Summary
Vi beskriver her brugen af en pH-følsom grøn fluorescerende proteinvariant, pHluorin, til at studere spatio-tidsmæssig dynamik axon vejledning receptorer handel på celleoverfladen. Den pHluorin-mærkede receptor udtrykkes både i cellekultur og in vivoved hjælp af elektroporation af kyllingembryoet.
Abstract
Under udviklingen spiller axon-vejledningsreceptorer en afgørende rolle i reguleringen af axoners følsomhed over for både attraktive og frastødende signaler. Faktisk er aktivering af vejledningsreceptorerne det første trin i signalmekanismerne, der tillader axonspidser, vækstkeglerne, at reagere på liganderne. Som sådan er gradueringen af deres tilgængelighed på celleoverfladen en af de mekanismer, der deltager i fastsættelsen af vækstkeglernes følsomhed. Vi beskriver her en metode til præcist at visualisere spatio-temporal celleoverfladedynamik af en axon-vejledningsreceptor både in vitro og in vivo i den udviklende chick rygmarv. Vi udnyttede den pH-afhængige fluorescensegenskab for en grøn fluorescerende proteinvariant (GFP) til specifikt at detektere den brøkdel af axonvejledningsreceptoren, der er adresseret til plasmamembranen. Vi beskriver først in vitro-valideringen af sådanne pH-afhængige konstruktioner, og vi beskriver yderligere deres anvendelse in vivo, i chick spinal akkord, for at vurdere den spatio-tidsmæssige dynamik i axon-vejledningsreceptoren af interesse.
Introduction
Under deres navigation integrerer axoner flere miljømæssige signaler, der guider dem mod deres mål. Disse signaler aktiverer styrereceptorer på overfladen af axonterminaler, vækstkeglerne, som igen starter en passende signalvej. Således er den tidsmæssige og rumlige regulering af receptorernes celleoverfladefordeling afgørende for at indstille følsomheden af vækstkeglerne1. I denne sammenhæng er midterlinjeovergang med commissural axoner en fremragende model til at undersøge reguleringen af receptorcelleoverfladeniveauer. I den udviklende rygmarv tiltrækkes commissural axoner i første omgang mod den ventrale gulvplade, hvor de krydser midterlinjen. Efter krydsning mister de deres lydhørhed over for gulvpladens tiltrækningskraft og får respons på gulvpladeafvisende midler, så de kan forlade gulvpladen og navigere mod deres endelige destination i den kontralaterale side af nervesystemet2,3. Regulering af receptortilgængelighed på vækstkegleroverfladen er en af de mekanismer, der ligger til grund for skiftet af reaktionsevne til midterlinjesignaler4,5. Således er selektiv overvågning af de receptorer, der er til stede ved plasmamembranen af vækstkegler, af største betydning. Vi beskriver her en metode baseret på den pH-afhængige fluorescensegenskab af en grøn fluorescerende protein (GFP) variant til specifikt at visualisere axon-vejledningsreceptorerne, der er adresseret til plasmamembranen in vitro og in vivo, i den udviklende chick rygmarv.
Rothman og kolleger manipuleret af punkt mutationer pH-følsomme varianter af GFP herunder ekliptika pHluorin6. Ekliptisk pHluorin har den egenskab, at den ikke er fluorescerende, når den udsættes for sur pH (<6), samtidig med at den er fluorescerende ved neutral pH. Dette gør det muligt at skelne ikkefluorescerende receptorer, der er lokaliseret i intracellulære sure rum(dvs. endosomer, menneskehandelsvesikler) fra fluorescerende receptorer, der er indbygget i plasmamembranen og dermed udsat for den ekstracellulære neutrale pH7. Vi benyttede os af dette til at overvåge plasmamembranlokaliseringen af plexinA1, en axon-vejledningsreceptor, der formidler vækstkeglerresponsen på den midline-afvisende semaphorin 3B5 (Figur 1A). Vi beskriver her in vitro karakterisering af en pHluorin-plexinA1 konstruere, sammen med in ovo elektroporation8-10 af denne konstruktion i udviklingslandene chick rygmarv efterfulgt af mikroskopiske analyse af cryosections som gør det muligt at følge axon vejledning receptor dynamik in vivo med både rumlige og tidsmæssige opløsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning strategi for tag PlexinA1 receptor med pHluorin
- Vælg en passende udtryksvektor som rygrad(f.eks. musereceptoren plexinA1, der udtrykker vektor, en slags gave fra Dr. Andreas Puschel11).
