj en lämplig uttrycksvektor som ryggrad (t.ex. musreceptorn plexinA1 uttrycker vektor, en slags gåva av Dr. Andreas Puschel11).
Obs: Denna plexinA1 vektor konstruerades för att uppnå effektiv HA- eller VSV-märkt receptor insättning i plasma membranet. - Förstärka med PCR den ekliptiska pHluorin kodningssekvensen med hjälp av tillräcklig plasmid som mall(t.ex. pHluorin-märkt GABA A-receptor, en slags gåva av Dr. Jacob2). Om det behövs, lägg till en begränsningsplats till primerns 5' ände för att underlätta kloningssteget i ryggraden.
- För in pHluorinsekvensen i bildruta mellan signalpeptiden och receptorkodningssekvensen med hjälp av restriktionsplatser (t.ex. nruI/Kpn2I-begränsningsplatser enligt figur 1B).
Obs: Eftersom signalpeptiden som säkerställer att receptorernas korrekta inriktning klyvs, bör pHluorin placeras efter den. Detta motiverar erkännandet av signalpeptiden och förhindrar klyvning av pHluorin från receptorn av intresse. - Sekvens konstruktioner erhålls för att säkerställa att ingen mutation infördes av PCR.
2. Karakterisering av pHluorin-märkt receptor in vitro i COS7-celler
Fusionsproteinets förmåga att nå plasmamembranet och dess reversibla förlust av fluorescens när pH sänks kan bekräftas med hjälp av följande förfarande.
- Dag 1. Platta 1,5 x 105 COS7-celler i en 35 mm glasbotten i 2 ml komplett Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM - 10% fetala nötkreatursserum - 1 mM natrium pyruvat - 25 U/ml penicillin/stretomycin - 2,5 μg/ml amphotericin B - pH 7,4).
- Dag 2. Transfekta celler:
Obs: Cellerna ska vara 70-80% konfluenta.- Förbered 200 μl NaCl 150 mM och tillsätt 3 μg DNA dvs. vektorkodning pHluorin-märkt receptor. Virvel försiktigt och snurra ner en kort stund.
Obs: En karta över pHluorin-plexinA1-vektorn som används i dessa experiment visas i figur 1B. - Tillsätt 10 μl transfection reagens (eller lämplig mängd reagens som används). Vortex omedelbart.
- Inkubera 10 min på RT.
- Tillsätt 200 μl transfection reagens/DNA-blandning till cellerna.
- Flytta försiktigt plattan för att uppnå ompartition av blandningen och placera cellerna tillbaka till inkubatorn på 37 °C.
- Förbered 200 μl NaCl 150 mM och tillsätt 3 μg DNA dvs. vektorkodning pHluorin-märkt receptor. Virvel försiktigt och snurra ner en kort stund.
- Dag 3. Ta bort transfection medium och ersätt det med 2 ml färsk komplett DMEM.
- Dag 4. Utför levande cellavbildning av COS7 pHluorin-plexinA1 transfekterade celler:
- Förbered två alikvoter dmem komplett medium och justera pH till 3,5 respektive 9,5.
Obs: För en 35 mm platta behövs 1,5 ml av varje lösning för att utföra experimentet. - Ta bort cellmediet och byt ut det med 1 ml DMEM komplett medium pH 7.4.
- Förbered en 5 ml spruta med en lämplig typ av slang för att injicera olika komponenter direkt i cellkulturmediet utan att öppna mikroskopkammaren.
- Använd en modul som möjliggör underhåll av en 37 °C, 5% CO2 fuktig arbetsatmosfär.
Anm.: En alternativ metod för användning av en CO2-kammare är att använda HEPES-buffrat medium (vanligtvis inom intervallet 10-25 mM beroende på celltyp). - Placera cellerna i kammaren och justera slangen och sprutan.
Obs: Mikroskopet bör balanseras innan det börjar undvika mekanisk drift under inspelningen. - Öppna bildframställningsprogrammet och välj det flerdimensionella förvärvsprogrammet.
- Hitta transfecterade COS7-celler med 40X-målet och markera position i programvaran för var och en av dem.
- Konfigurera Z-stacken för att få ett djupförvärv på 15 μm (fokus kan ändras när du lägger till media i plattan).
- Ställ in exponering för GFP-filtret och fasen.
- Konfigurera anskaffningstidpunkt.
Obs: För hela experimentet med 5 intresseområden bör förvärv var 20: e sekund i 10 minuter vara tillräckligt. - Starta förvärvet och ta 5 kontrollbilder i DMEM pH 7.4 medium.
