Summary
Se describe aquí el uso de una variante de proteína fluorescente verde sensible al pH, pHluorin, para estudiar la dinámica espacio-temporal de los receptores de guía de axones que se trafficking en la superficie celular. El receptor marcado con pHluorin se expresa tanto en cultivo celular como in vivo,utilizando la electroporación del embrión de pollito.
Abstract
Durante el desarrollo, los receptores de guía de axones juegan un papel crucial en la regulación de la sensibilidad de los axones a las señales atractivas y repulsivas. De hecho, la activación de los receptores de guía es el primer paso de los mecanismos de señalización que permiten que las puntas de los axones, los conos de crecimiento, respondan a los ligandos. Como tal, la modulación de su disponibilidad en la superficie celular es uno de los mecanismos que participan en el establecimiento de la sensibilidad del cono de crecimiento. Describimos aquí un método para visualizar exacto la dinámica espacio-temporal de la superficie de la célula de un receptor de la dirección del axón in vitro e in vivo en la médula espinal del polluelo que se desarrolla. Aprovechamos la propiedad de fluorescencia dependiente del pH de una variante de proteína fluorescente verde (GFP) para detectar específicamente la fracción del receptor de guía de axones que se dirige a la membrana plasmática. Primero describimos la validación in vitro de tales construcciones dependientes del pH y detallamos aún más su uso in vivo,en la cuerda espinal del polluelo, para evaluar la dinámica espacio-temporal del receptor de guía de axones de interés.
Introduction
Durante su navegación, los axones integran múltiples señales ambientales que los guían hacia su objetivo. Estas señales activan los receptores de guía en la superficie de los terminales de los axones, los conos de crecimiento, que a su vez inician una vía de señalización adecuada. Por lo tanto, la regulación temporal y espacial de la distribución de la superficie celular de los receptores es fundamental para establecer la sensibilidad del cono de crecimiento1. En este contexto, el cruce de la línea media por axones comisurales es un excelente modelo para investigar la regulación de los niveles de superficie celular del receptor. En la médula espinal en desarrollo, los axones commissurales son inicialmente atraídos hacia la placa del piso ventral donde cruzan la línea media. Después del cruce, pierden su capacidad de respuesta a los atrayentes de la placa del piso y ganan respuesta a los repelentes de la placa del piso para que puedan salir de la placa del piso y navegar hacia su destino final en el lado contralateral del sistema nervioso2,3. La regulación de la disponibilidad del receptor en la superficie del cono de crecimiento es uno de los mecanismos subyacentes al cambio de capacidad de respuesta a las señales de la línea media4,5. Por lo tanto, la monitorización selectiva de los receptores presentes en la membrana plasmática de los conos de crecimiento es de primordial importancia. Se describe aquí un método basado en la propiedad de fluorescencia dependiente del pH de una proteína fluorescente verde (GFP) variante para visualizar específicamente los receptores de guía axón que se dirigen a la membrana plasmática in vitro e in vivo,en el desarrollo de la médula espinal polluelo.
Rothman y sus colegas diseñados por mutaciones puntuales variantes sensibles al pH de GFP, incluida la eclíptica pHluorin6. La pHluorgina eclíptica tiene la propiedad de ser no fluorescente cuando se expone al pH ácido (<6), mientras que es fluorescente a pH neutro. Esto permite distinguir los receptores no fluorescentes localizados en compartimentos ácidos intracelulares(es decir, endosomas, vesículas de tráfico) de los receptores fluorescentes incorporados a la membrana plasmática y, por lo tanto, expuestos al pH neutro extracelular7. Aprovechamos esto para monitorizar la localización de la membrana plasmática de plexinA1, un receptor de guía axón que media la respuesta del cono de crecimiento a la semaforina repelente de línea media 3B5 (Figura 1A). Se describe aquí la caracterización in vitro de una construcción de pHluorin-plexinA1, junto con en ovo electroporación8-10 de esta construcción en la médula espinal polluelo en desarrollo seguido por el análisis microscópico de criosecciones que permiten seguir la dinámica del receptor de orientación axón in vivo con resoluciones espaciales y temporales.
