मंजिल थाली में जारी सिग्नल के कार्यात्मक संपत्तियों का आकलन करने के लिए वातानुकूलित माध्यम से पृथक मंजिल थाली ऊतक और उत्पादन की संस्कृति

Summary

मंजिल की थाली, रीढ़ की हड्डी के विकास progenitors के लिए प्रसारण संकेतों प्रदान करने और फर्क न्यूरॉन्स की एक महत्वपूर्ण संरचना है. हम मंजिल प्लेट वातानुकूलित माध्यम के उत्पादन के लिए नए सिरे से रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को लागू करने, और जैव रसायन से ब्याज की प्रोटीन पर परिणामों का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन.

Abstract

विकास के दौरान, progenitors और बाद mitotic न्यूरॉन्स उनके भाग्य को नियंत्रित करने वाले सटे प्रदेशों से संकेत प्राप्त करते हैं. मंजिल प्लेट उदर स्थिति में ependymal नहर अस्तर glial कोशिकाओं का एक समूह है. मंजिल प्लेट रीढ़ की हड्डी में सेल प्रजातियों के patterning के लिए योगदान कुंजी morphogens व्यक्त करता है. बाद में विकास के चरणों में, मंजिल प्लेट जोड़ संबंधी axons ¹ से ipsilateral axons और नियंत्रित midline क्रासिंग को पार करने से रोकने के लिए एक बाधा के रूप में अभिनय, रीढ़ की हड्डी में axons की नेविगेशन नियंत्रित करता है. इन कार्यों के विभिन्न मार्गदर्शन cues के स्राव के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं. दूसरों स्थानीय मार्गदर्शन cues ^2,3 करने axons की संवेदनशीलता को व्यवस्थित करना मार्गदर्शन रिसेप्टर्स और बहाव के संकेत विनियमित जबकि इन संकेतों के कुछ बढ़ते axons के लिए attractants और भगाने के रूप में कार्य. यहाँ हम विकास के उद्देश्यों की एक किस्म में फर्श प्लेट निकाली गई संकेतों की संपत्तियों की जांच की अनुमति देता है कि एक विधि का वर्णनमंजिल प्लेट वातानुकूलित मध्यम (एफपी ^{सेमी) 4-6} के उत्पादन पर आधारित lopmental संदर्भों,. हम तो अक्षतंतु मार्गदर्शन के संदर्भ में इस एफपी ^सेमी का उपयोग उदाहरण देना. सबसे पहले, रीढ़ की हड्डी E12.5 पर माउस भ्रूण से अलग है और मंजिल की थाली बाहर विच्छेदित और एक प्लाज्मा थ्रोम्बिन मैट्रिक्स (चित्रा 1) में खेती की जाती है. दूसरा दो दिन बाद, जोड़ संबंधी ऊतक, E12.5 भ्रूण से बाहर विच्छेदित triturated और एफपी ^सेमी के संपर्क में हैं. तीसरा, ऊतक जोड़ संबंधी मार्करों के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए कार्रवाई कर रहे हैं.

Introduction

मंजिल प्लेट progenitors और postmitotic सेल प्रजातियों के विनिर्देशन में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है और अक्षतंतु नेविगेशन ^7,8 को नियंत्रित करने, विकासशील रीढ़ की हड्डी के एक प्रसिद्ध patterning केंद्र है. एफपी ^सेमी का उत्पादन करने के लिए यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया जांचकर्ताओं सेल patterning और अस्तित्व से सेल और अक्षतंतु प्रवास करने के लिए, विकास की प्रक्रिया का एक विभिन्न संदर्भों में मंजिल थाली व्युत्पन्न संकेतों के कार्यात्मक संपत्तियों का आकलन करने के लिए अनुमति देता है.

ऐसे एफपी ^सेमी का उपयोग का वर्णन करने के लिए, जोड़ संबंधी न्यूरॉन्स युक्त पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के ऊतकों, विच्छेदित dilacerated और एफपी ^{मुख्यमंत्री के} साथ प्रेरित कर रहे हैं. ऊतकों तो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के लिए कार्रवाई की जा सकती. इस मंजिल प्लेट जारी किया संकेतों से अक्षतंतु मार्गदर्शन मशीनरी के नियमों की जांच की अनुमति देता है. dilacerated ताजा ऊतक के उपचार की विधि वें भीतर कोशिकाओं के microenvironment के संरक्षण के महान लाभ रखती हैई ऊतक. इस प्रकार एफपी ^सेमी द्वारा इलाज या उपचार के किसी भी प्रकार के परिणामों सेल और टिशू कल्चर शर्तों में से एक अधिक शारीरिक तरह से मूल्यांकन कर रहे हैं.