- Pausa förvärvet, injicera 1,25 ml pH 3,5 komplett DMEM för att uppnå ett pH på 5,5 i kulturmediet, markera händelsen i programvaran och återuppta förvärvet för ytterligare 5 tidpunkter.
Obs: Grön fluorescens bör gradvis försvinna. - Pausa förvärvet, injicera 1,2 ml pH 9,5 komplett DMEM för att uppnå ett pH 7,4 i kulturmediet, markera händelse i programvaran och återuppta förvärvet för ytterligare 5 tidpunkter.
Obs: Grön fluorescens bör återkomma vid plasmamembranet. - Analysera bilder.
Figur 2 visar representativa bilder som erhållits med ett sådant protokoll med pHluorin-plexinA1-konstruktionen.
- Förbered två alikvoter dmem komplett medium och justera pH till 3,5 respektive 9,5.
3. In ovo Elektroporering av pHluorin-plexinA1 Konstruktion
- Hantering av ägg före elektroporering:
- Förvara befruktade ägg i kylskåp vid 14 °C upp till en vecka före inkubation.
- Ruv ägg vid 38,5 °C i en inkubator med mättad fuktighet i 50–52 timmar tills embryona når stadium HH1412.
Obs: Äggen måste placeras horisontellt under inkubationen så att embryot är korrekt placerat för elektroporering, flytande på toppen av äggulan. HH14 stadium är lämplig för att erhålla uttryck av plasmiderna i differentierade nervceller i ryggmärgen och i dorsala rot ganglion med en lämplig överlevnadsgrad.
- Elektroporatembryon8-10:
- Förbered elektroporering:
- Förbered endotoxinfria DNA-plasmider med en koncentration som är högre än 2 μg/μl för att kunna späda ut den som önskad koncentration.
- Dra tillräckligt med glas kapillärer för att injicera de olika DNA-lösningarna.
- Förbered steril PBS (-Ca2+; -Mg2 +) - 100 U/ml penicillin/streptomycin och jämvikt vid 38,5 °C.
- Sterilisera huven, den böjda saxen och de fina tångarna.
- Kontrollera elektrodavståndet.
Anm.: Ett 4 mm utrymme mellan elektroderna används i allmänhet.
- Fönster ägget13 (Figur 3A):
- Använd böjd sax för att genomborra skalet på äggets trubbiga sida.
- Ta bort 2 ml albumen med en 0,9 mm x 25 mm nål och en 5 ml spruta. Orientera nålen vertikalt för att undvika att skada äggulasäcken.
- Täck toppen av ägget med tejp för att upprätthålla skalets integritet.
- Använd böjd sax, genomborra skalet i mitten av tejpen för att utjämna trycket när du tar bort 2 ml albumen från ägget. Klipp sedan ett fönster som är tillräckligt stort för att visualisera embryot och kunna arbeta på det.
- Tillsätt ~2 ml steril varm PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicillin/streptomycin för att undvika uttorkning av embryot och göra det mer tillgängligt för manipulatorn.
- Injicera DNA och elektroporera embryot
- Späd ut plasmiden i PBS (-Ca2+; -Mg2+) till en koncentration mellan 0,5-2 μg/μl och tillsätt snabbt grönt färgämne för att nå en slutlig koncentration på 0,025%. Ladda DNA-blandningen i kapillär. Användning av en injektor rekommenderas.
Obs: Kontrollera att kapillärmotståndet varken är för stort (vilket innebär att det kan finnas svårigheter när embryon injiceras) eller för litet (vilket innebär att kapillären kan vara för stor och kan skada embryot). Koncentration av nukleinsyror som är högre än 2 μg/μl kan också orsaka ospecificerade effekter och måste kontrolleras. - Punktera äggula-säcken och neurala röret på kaudalsidan med den laddade kapillären. Gå in i neuralröret med en grund vinkel och fyll lumen från svansen till huvudet med DNA-blandningen (Figur 3B).
Obs: Snabbgrönt gör det möjligt att kontrollera injektionens noggrannhet. - Placera snabbt 4 mm platinaelektroder på vardera sidan av neuralröret på den nivå du vill elektroporera och applicera 3 pulser vid 31 V för 50 msec med 500 msec intervaller (Figur 3C).
Obs: Undvik att placera elektroderna på hjärtat eller på stora extra embryonala kärl för att undvika att skada det utvecklande embryot. Bubblor ska bildas på elektroderna. - Ta bort 2 ml albumen med nålen för att minska nivån i skalet.
- Försegla fönstret och den trubbiga sidan hermetiskt med tejp.