Bemærk: Denne plexinA1 vektor blev udviklet til at opnå effektiv HA- eller VSV-mærket receptorindføring i plasmamembranen. - Forstærk den ekliptiske pHluorin-kodningssekvens ved hjælp af den passende plasmid som skabelon(f.eks. pHluorin-mærket GABA A-receptor, en slags gave af Dr. Jacob2). Hvis det er nødvendigt, skal du tilføje et begrænsningssted til primerens 5'er for at lette kloningstrinnet i rygraden.
- PHluorin-sekvensen indsættes i rammen mellem signalpeptid og receptorkodningssekvensen ved hjælp af begrænsningssteder(f.eks. nruI/Kpn2I-begrænsningssteder som beskrevet i figur 1B).
Bemærk: Da signalets peptid, der sikrer korrekt målretning af receptorerne, kløves, skal pHluorin placeres efter det. Dette berettiger til anerkendelse af signalet peptid og forhindrer kavalergang af pHluorin fra receptoren af interesse. - Sekvens de konstruktioner opnået for at sikre, at ingen mutation blev indført ved PCR.
2. Karakterisering af pHluorin-mærket receptor in vitro i COS7-celler
Fusionsproteinets evne til at nå plasmamembranen og dens reversible tab af fluorescens, efterhånden som pH sænkes, kan bekræftes ved hjælp af følgende procedure.
- Dag 1. Plade 1,5 x 105 COS7 celler i en glasbundet 35 mm skål i 2 ml komplet Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM - 10% Føtalt kvæg serum - 1 mM natrium pyruvat - 25 U/ml penicillin/stretomycin - 2,5 μg/ml Amphotericin B - pH 7,4).
- Dag 2. Overfør celler:
Bemærk: Cellerne skal være 70-80% sammenflydende.- Der fremstilles 200 μl NaCl 150 mM, og der tilsættes 3 μg DNA, dvs. Forsigtigt vortex og spin ned kort.
Bemærk: Et kort over den pHluorin-plexinA1-vektor, der anvendes i disse forsøg, er vist i figur 1B. - Der tilsættes 10 μl transfektreagens (eller den relevante mængde af det anvendte reagens). Vortex med det samme.
- Inkuber 10 min på RT.
- Der tilsættes 200 μl af transfektreagenset/DNA-blandingen til cellerne.
- Hæld forsigtigt pladen af for at opnå ompartition af blandingen, og placer cellerne tilbage til 37 °C inkubatoren.
- Der fremstilles 200 μl NaCl 150 mM, og der tilsættes 3 μg DNA, dvs. Forsigtigt vortex og spin ned kort.
- Dag 3. Transfektmediet fjernes, og det udskiftes med 2 ml frisk komplet DMEM.
- Dag 4. Udfør dynamisk cellebilleddannelse af COS7 pHluorin-plexinA1 transfected celler:
- Forbered to aliquots af DMEM komplet medium og justere pH til 3,5 og til 9,5, hhv.
Bemærk: For en plade på 35 mm er 1,5 ml af hver opløsning nødvendig for at udføre forsøget. - Cellemediet fjernes, og det erstattes med 1 ml DMEM komplet medium pH 7.4.
- Forbered en 5 ml sprøjte med en passende type slange for at injicere forskellige komponenter direkte i cellekulturmediet uden at åbne mikroskopkammeret.
- Brug et modul, der gør det muligt at opretholde en fugtig arbejdsatmosfære på 37 °C, 5% CO2.