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Protocol
1. Estrategia de clonación para etiquetar el receptor PlexinA1 con pHluorin
- Elija un vector de expresión apropiado como columna vertebral(por ejemplo, el vector de expresión del receptor de ratón plexinA1, un regalo amable del Dr. Andreas Puschel11).
Nota: Este vector plexinA1 fue diseñado para lograr la inserción eficiente del receptor ha- o VSV-tagged en la membrana plasmática. - Amplificar por PCR la secuencia de codificación de pHluorin eclíptica utilizando el plásmido adecuado como plantilla(por ejemplo, receptor GABA A marcado con pHluorin, un regalo amable del Dr. Jacob2). Si es necesario, agregue un sitio de restricción al extremo 5' de la cartilla para facilitar el paso de clonación en la columna vertebral.
- Inserte la secuencia de pHluorin en el marco entre el péptido de señal y la secuencia de codificación del receptor utilizando sitios de restricción(por ejemplo, sitios de restricción NruI/Kpn2I como se describe en la Figura 1B).
Nota: Debido a que el péptido de señal que asegura la correcta orientación de los receptores está escindida, el pHluorin debe colocarse después de él. Esto garantiza el reconocimiento del péptido señal y evita la escisión del pHluorin del receptor de interés. - Secuenciar las construcciones obtenidas para asegurar que no se introdujera ninguna mutación por PCR.
2. Caracterización Del Receptor De pHluorin-etiquetado In vitro En Células COS7
La capacidad de la proteína de fusión para llegar a la membrana plasmática y su pérdida reversible de fluorescencia a medida que se reduce el pH se puede confirmar mediante el siguiente procedimiento.
- Día 1. Placa 1,5 x 105 células COS7 en un plato de fondo de cristal de 35 mm en 2 ml de medio de águila modificado de Dulbecco completo (DMEM - 10% suero fetal bovino - piruvato de sodio de 1 mM - 25 U/ml penicilina/estretomicina - 2,5 μg/ml Anfotericina B - pH 7,4).
- Día 2. Células transfectas:
Nota: Las células deben ser 70-80% confluentes.- Prepare 200 μl de NaCl 150 mM y agregue 3 μg de ADN, es decir, el vector que codifica el receptor marcado con pHluorin. Suavemente vórtice y girar hacia abajo brevemente.
Nota: En la Figura 1Bse muestra un mapa del vector pHluorin-plexinA1 utilizado en estos experimentos. - Añadir 10 μl de reactivo de transfección (o la cantidad adecuada del reactivo utilizado). Vórtice inmediatamente.
- Incubar 10 min en RT.
- Añadir 200 μl de la mezcla reactivo/ADN de transfección a las células.
- Mueva la placa suavemente para lograr la repartición de la mezcla y coloque las células de nuevo a la incubadora de 37 °C.
- Prepare 200 μl de NaCl 150 mM y agregue 3 μg de ADN, es decir, el vector que codifica el receptor marcado con pHluorin. Suavemente vórtice y girar hacia abajo brevemente.
- Día 3. Retire el medio de transfección y reemplácelo por 2 ml de DMEM completo fresco.
- Día 4. Realizar imágenes de células vivas de cos7 pHluorin-plexinA1 células transfectadas:
- Preparar dos alícuotas de DMEM medio completo y ajustar el pH a 3,5 y a 9,5, respectivamente.
Nota: Para una placa de 35 mm, se necesitan 1,5 ml de cada solución para realizar el experimento. - Retirar el medio celular y sustituirlo por 1 ml de DMEM pH completo 7.4.
- Prepare una jeringa de 5 ml con un tipo apropiado de tubo para inyectar varios componentes directamente en el medio de cultivo celular sin abrir la cámara del microscopio.
- Utilice un módulo que permita el mantenimiento de una atmósfera de trabajo húmeda de 37 °C, 5% de CO2.