- Lägg tillbaka äggen vid 38,5 °C i inkubatorn tills de når önskat stadium.
- Späd ut plasmiden i PBS (-Ca2+; -Mg2+) till en koncentration mellan 0,5-2 μg/μl och tillsätt snabbt grönt färgämne för att nå en slutlig koncentration på 0,025%. Ladda DNA-blandningen i kapillär. Användning av en injektor rekommenderas.
- Förbered elektroporering:
4. Inbäddning och kryosectioning av embryon
- 48 timmar efter elektroporering, skörda noggrant elektroporerade embryon (HH24-stadiet). Skär tejpen och hälften av chorioallantoidmembranet. För att förhindra att embryon sjunker ner i äggulan, placera ett durkslag under embryot och skär den andra halvan av chorioallantoidmembranet.
- Överför embryot till en dissekeringsfat fylld med iskallt PBS.
- Kontrollera elektroporationseffektiviteten genom att leta efter fluorescens i neuralröret med ett fluorescensstereomikroskop.
Observera: Samelektropering av en kontrollplasmidkodning av RFP kan bidra till att visualisera det elektroporerade området. - Dissekera embryon med hjälp av en mikroscalpel för att välja det elektroporerade området i ryggmärgen.
- Överför dissekerade embryon till en 24-brunnsplatta och fixera i pH 7,4 4% Paraformaldehyd (PFA) - Fosfatbuffert saltlösning (PBS), O/N vid 4 °C.
Obs: Fixeringssteg är avgörande för att möjliggöra stabilisering av pHluorin i dess "levande" konformation och därmed kunna använda pHluorin i fast/permeabiliserad vävnad. Även om fixering saktar drastiskt pH-beroende förändring av fluorescens, måste man ta hänsyn till att konformations-/protonationsförändringar fortfarande kan uppstå efter fixering. Således måste följande protokoll (inbäddning, cryosections och observation) utföras inom 3 dagar efter fixeringssteget, med alla buffertar vid pH 7. Om fixering inte krävs rekommenderas observation på levande vävnadssektioner. - Ta bort 4% PFA och tvätta embryon i pH 7,4 PBS.
- Inkubera embryon i PBS-15% sackaros och håll vid 4 °C tills embryona sjunker.
- Inkubera fasta embryon i pH 7,4 7,5% gelatin- 15% sackaros i 45 min vid 37 °C så embryon är helt inbäddade.
- Placera inbäddningsformar på is och tillsätt 400 μl pH 7,4 7,5% gelatin- 15% sackaros för att uppnå en solid 2 mm bas.
- Aspirera det inbäddade embryot med en skuren spets och placera embryot på den fasta gelatinbasen.
- Täck med pH 7,4 7,5% gelatin- 15% sackaros och placera embryot med tång innan gelatin stelnat.
- När gelatinet är fast, förbered ett isopropanolbad med -40 °C (använd torris eller flytande kväve) och frys gelatinblocket i 5 minuter.
- Håll de frusna blocken på -80 °C.
- Placera det frusna blocket på -20 °C i 1 timme.
- Ta bort formen och fixera blocket på en chuck med ett polyetylenglykolmedel.
- När blocket är tätt fastsatt, placera chucken i kryostatsystemet.
Obs: Använd belagda diabilder för att undvika vävnadsförlust vid färgning. - Utför seriella cryosections (20 μm cryosections utförs vanligtvis).
- Låt kryosections torka i 15 min på RT.
Anm.: Cryosections bör skyddas mot onödig ljusexponering för att undvika blekning av GFP-fluorescensen.
5. Mikroskopisk analys av cryosections
- Rehydrera cryosections i pH 7.4 PBS på RT i 10 min.
Obs: Vid behov kan atomkärnor färgas med Hoechst. - Använd en 0,5 μg/ml Hoechst-lösning i PBS och inkubera kryosections i 15 minuter.
- Skölj bilderna 3x med pH 7,4 PBS i 5 min.
- Fortsätt till glidmonteringen. En pH 7.4 (eller mer grundläggande) polyvinylalkoholmonteringslösning som härdar O/N kan användas: placera försiktigt täckglaset för att undvika bildandet av luftbubblor mellan glidningen och täckglaset.
- Låt monteringsmediet härda O/N vid 4 °C i mörker.
- Använd ett inverterat konfokalt mikroskop för att exakt visualisera fusionsproteinet pHluorin-plexinA1: utför z-stack vid optimal pinhole och optisk upplösning och använd en 20X (NA 0,75) eller 40X (NA 1.3) linser.