Bemærk: En alternativ tilgang til brugen af et CO2-kammer er at bruge HEPES-buffermedium (normalt i området 10-25 mM afhængigt af celletypen). - Placer cellerne i kammeret og juster slangen og sprøjten.
Bemærk: Mikroskopet skal være ekvilibreret, før det begynder at undgå mekanisk afdrift under optagelsen. - Åbn billedbehandlingssoftwaren, og vælg det flerdimensionale anskaffelsesprogram.
- Find transfected COS7 celler med 40X mål og mærke position i softwaren for hver af dem.
- Konfigurer Z-stakken for at få en 15 μm dybdeerhvervelse (fokus kan ændre sig, når der tilføjes medier i pladen).
- Konfigurer eksponering for GFP-filteret og fasen.
- Konfigurer anskaffelsestidspunktet.
Bemærk: For hele eksperimentet med 5 interesseområder bør erhvervelse hvert 20 sek. i 10 min være tilstrækkeligt. - Start erhvervelse og tage 5 kontrol billeder i DMEM pH 7,4 medium.
- Pause erhvervelse, injicere 1,25 ml pH 3,5 komplet DMEM at opnå en pH-værdi på 5,5 i kulturmediet, mærke begivenhed i softwaren og genoptage erhvervelsen for 5 flere tidspunkter.
Bemærk: Grøn fluorescens bør gradvist forsvinde. - Pause erhvervelse, injicere 1,2 ml pH 9,5 komplet DMEM at opnå en pH 7,4 i kulturmediet, mærke begivenhed i softwaren og genoptage erhvervelsen for 5 flere tidspunkter.
Bemærk: Grøn fluorescens skal dukke op igen ved plasmamembranen. - Analyser billeder.
Figur 2 viser repræsentative billeder opnået med en sådan protokol med pHluorin-plexinA1-konstruktionen.
- Forbered to aliquots af DMEM komplet medium og justere pH til 3,5 og til 9,5, hhv.
3. I ovo Elektroporation af pHluorin-plexinA1 Konstruktion
- Håndtering af æg før elektroporation:
- Befrugtede æg opbevares i køleskab ved 14 °C op til en uge før inkubation.
- Rugeæg ved 38,5 °C i en inkubator med mættet fugtighed i 50-52 timer, indtil embryonerne når fase HH1412.
Bemærk: Æggene skal placeres vandret under inkubationen, så embryoet er korrekt placeret til elektroporation, der flyder på toppen af æggeblommen. HH14 fase er egnet til at opnå udtryk for plasmider i differentierede neuroner i rygmarven og i rygroden ganglion med en passende overlevelsesrate.
- Elektroporatembryoner8-10:
- Forbered elektroporation:
- Forbered endotoksinfrie DNA-plasmider med en koncentration, der er højere end 2 μg/μl, for at kunne fortynde den som den ønskede koncentration.
- Træk nok glas kapillærer til at injicere de forskellige DNA-løsninger.
- Steril PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicillin/streptomycin og ækvilibreres ved 38,5 °C.
- Steriliser emhætten, buet saks og fine pincet.
- Styr elektrodeafstanden.
Bemærk: Der anvendes normalt et mellemrum på 4 mm mellem elektroderne.
- Vindue ægget13 (Figur 3A):
- Brug buet saks til at gennembore skallen på den stumpe side af ægget.
- Der fjernes 2 ml albumen med en 0,9 mm x 25 mm nål og en 5 ml sprøjte. Orientere nålen lodret for at undgå at beskadige æggeblommesækken.
- Dæk toppen af ægget med tape for at opretholde skallens integritet.
- Brug buet saks, gennembore skallen i midten af båndet for at udligne trykket, når du fjerner 2 ml albumen fra ægget. Skær derefter et vindue stort nok til at visualisere embryoet og være i stand til at arbejde på det.