Nota: Un enfoque alternativo para el uso de una cámara de CO2 es utilizar un medio tamponado con HEPES (generalmente en el rango de 10-25 mM según el tipo de célula). - Coloque las células en la cámara y ajuste el tubo y la jeringa.
Nota: El microscopio debe equilibrarse antes de comenzar a evitar la deriva mecánica durante la grabación. - Abra el software de imágenes y seleccione el programa de adquisición multidimensional.
- Encuentre células COS7 transfectadas con el objetivo 40X y marque la posición en el software para cada una de ellas.
- Configure la pila Z para tener una adquisición de profundidad de 15 μm (el enfoque puede cambiar al agregar medios en la placa).
- Configure la exposición para el filtro GFP y la fase.
- Configurar el tiempo de adquisición.
Nota: Para todo el experimento con 5 campos de interés, la adquisición cada 20 segundos durante 10 minutos debería ser suficiente. - Iniciar la adquisición y tomar 5 imágenes de control en DMEM pH 7.4 medio.
- Pausar la adquisición, inyectar 1,25 ml de DMEM completo de pH 3,5 para lograr un pH de 5,5 en el medio de cultivo, marcar el evento en el software y reanudar la adquisición por 5 puntos de tiempo más.
Nota: La fluorescencia verde debe desaparecer progresivamente. - Pausar la adquisición, inyectar 1,2 ml de DMEM completo de pH 9,5 para lograr un pH 7,4 en el medio de cultivo, marcar el evento en el software y reanudar la adquisición por 5 puntos de tiempo más.
Nota: La fluorescencia verde debe reaparecer en la membrana plasmática. - Analizar imágenes.
La Figura 2 muestra imágenes representativas obtenidas con dicho protocolo con el constructo pHluorin-plexinA1.
- Preparar dos alícuotas de DMEM medio completo y ajustar el pH a 3,5 y a 9,5, respectivamente.
3. En ovo Electroporación De pHluorin-plexinA1 Constructo
- Manipulación de huevos antes de la electroporación:
- Guarde los huevos fertilizados en una nevera a 14 °C hasta una semana antes de la incubación.
- Incubar los huevos a 38,5 °C (101,3 °F) en una incubadora con humedad saturada durante 50-52 horas hasta que los embriones alcancen el estadio HH1412.
Nota: Los huevos deben colocarse horizontalmente durante la incubación para que el embrión esté correctamente posicionado para la electroporación, flotando en la parte superior de la yema. El estadio HH14 es adecuado para obtener la expresión de los plásmidos en neuronas diferenciadas de la médula espinal y en el ganglio de la raíz dorsal con una tasa de supervivencia adecuada.
- Embriones electropolados8-10:
- Preparar la electroporación:
- Preparar plásmidos de ADN libres de endotoxinas con una concentración superior a 2 μg/μl, para poder diluirlos como la concentración deseada.
- Tire de suficientes capilares de vidrio para inyectar las diferentes soluciones de ADN.
- Preparar PBS estéril (-Ca2+; -Mg2+)- 100 U/ml de penicilina/estreptomicina y equilibrar a 38,5 °C.
- Esterilizar la capucha, tijeras curvas y fórceps finos.
- Controle el espaciamiento del electrodo.
Nota: Generalmente se utiliza un espacio de 4 mm entre los electrodos.
- Ventana el huevo13 (Figura 3A):
- Use tijeras curvas para perforar la cáscara en el lado romo del huevo.
- Retire 2 ml de albúmina con una aguja de 0,9 mm x 25 mm y una jeringa de 5 ml. Oriente la aguja verticalmente para evitar dañar el saco vitelino.
- Cubra la parte superior del huevo con cinta adhesiva para mantener la integridad de la cáscara.
- Usando tijeras curvas, perfore la cáscara en el centro de la cinta para igualar la presión al retirar 2 ml de albúmina del huevo. Luego, corte una ventana lo suficientemente grande como para visualizar el embrión y poder trabajar en él.