Obs: pHluorin kan detektera med samma parametrar som används för attdetektera GFP (dvs. utsläppstopp vid 509 nm). Våglängdsinställningar för excitations- och detekteringsfilter definieras optimalt av bildframställningsprogrammet. Hoechst detekteras mellan 425-460 nm (excitation är vid 405 nm), GFP eller pHluorin detekteras mellan 485-545 nm (excitation är vid 473 nm) och RFP detekteras mellan 575-675 nm (excitation är vid 559 nm).
Representativa bilder av pHluorin-plexinA1 och eGFP-uttryck i kycklingembryon ryggmärgen visas i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. A. Schemat för pHluorin-plexinA1 fluorescensegenskaper i ett cellulärt sammanhang. PHluorin är icke-fluorescerande i intracellulära fack där pH-talet är surt (<6) såsom vid handel med vesikuler eller i endosomer och är fluorescerande när det utsätts för det extracellulära mediet där pH-talet är neutralt. Detta gör det möjligt att visualisera endast cellytan poolen av pHluorin-plexinA1 receptorn. B. Jag är inte så bra på Karta över pBK-CMV-pHluorin-plexinA1 kloningsplats. Mus receptor plexinA1 uttrycker vektor användes som en ryggrad. Denna vektor konstruerades för att uppnå effektiv VSV-märkt receptor insättningspunkten vid plasma membranet. För att göra det smältes semaforin 3a peptidsignal och klyvning webbplats uppströms av VSV-märkta receptorn ablated från sin egen signal peptid och klyvning webbplats. PHluorin-sekvensen infogades i bildrutan mellan VSV-taggen och PlxnA1-kodningssekvenserna med hjälp av nruI/Kpn2I-begränsningsplatser. Enskilda begränsningsplatser är indicerat för att utforma kloningsstrategin för andra receptorer. Systemet är anpassat från bioinformatisk programvara.
Figur 2. Karakterisering av pHluorin-plexinA1 konstruera pH-beroende fluorescerande egenskaper i COS7 celler. A. COS7 celler transfected med pHluorin-plexinA1 konstruktion där observeras med ett konfokal mikroskop möjliggör visualisering av pHluorin-plexinA1 fluorescens vid plasmamembranet. Skalstång: 20 μM. B. COS7-celler transfecterade med pHluorin-plexinA1-konstruktionen där de observeras genom levande avbildning i ett pH 7.4 odlingsmedium, efter försurning av odlingsmediet upp till pH 5.5 och efter restaurering av pH 7.4 i odlingsmediet. Cellkonturer indikeras med en streckad linje på GFP fluorescens förvärv. Skalbar: 10 μM. Klicka här för att se större bild.
Figur 3. In ovo elektroporering förfarande. A. 1. Albumen borttagning från den största sidan av skalet. 2. Fönsterning av äggskalet för att komma åt embryot. B. Jag är inte så bra på DNA/Fast Green blandningsinjektion i neuralröret. C. Placera elektroder på vardera sidan av neuralröret, undvika hjärtat och stora kärl och elektroporering av kycklingembryon.
Figur 4. Mikroskopisk analys av chick neurala rör cryosections efter pHluorin-plexinA1 elektroporering. En jämförelse mellan eGFP (övre paneler) och pHluorin-plexinA1 (nedre paneler) uttryck mönster i den elektroporerade chick ryggmärgen visas. Förstorade paneler visar den membranösa fluorescensen av pHluorin-plexinA1 (a') jämfört med den diffusa subcellulära lokaliseringen av eGFP (a). När det gäller plexinA1 visar den utvidgade panelen att denna receptor är särskilt berikad vid plasmamembranet vid golvplåtskorsning (b') vilket inte är fallet för eGFP som uttrycks lika före och efter golvplåtskorsning (b). Skalstänger: 100 μM. FP: Golvplatta; Före: Precrossing; Inlägg: Eftercross. Klicka här om du vill visa större bild.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger ett steg-för-steg förfarande för att följa dynamiken i en axon vägledning receptor både i cell kultur och i utvecklingsmässiga sammanhang av kyckling embryo ryggmärg.
För att utforma ett de novo pHluorin-märkt protein måste två punkter beaktas när det gäller kloningsstrategin. För det första bör pHluorin-taggen utsättas för lumen i de sura endosomerna, och följaktligen för det extracellulära facket för att visualisera plasmamembranreceptorpoolen. Således är korrekt positionering av pHluorinsekvensen avseende receptorsekvensen direkt beroende av vilken typ av receptorsom studeras ( dvs. om N-terminalen eller C-terminaldelen av receptorn utsätts för det extracellulära facket). För det andra, som förklaras i protokollet, bör pHluorin-sekvensens position i förhållande till signalpeptiden övervägas för att undvika efterföljande klyvning mellan pHluorin och intressereceptorn.