- Der tilsættes ~2 ml steril varm PBS (-Ca2+; -Mg2+) - 100 U/ml penicillin/streptomycin for at undgå dehydrering af embryoet og gøre det mere tilgængeligt for manipulatoren.
- Injicere DNA og elektroporate embryoet
- Fortyndet plasmid i PBS (-Ca2+; -Mg2+) til en koncentration mellem 0,5-2 μg/μl og tilsæt hurtigt grønt farvestof for at nå en endelig koncentration på 0,025%. Lad DNA-blandingen i en kapillær. Det anbefales at bruge en injektor.
Bemærk: Kontroller, at kapillærbestandigheden hverken er for stor (hvilket betyder, at der kan være problemer med injektion af embryoner) eller for lille (hvilket betyder, at kapillæren kan være for stor og kan beskadige embryoet). Koncentrationen af nukleinsyrer på over 2 μg/μl kan også forårsage uspecifikke virkninger og skal kontrolleres. - Punkter æggeblomme-sæk og neuralrør på kaudale side med lastet kapillær. Indtast neuralrøret med en lav vinkel og fyld lumen fra halen til hovedet med DNA-blandingen (Figur 3B).
Bemærk: Hurtig grøn gør det muligt at kontrollere nøjagtigheden af injektionen. - Placer hurtigt 4 mm platinelektroderne på hver side af neuralrøret på det niveau, du ønsker at elektroporat og anvende 3 impulser ved 31 V for 50 msec med 500 msec intervaller(Figur 3C).
Bemærk: Undgå at placere elektroderne på hjertet eller på store ekstra embryonale beholdere for at undgå at beskadige det udviklende embryo. Bobler skal dannes på elektroderne. - Med nålen fjernes 2 ml albumen for at reducere niveauet i skallen.
- Forsegl vinduet og den stumpe side hermetisk med tape.
- Læg æggene tilbage ved 38,5 °C i inkubatoren, indtil de når det ønskede stadium.
- Fortyndet plasmid i PBS (-Ca2+; -Mg2+) til en koncentration mellem 0,5-2 μg/μl og tilsæt hurtigt grønt farvestof for at nå en endelig koncentration på 0,025%. Lad DNA-blandingen i en kapillær. Det anbefales at bruge en injektor.
- Forbered elektroporation:
4. Embryoner Indlejring og cryosectioning
- 48 timer efter elektroporation, høst forsigtigt elektroporated embryoner (HH24 fase). Skær båndet og halvdelen af chorioallantoidmembranen. For at forhindre embryoner i at synke ned i æggeblommen, skal du placere en kolander under embryoet og skære anden halvdel af chorioallantoidmembranen.
- Overfør embryoet til en dissektionsskål fyldt med iskold PBS.
- Kontroller elektroporationseffektiviteten ved at lede efter fluorescens i neuralrøret med et fluorescens stereomikroskop.
Bemærk: Coelectroporation af en kontrolplasmidkodning af RFP'en kan bidrage til at visualisere det elektroporatede område. - Dissekere embryoner ved hjælp af en mikroskalpel for at vælge det elektroporated område af rygmarven.
- Dissekerede embryoner overføres til en 24-brønds plade, og der fastgøres i pH 7,4 4% Paraformaldehyd (PFA) - Fosfat Buffer Saline (PBS), O/N ved 4 °C.
Bemærk: Fikseringstrin er afgørende for at muliggøre stabilisering af pHluorin i dets "levende" kropsbygning og dermed være i stand til at bruge pHluorin i fast / gennemtrængelig væv. Selvom fikseringen bremser drastisk pH-afhængig ændring af fluorescens, må man tage højde for, at konformationsmæssige / protonationsændringer stadig kan forekomme efter fiksering. Således skal følgende protokol (indlejring, kryossektioner og observation) udføres inden for 3 dage efter fikseringstrinnet med alle buffere ved pH 7. Hvis fiksering ikke er påkrævet, anbefales det at udføre observation på levende vævssektioner. - Fjern 4% PFA og vask embryoner i pH 7,4 PBS.