- Añadir ~2 ml de PBS caliente estéril (-Ca2+; -Mg2+)- 100 U/ml de penicilina/estreptomicina para evitar la deshidratación del embrión y hacerlo más accesible al manipulador.
- Inyectar ADN y electropórate el embrión
- Diluir el plásmido en PBS (-Ca2+; -Mg2+)a una concentración entre 0,5-2 μg/μl y añadir colorante verde rápido para alcanzar una concentración final del 0,025%. Cargue la mezcla de ADN en un capilar. Se recomienda el uso de un inyector.
Nota: Compruebe que la resistencia capilar no es demasiado grande (lo que significa que podría haber dificultades al inyectar embriones) ni demasiado pequeña (lo que significa que el capilar podría ser demasiado grande y podría dañar el embrión). Además, la concentración de ácidos nucleicos superior a 2 μg/μl puede causar efectos inespecíficos y debe controlarse. - Perfore el saco vitelino y el tubo neural en el lado caudal con el capilar cargado. Ingrese al tubo neural con un ángulo poco profundo y llene el lumen desde la cola hasta la cabeza con la mezcla de ADN (Figura 3B).
Nota: El verde rápido permite controlar la precisión de la inyección. - Coloque rápidamente los electrodos de platino de 4 mm a cada lado del tubo neural en el nivel que desea electroborrar y aplique 3 pulsos a 31 V durante 50 milisegundos con intervalos de 500 milisegundos(Figura 3C).
Nota: Evite colocar los electrodos en el corazón o en grandes vasos embrionarios adicionales para evitar dañar el embrión en desarrollo. Las burbujas deben formarse en los electrodos. - Con la aguja, retire 2 ml de albúmina para disminuir el nivel en la cáscara.
- Selle la ventana y el lado romo herméticamente con cinta adhesiva.
- Volver a colocar los huevos a 38,5 °C en la incubadora hasta que alcancen la etapa deseada.
- Diluir el plásmido en PBS (-Ca2+; -Mg2+)a una concentración entre 0,5-2 μg/μl y añadir colorante verde rápido para alcanzar una concentración final del 0,025%. Cargue la mezcla de ADN en un capilar. Se recomienda el uso de un inyector.
- Preparar la electroporación:
4. Incrustación de embriones y criosección
- 48 horas después de la electroporación, cosechar cuidadosamente embriones electroporados (etapa HH24). Cortar la cinta y la mitad de la membrana corioallantoidea. Para evitar que los embriones se hundan en la yema, coloque un colador debajo del embrión y corte la segunda mitad de la membrana corioallantoidea.
- Transfiera el embrión a un plato de disección lleno de PBS helado.
- Compruebe la eficiencia de la electroporación buscando fluorescencia en el tubo neural con un microscopio estéreo de fluorescencia.
Nota : La coelectroporación de un plásmido control que codifica la RFP puede ayudar a visualizar el área electroporada. - Diseccione embriones usando un microscalpel para seleccionar el área electroporada de la médula espinal.
- Transferir embriones disecados a una placa de 24 pozos y fijar en pH 7,4 4% Paraformadehído (PFA) - Tampón Fosfato Salino (PBS), O/N a 4 °C.
Nota: La etapa de fijación es crucial para permitir la estabilización de pHluorin en su conformación "viva" y así poder utilizar pHluorin en tejido fijo/permeabilizado. Aunque la fijación retarda drásticamente el cambio dependiente del pH de la fluorescencia, se debe tener en cuenta que los cambios conformacionales /protonación todavía pueden ocurrir después de la fijación. Así, el siguiente protocolo (incrustación, criosecciones y observación) debe realizarse dentro de los 3 días posteriores a la etapa de fijación, con todos los tampones a pH 7. Si no se requiere fijación, se recomienda realizar la observación en secciones de tejido vivo. - Eliminar el 4% de PFA y lavar los embriones en pH 7,4 PBS.
- Incubar embriones en PBS-15% sacarosa y conservar a 4 °C hasta que los embriones se hundan.