En begränsning av tekniken är kopplad till handeln med receptorerna efter aktiveringen vid plasmamembranet. Vanligtvis internaliseras receptorer och utvecklas genom den endocytiska vägen som består av funktionellt och fysiskt distinkta fack15. På grund av ATP-drivna protonpumpar upprätthåller endosomer ett surt pH runt 6 i tidiga endosomer, cirka 5 i sena endosomer, lägre än 5 i lysosomer, men bara cirka 6,4 i återvinningsendosomer eller 7,0 i grottosomer som tillåter fluorescens i dessa två endosomiska fack. Det här problemet kan lösas in vitro med hjälp av totalt internt reflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi16. En andra begränsning som är inneboende i denna teknik är att pHluorin-taggen på grund av sin relativt stora storlek kan störa receptoraktiviteten, beroende på tagginsättningsstället.
Trots dess fördelar, pHluorin har inte använts i stor utsträckning för att studera dynamiken och regleringen av membranproteiner under axon navigering. Seminal arbeten har använt pHluorin för att studera spatio-temporal dynamiken av exocytos under tillväxt kon roterande in vitro17. I det nuvarande protokollet illustrerar vi hur pHluorin kan användas för att undersöka fördelningen av receptorer vid plasmamembranet av axoner in vivo. Eftersom pHluoriner är genetiskt kodade är de särskilt lämpliga för in vivo-analys. Även om vi beskriver dess användning hos kyckling efter in ovo-elektroporering, kan detta tillvägagångssätt användas i andra arter. Faktum är att elektroporering fungerar effektivt i olika djurmodeller18,19. Dessutom har pHluorins framgångsrikt använts i C. elegans, Drosophila, eller mus transgena djur20-23.
Eftersom pH-beroende förändring sker i millisekvisekunderna är pHluorins särskilt anpassade för levande avbildning6,24. PHluorin fusion har till exempel använts för att övervaka in vivo dynamiken i synaptobrevin exocytoosis i luktsensoriska nervceller från transgena möss23. In vivo live imaging av pHluorin fusioner håller ett stort löfte som confocal mikroskop anpassade till levande avbildning (snabb bildbehandling och låg fototoxicitet) blir effektivare och tillgängliga25. Live imaging in vivo kan också kombineras med fluorescens återhämtning efter fotobleaching (FRAP) så att exocytos eller diffusion kunde bedömas mer direkt26.
Användningen av andra pH-känsliga varianter och deras kombinationer kan ytterligare utöka tillämpningsområdet. Den dynamiska fördelningen av receptorn i olika organeller kan övervakas med hjälp av ratiometriskt pHluorin som ändrar fluorescens enligt pH i facket6,27. På samma sätt kan tillsats av ett pH-okänsligt fluorescerande protein till ett membranprotein som smälts till ett ekliptiskt pHluorin ge viktiga insikter om dess handel28. Dessutom kommer den senaste kloningen av pHtomato29 att möjliggöra övervakning av två receptorer samtidigt. Detta kan ge viktiga insikter om bildandet av receptorkomplex. Eftersom pHluorin också kan användas för att tagga vägledningssignaler30, dubbel avbildning av ligand, och dess receptor är också genomförbar.
I detta protokoll är uttryckshastigheten för fusionsproteinet en kritisk punkt och beror särskilt på promotorns styrka, fusionsproteinets stabilitet och mängden plasmid som används för att transfektera cellerna. När fusionsproteiner överuttrycks kan de ackumuleras i intracellulära blåsor och en fluorescerande bakgrund kan förekomma. Således kan flera optimeringar vara nödvändiga för att uppnå en exakt visualisering av pHluorin smält protein vid cellytan. Dessutom kräver användningen av pHluorinfusionsprotein i fast vävnad särskild försiktighet under och efter fixeringen. Stabiliseringen av konformationerna av pHluorin fusion proteiner kan bara vara tillfällig. PH måste därför hållas över 7 för att förhindra förlust av pHluorinsignalen. Dessutom måste observationer göras kort efter fixering. Optimal timing kan behöva definieras av användare enligt deras specifika pHluorin fusion protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Homaira Nawabi, Frederic Moret och Isabelle Sanyas för deras hjälp. Detta arbete stöds av CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA till V.C.; C.D-B och A.J stöds av en La Ligue contre le cancer respektive Labex DevWeCan stipendier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