- Embryoner inkuberes i PBS-15% saccharose og opbevares ved 4 °C, indtil embryonerne synker.
- Der inkuberes faste embryoner i pH-7,4 7,5% gelatine- 15% saccharose i 45 minutter ved 37 °C, så embryoner er helt indlejret.
- Placer indlejring forme på is og tilsæt 400 μl pH 7,4 7,5% gelatine-15% saccharose for at opnå en solid 2 mm base.
- Indsug det indlejrede embryo med en skåret spids og læg embryoet på den faste gelatinebase.
- Dæk med pH 7,4 7,5% gelatine- 15% saccharose og placere embryoet med pincet, før gelatine størkner.
- Når gelatinen er fast, tilberedes et isopropanolbad på -40 °C (tøris eller flydende nitrogen) og gelatineblokken fryses i 5 min.
- De frosne blokke opbevares ved -80 °C.
- Den frosne blok anbringes ved -20 °C i 1 time.
- Fjern formen og fastgør blokken på en chuck med et polyethylen glykol medium.
- Når blokken er tæt fastgjort, skal du placere spændet i kryostatsystemet.
Bemærk: Brug belagte lysbilleder for at undgå vævstab under farvning. - Udfør serielle kryosektioner (20 μm cryosections udføres normalt).
- Lad kryosections tørre i 15 min på RT.
Bemærk: Kryosections bør beskyttes mod unødvendig lyseksponering for at undgå blegning af GFP-fluorescensen.
5. Mikroskopisk analyse af cryosections
- Rehydrering cryosections i pH 7,4 PBS ved RT i 10 min.
Bemærk: Hvis det er nødvendigt, kan kerner farves med Hoechst. - Der anvendes en 0,5 μg/ml Hoechst-opløsning i PBS, og krykussektionerne inkuberes i 15 minutter.
- Skyl rutsjebanerne 3x med pH 7,4 PBS i 5 min.
- Fortsæt med at skubbe tilsting. En pH 7,4 (eller mere grundlæggende) polyvinylalkoholmonteringsopløsning, der hærder O/N, kan anvendes: Placer forsigtigt coverlip'en for at undgå dannelse af luftbobler mellem rutsjebanen og coverlipet.
- Lad monteringsmediet hærde O/N ved 4 °C i mørke.
- Brug et omvendt konfokalt mikroskop til præcist at visualisere pHluorin-plexinA1-fusionsproteinet: Udfør z-stakken ved den optimale pinhole og optiske opløsning, og brug en 20X (NA 0,75) eller 40X (NA 1.3) linser.
Bemærk: pHluorin kan påvises med de samme parametre, der anvendes til at detektere GFP(dvs. emissionstop ved 509 nm). Indstillingerne for bølgelængdeekscitations- og detektionsfilter defineres optimalt af billedbehandlingssoftwaren. Hoechst påvises mellem 425-460 nm (excitation er ved 405 nm), GFP eller pHluorin påvises mellem 485-545 nm (excitation er ved 473 nm), og RFP påvises mellem 575-675 nm (excitation er på 559 nm).
Repræsentative billeder af pHluorin-plexinA1 og eGFP-ekspressionen i kikærtembryoners rygmarv er vist i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1. A. Ordningen for egenskaberne pHluorin-plexinA1 fluorescens i en cellekontekst. PHluorin er ikke-fluorescerende i intracellulære rum, hvor pH-handelen er sur (<6), f.eks. Dette gør det kun muligt at visualisere celleoverfladepuljen for pHluorin-plexinA1-receptoren. B. Kort over kloningsstedet pBK-CMV-pHluorin-plexinA1. Musreceptor plexinA1 udtrykke vektor blev brugt som rygrad. Denne vektor blev udviklet til at opnå effektiv VSV-mærket receptorindsættelse ved plasmamembranen. For at gøre dette blev semaphorin 3a peptidsignal og kavalergangssted smeltet opstrøms for den VSV-mærkede receptor, der blev ablated fra sit eget signalpeptid og kavalergangssted. Ved PCR blev pHluorin-sekvensen indsat i rammen mellem VSV-tag og PlxnA1-kodningssekvenser ved hjælp af NruI/Kpn2I-begrænsningssteder. Enkeltbegrænsningssteder er angivet til udformning af kloningsstrategi for andre receptorer. Ordningen er tilpasset ud fra bioinformatiksoftware.