- Incubar embriones fijos en pH 7.4 7.5% gelatina- 15% sacarosa durante 45 min a 37 °C para que los embriones estén completamente incrustados.
- Coloque los moldes de incrustación sobre hielo y agregue 400 μl de pH 7.4 7.5% gelatina- 15% sacarosa para lograr una base sólida de 2 mm.
- Aspirar el embrión incrustado con una punta cortada y colocar el embrión sobre la base de gelatina sólida.
- Cubrir con pH 7,4 gelatina al 7,5%, sacarosa al 15% y colocar el embrión con fórceps antes de que la gelatina se solidifique.
- Una vez que la gelatina sea sólida, prepare un baño de isopropanol de -40 °C (use hielo seco o nitrógeno líquido) y congele el bloque de gelatina durante 5 min.
- Mantenga los bloques congelados a -80 °C.
- Coloque el bloque congelado a -20 °C durante 1 hora.
- Retire el molde y fije el bloque en un mandril con un medio de polietilenglicol.
- Una vez que el bloque esté bien fijado, coloque el mandril en el sistema de criostato.
Nota: Use portaobjetos recubiertos para evitar la pérdida de tejido durante la tinción. - Realizar criosecciones seriales (generalmente se realizan criosecciones de 20 μm).
- Deje secar las criosecciones durante 15 min en rt.
Nota: las criosecciones deben protegerse de la exposición innecesaria a la luz para evitar el blanqueo de la fluorescencia de GFP.
5. Análisis microscópico de criosecciones
- Rehidratar criosecciones en pH 7,4 PBS a RT durante 10 min.
Nota: Si es necesario, los núcleos se pueden teñir con Hoechst. - Utilizar una solución de Hoechst de 0,5 μg/ml en PBS e incubar criosecciones durante 15 min.
- Enjuague los portaobjetos 3x con pH 7.4 PBS durante 5 min.
- Proceda al montaje por deslizamiento. Se puede utilizar una solución de montaje de alcohol polivinílico de pH 7.4 (o más básico) que endurece la O/N: coloque cuidadosamente el cubrebocas para evitar la formación de burbujas de aire entre la corredera y la cubierta.
- Deje que el medio de montaje se endurezca O/N a 4 °C en la oscuridad.
- Utilice un microscopio confocal invertido para visualizar con precisión la proteína de fusión pHluorin-plexinA1: realice z-stack a la resolución óptima de agujeros de alfiler y óptico y utilice lentes 20X (NA 0.75) o 40X (NA 1.3).
Nota: pHluorin es detectable con los mismos parámetros utilizados para detectar GFP(es decir, pico de emisión a 509 nm). Los ajustes del filtro de excitación y detección de longitud de onda se definen de forma óptima mediante el software de imágenes. Hoechst se detecta entre 425-460 nm (la excitación está a 405 nm), GFP o pHluorin se detecta entre 485-545 nm (la excitación está a 473 nm) y la RFP se detecta entre 575-675 nm (la excitación está a 559 nm).
Las imágenes representativas de la expresión de pHluorin-plexinA1 y eGFP en la médula espinal del embrión de polluelo se muestran en la Figura 4.
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Representative Results
Figura 1. A. Esquema de las propiedades de fluorescencia pHluorin-plexinA1 en un contexto celular. La PHluorin es no fluorescente en compartimentos intracelulares donde el pH es ácido (<6) como en vesículas de tráfico o en endosomas y es fluorescente cuando se expone al medio extracelular donde el pH es neutro. Esto permite visualizar sólo la reserva de la superficie celular del receptor pHluorin-plexinA1. B. Mapa del sitio de clonación pBK-CMV-pHluorin-plexinA1. El receptor de ratón plexinA1 que expresa el vector se utilizó como columna vertebral. Este vector fue diseñado para lograr la inserción eficiente del receptor marcado vsv en la membrana plasmática. Para hacer tan, la señal del péptido de la semaforina 3a y el sitio de la hendidura fueron fundidos por aguas arriba del receptor VSV-marcado con etiqueta ablación de su propio péptido de la señal y sitio de la hendidura. Por PCR, la secuencia de pHluorin se insertó en trama entre las secuencias de codificación VSV-tag y PlxnA1 utilizando sitios de restricción NruI/Kpn2I. Los sitios de restricción individuales están indicados para diseñar la estrategia de clonación de otros receptores. El esquema está adaptado de software bioinformático.