Figur 2. Karakterisering af pHluorin-plexinA1 konstruerer pH-afhængige fluorescerende egenskaber i COS7-celler. A. Det er ikke så lidt. COS7-celler, der er transfected med pHluorin-plexinA1 konstruere, hvor observeret med en konfokal mikroskop tillader visualisering af pHluorin-plexinA1 fluorescens på plasmamembranen. Skalabjælke: 20 μM. B. COS7-celler transfected med pHluorin-plexinA1 konstruktion, hvor observeret gennem levende billeddannelse i en pH 7,4 kultur medium, efter forsuring af kulturmediet op til pH 5,5 og efter restaurering af pH 7,4 i kulturmediet. Cellekonturer er angivet med en stiplet linje på GFP fluorescens erhvervelse. Skalalinje: 10 μM. Klik her for at se større billede.
Figur 3. I ovo elektroporation procedure. A. Det er ikke så lidt. 1. Albumen fjernelse fra den største side af skallen. 2. Vindue æggeskallen for at få adgang til embryoet. B. DNA/Fast Green mix injektion i neuralrøret. C. Placering af elektroder på begge sider af neuralrøret, undgå hjerte og store kar, og elektroporation af kyllingembryoet.
Figur 4. Mikroskopisk analyse af chick neuralrør cryosections efter pHluorin-plexinA1 elektroporation. Der vises en sammenligning mellem eGFP (øverste paneler) og pHluorin-plexinA1 (lavere paneler) udtryksmønster i den elektroporated chick rygmarv. Forstørrede paneler viser den membranøse fluorescens af pHluorin-plexinA1 (a') sammenlignet med den diffuse subcellulære lokalisering af eGFP (a). Med hensyn til plexinA1 viser forstørret panel, at denne receptor er specifikt beriget ved plasmamembranen ved krydsning af gulvplade (b'), hvilket ikke er tilfældet for eGFP, der udtrykkes ligeligt før og efter krydsning af gulvplade (b). Skalastænger: 100 μM. FP: Gulvplade; Pre: Precrossing; Post: Eftercrossing. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en trin-for-trin procedure for at følge dynamikken i en axon vejledning receptor både i cellekultur og i den udviklingsmæssige sammenhæng af chick embryo rygmarven.
For at designe et de novo pHluorin-mærket protein skal der tages hensyn til to punkter vedrørende kloningsstrategien. For det første bør pHluorin-mærket udsættes for lumen af de sure endosomer og dermed for det ekstracellulære rum for at visualisere plasmamembranreceptorpuljen. Den korrekte placering af pHluorin-sekvensen vedrørende receptorsekvensen afhænger således direkte af den undersøgte type receptor(dvs. om N-terminalen eller C-terminaldelen af receptoren udsættes for det ekstracellulære rum). For det andet bør placeringen af pHluorin-sekvensen i forhold til signalpeptid som forklaret i protokollen anses for at undgå efterfølgende kavalergang mellem pHluorin og den pågældende receptor.
En begrænsning af teknikken er forbundet med handel med receptorerne efter deres aktivering ved plasmamembranen. Almindeligvis er receptorer internaliseret og fremskridt gennem den endocytic vej består af funktionelt og fysisk adskilte rum15. På grund af ATP-drevne protonpumper opretholder en endosomer en sur pH omkring 6 i tidlige endosomer, omkring 5 i sene endosomer, lavere end 5 i lysosomer, men kun omkring 6,4 i genanvendelse af endosomer eller 7,0 i hulosomer, der tillader fluorescens i disse to endosomale rum. Dette problem kan løses in vitro ved hjælp af total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi16. En anden begrænsning, der er forbundet med denne teknik, er, at pHluorin-tag på grund af sin relativt store størrelse kan forstyrre receptoraktiviteten afhængigt af tagindsættelsesstedet.