Figura 2. Caracterización de las propiedades fluorescentes de pHluorin-plexinA1 construir pH-dependiente en las células COS7. A. Las células COS7 transfectadas con la construcción pHluorin-plexinA1 se observaron con un microscopio confocal que permite la visualización de la fluorescencia pHluorin-plexinA1 en la membrana plasmática. Barra de escala: 20 μM. B. Células COS7 transfectadas con la construcción pHluorin-plexinA1 donde se observaron a través de imágenes vivas en un medio de cultivo de pH 7,4, después de la acidificación del medio de cultivo hasta pH 5,5 y después de la restauración de pH 7,4 en el medio de cultivo. Los contornos celulares se indican con una línea discontinua en la adquisición de fluorescencia de GFP. Barra de escala: 10 μM. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. En el procedimiento de electroporación ovo. A. 1. Eliminación de albúmina del lado más grande de la cáscara. 2. Ventanar la cáscara del huevo para acceder al embrión. B. Inyección de mezcla ADN/Fast Green en el tubo neural. C. Colocación de electrodos a ambos lados del tubo neural, evitando el corazón y los grandes vasos, y electroporación del embrión de polluelo.
Figura 4. Análisis microscópico de los cryosections del tubo de los nervios del polluelo después de la electroporación pHluorin-plexinA1. Se muestra una comparación entre el patrón de expresión eGFP (paneles superiores) y pHluorin-plexinA1 (paneles inferiores) en la médula espinal del polluelo electroporado. Los paneles agrandados muestran la fluorescencia membranosa de pHluorin-plexinA1 (a') con respecto a la localización subcelular difusa de eGFP (a). Con respecto a plexinA1, el panel agrandado muestra que este receptor está específicamente enriquecido en la membrana plasmática al cruzar la placa del piso (b'), lo que no es el caso de eGFP que se expresa por igual antes y después del cruce de la placa del piso (b). Barras de escala: 100 μM. FP: Placa de piso; Pre: Precruzamiento; Post: Postcrossing. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para seguir la dinámica de un receptor de guía de axones tanto en cultivo celular como en el contexto de desarrollo de la médula espinal del embrión de polluelo.
Para diseñar una proteína etiquetada con pHluorin de novo, es necesario considerar dos puntos con respecto a la estrategia de clonación. En primer lugar, la etiqueta de pHluorin debe exponerse a la luz de los endosomas ácidos y, en consecuencia, al compartimento extracelular para visualizar la reserva de receptores de membrana plasmática. Por lo tanto, el posicionamiento correcto de la secuencia de pHluorin con respecto a la secuencia del receptor depende directamente del tipo de receptor estudiado (esdecir, si la parte N-terminal o la parte C-terminal del receptor está expuesta al compartimiento extracelular). En segundo lugar, como se explica en el protocolo, la posición de la secuencia de pHluorin en relación con el péptido de la señal debe considerarse para evitar la escisión posterior entre el pHluorin y el receptor de interés.
Una limitación de la técnica está relacionada con el tráfico de los receptores después de su activación en la membrana plasmática. Comúnmente, los receptores se internalizan y progresan a través de la vía endocítica compuesta por compartimentos funcional y físicamente distintos15. Debido a las bombas de protones impulsadas por ATP, los endosomas mantienen un pH ácido alrededor de 6 en los endosomas tempranos, alrededor de 5 en los endosomas tardíos, inferior a 5 en los lisosomas, pero solo alrededor de 6,4 en los endosomas de reciclaje o 7,0 en los caveosomas, lo que permite la fluorescencia en estos dos compartimentos endosómicos. Este problema puede resolverse in vitro utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)16. Una segunda limitación inherente a esta técnica es que, debido a su tamaño relativamente grande, la etiqueta de pHluorin podría interrumpir la actividad del receptor, dependiendo del sitio de inserción de la etiqueta.
A pesar de sus ventajas, la pHluorin no ha sido ampliamente utilizada para estudiar la dinámica y regulación de las proteínas de membrana durante la navegación de axones. Los trabajos seminales han utilizado pHluorin para estudiar la dinámica espacio-temporal de la exocitosis durante el cono de crecimiento que se convierte in vitro17. En el actual protocolo, ilustramos cómo pHluorin se podría utilizar para investigar la distribución de receptores en la membrana plasmática de axones in vivo. Dado que los pHluorins están codificados genéticamente, son particularmente apropiados para el análisis in vivo. Aunque describimos su uso en polluelos después en electroporación ovo, este enfoque se puede utilizar en otras especies. De hecho, la electroporación funciona eficientemente en varios modelos animales18,19. Además, pHluorins se han utilizado con éxito en C. elegans, Drosophila,o animales transgénicos de ratón20-23.
Puesto que el cambio pH-dependiente ocurre en la gama del milisegundo, los pHluorins se adaptan particularmente para la proyección de imagen viva6.24. La fusión de PHluorin se ha utilizado, por ejemplo, para monitorear la dinámica in vivo de la exocitosis de sinaptobrevina en neuronas sensoriales olfativas de ratones transgénicos23. Las imágenes en vivo in vivo de fusiones de pHluorin son considerablemente prometedoras a medida que los microscopios confocales adaptados a las imágenes en vivo (imágenes rápidas y baja fototoxicidad) se vuelven más eficientes y accesibles25. La obtención de imágenes en vivo in vivo también podría combinarse con la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP) para que la exocitosis o la difusión pudieran evaluarse más directamente26.
El uso de otras variantes sensibles al pH y sus combinaciones puede ampliar aún más la gama de aplicaciones. La distribución dinámica del receptor en diferentes orgánulos podría ser monitorizado mediante el uso de pHluorin ratiométrico que cambia la fluorescencia según el pH del compartimento6,27. Del mismo modo, la adición de una proteína fluorescente insensible al pH a una proteína de membrana fusionada con una pHluorin eclíptica podría proporcionar información importante sobre su tráfico28. Además, la reciente clonación de pHtomato29 permitirá la monitorización de dos receptores simultáneamente. Esto podría proporcionar información importante sobre la formación de complejos receptores. Dado que el pHluorin también se puede utilizar para etiquetar las señales de guía30,la proyección de imagen dual del ligand, y su receptor es también factible.
En este protocolo, la tasa de expresión de la proteína de fusión es un punto crítico y depende particularmente de la fuerza del promotor, la estabilidad de la proteína de fusión y la cantidad de plásmido utilizado para transfectar las células. De hecho, cuando se sobreexpresan, las proteínas de fusión pueden acumularse en las vesículas intracelulares y puede aparecer un fondo fluorescente. Por lo tanto, varias optimizaciones pueden ser necesarias para lograr una visualización precisa de la proteína fusionada con pHluorin en la superficie celular. Por otra parte, el uso de la proteína de la pHluorin-fusión en tejido fijo requiere cuidado particular durante y después de la fijación. De hecho, la estabilización de las conformaciones de las proteínas de fusión de pHluorin sólo puede ser temporal. Por lo tanto, el pH debe mantenerse por encima de 7 para evitar una pérdida de la señal de pHluorin. Además, las observaciones deben llevarse a cabo poco después de la fijación. La sincronización óptima puede necesitar ser definida por los usuarios según su proteína particular de la fusión del pHluorin.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Homaira Nawabi, Frederic Moret e Isabelle Sanyas por su ayuda. Este trabajo cuenta con el apoyo de CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B y A.J cuentan con el apoyo de las becas La Ligue contre le cancer y Labex DevWeCan, respectivamente.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio |
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