På trods af sine fordele er pHluorin ikke blevet brugt i vid udstrækning til at studere dynamikken og reguleringen af membranproteiner under axonnavigation. Skelsættende værker har brugt pHluorin til at studere den spatio-tidsmæssige dynamik af exocytose under vækstkegler, der drejer in vitro17. I denne protokol illustrerer vi, hvordan pHluorin kan bruges til at undersøge fordelingen af receptorer ved plasmamembranen af axoner in vivo. Da pHluoriner er genetisk kodet, er de særligt velegnede til in vivo-analyse. Selvom vi beskriver dets anvendelse i kylling efter in ovo elektroporation, kan denne tilgang bruges i andre arter. Faktisk fungerer elektroporation effektivt i forskellige dyremodeller18,19. Derudover er pHluoriner med succes blevet brugt i C. elegans, Drosophilaeller mus transgene dyr20-23.
Da pH-afhængig ændring sker i millisekundområdet, er pHluorinerne særligt tilpasset til levende billeddannelse6,24. PHluorin fusion er for eksempel blevet brugt til at overvåge in vivo dynamikken i synaptobrevin exocytose hos olfaktoriske sensoriske neuroner fra transgene mus23. In vivo live billeddannelse af pHluorin-fusion rummer betydelige løfter, efterhånden som konfokale mikroskoper, der er tilpasset levende billeddannelse (hurtig billeddannelse og lav fototoksicitet), bliver mere effektive og tilgængelige25. Levende billeddannelse in vivo kan også kombineres med fluorescensgenvinding efter fotobleaching (FRAP), således at exocytose eller diffusion kan vurderes mere direkte26.
Brugen af andre pH-følsomme varianter og deres kombinationer kan yderligere udvide antallet af applikationer. Receptorens dynamiske fordeling i forskellige organeller kunne overvåges ved hjælp af ratiometrisk pHluorin, der ændrer fluorescens i henhold til pH-rum6,27. På samme måde kan tilsætningen af et pH-ufølsomt fluorescerende protein til et membranprotein, der er smeltet til en ekliptisk pHluorin, give vigtig indsigt i dets handel28. Derudover vil den nylige kloning af pHtomato29 gøre det muligt at overvåge to receptorer samtidigt. Dette kan give vigtig indsigt i dannelsen af receptorkomplekser. Da pHluorin også kan bruges til at mærke vejledning cues30, dobbelt billeddannelse af ligand, og dens receptor er også muligt.
I denne protokol er udtrykshastigheden for fusionsproteinet et kritisk punkt og afhænger især af initiativtagerens styrke, fusionsproteinets stabilitet og mængden af plasmid, der bruges til at transfektere cellerne. Når fusionsproteiner overekspresseres, kan de ophobes i intracellulære vesikler, og der kan forekomme en lysstofrørsbaggrund. Således kan flere optimeringer være nødvendige for at opnå en præcis visualisering af det pHluorin-smeltede protein på celleoverfladen. Desuden kræver brugen af pHluorin-fusionsprotein i fast væv særlig omhu under og efter fiksering. Stabiliseringen af overensstemmelserne mellem pHluorin-fusionsproteiner kan kun være midlertidig. PH-værdien skal således holdes over 7 for at forhindre tab af pHluorin-signalet. Desuden skal der fremsættes bemærkninger kort tid efter fikseringen. Det kan være nødvendigt at definere den optimale timing af brugerne i henhold til deres særlige pHluorin-fusionsprotein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Homaira Nawabi, Frederic Moret og Isabelle Sanyas for deres hjælp. Dette arbejde understøttes af CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA til V.C.; C.D-B og A.J støttes af henholdsvis en La Ligue-contre le cancer og Labex DevWeCan-stipendier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