Protocol

DAY 1

1. E12.5 माउस भ्रूण से रीढ़ की हड्डी मंजिल थाली (एफपी) के विच्छेदन

नोट: इस पूरी प्रक्रिया में बाँझ शर्तों के उपयोग की आवश्यकता है. यह संक्रमण से बचने के लिए एक विच्छेदन हुड के नीचे विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए बेहतर है. हुड की सतह इथेनॉल के साथ साफ किया जाना चाहिए. सभी विच्छेदन उपकरणों एक बाँझ पेट्री डिश में निष्फल और रखा जाना चाहिए. तरल पदार्थ (मध्यम, विच्छेदन मध्यम) बंद रखा और एक बर्फ स्नान में रखा जाना चाहिए. प्रत्येक भ्रूण व्यक्ति ताजा ड्रॉप में एकत्र किया जाना चाहिए. इस ऊतक के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है. विच्छेदन Dumont # 5 संदंश के साथ किया जाता है. बर्तन, पकड़ पश्चमस्तिष्क लिए किसी भी क्षति के बिना गर्भनाल या सिर के बीच भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए. यह सफलतापूर्वक विच्छेदन को पूरा करने के लिए रीढ़ की हड्डी को नुकसान नहीं महत्वपूर्ण है. तैयार करें ठंड फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस), ठंड हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) -6.5% ग्लूकोज और कमरे के तापमान Neurobasal मध्यम.

1.1 स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन

पशु यूरोपीय निर्देशों निम्नलिखित केंद्र में राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique के जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के अनुसार किया जाता है. इच्छामृत्यु की विधि ग्रीवा अव्यवस्था है, यह गर्दन के लिए दबाव लागू करने और मस्तिष्क से स्पाइनल कॉलम dislocating से मिलकर. इस विधि माउस पशु मॉडल के लिए सिफारिश की है, और एक तेज और कुशल तरीके से किया जा सकता है.

1. हमल (E0.5 = पहले दिन के बाद चटाई) की E12.5 पर एक गर्भवती माउस euthanize. माउस उदर पक्ष रखें.
2. 70% इथेनॉल के साथ पेट लेना. Adson संदंश के साथ पेट की त्वचा चुटकी और शल्य कैंची के साथ त्वचा और peritoneal परतों के माध्यम से काटा. एक चीरा और उदर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए माउस के दोनों तरफ कटौती करने के लिए इसका इस्तेमाल करते हैं.
3. भ्रूण के एक स्ट्रिंग माउस के प्रत्येक पक्ष पर मौजूद है. Ute में से एक सींग काबूदो भ्रूण और बाहरी हिस्से से शुरू करने के लिए इसे बाहर काटना के बीच ऊतक में रस. बर्फ पर ठंड पीबीएस के साथ एक 100 मिमी पेट्री डिश को बरकरार गर्भाशय में स्थानांतरित करें.
4. अतिरिक्त भ्रूण ऊतकों से भ्रूण निकालें. संदंश के दो जोड़े के साथ नाल ऊतक (गहरे लाल रंग में) समझ और ऊतक आंसू और गर्भाशय थैली से भ्रूण को निकालने के लिए धीरे खींच.

नोट: एक बेहतर संरक्षण के लिए, उनके गर्भाशय थैली एक के बाद एक से भ्रूण लीजिए.

5. अगले कदम दूरबीन आवर्धक कांच और विच्छेदन हुड के तहत किया जाता है. ठंड HBSS-6.5% ग्लूकोज की एक बूंद में एक भ्रूण रखें.
6. संदंश का प्रयोग, भ्रूण सिर काटना.

नोट: निचले जबड़े और पश्चमस्तिष्क के बीच में कटौती, पश्चमस्तिष्क के पीछे भाग अगले कदम के लिए महत्वपूर्ण है.

7. प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़ पूर्वकाल भाग के साथ भ्रूण उदर चेहरा नीचे रखें.
8. त्वचा चुटकीसंदंश की एक जोड़ी के साथ और अन्य जोड़ी के साथ भ्रूण की त्वचा दूर खींच.

नोट: यह कदम त्वचा पूरी तरह से भ्रूण के पूर्वकाल भाग से हटा दिया जाता है जब तक दोहराया जाना है.

9. बाईं ओर भ्रूण पूर्वकाल ओर मुड़ें. एक संदंश के साथ पूर्वकाल भाग में भ्रूण "नीचे पिन". अन्य संदंश त्वचा हड़पने और भ्रूण की विजय - स्तम्भ पक्ष की ओर खींचने के साथ. रीढ़ की हड्डी तो सुलभ है.
10. अभी भी रीढ़ की हड्डी में लपेट कि तानिका कटौती करने के लिए संदंश के एक तरफ का प्रयोग करें. रीढ़ की हड्डी अब खुला है.
11. सही करने के लिए भ्रूण पूर्वकाल ओर मुड़ें.
12. भ्रूण की ग्रीवा ओर से शुरू रीढ़ की हड्डी से ऊतक को अलग करें. रीढ़ की हड्डी (संदंश रीढ़ की हड्डी को नुकसान से बचने के लिए बंद आयोजित किया जाना चाहिए) के तहत संदंश स्लाइड. संदंश रीढ़ की हड्डी के नीचे दिखाई दे सकता है. रीढ़ की हड्डी के नीचे छोटे घूमनेवाला आंदोलनों से अलग करने के लिए पर्याप्त हैंऊतक और पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) आसपास.

नोट: छोड़कर संलग्न आसपास के ऊतकों इस प्रकार अगले कदम के दौरान इसे तोड़ने की संभावना बढ़ रही है, रीढ़ की हड्डी के लिए वजन जोड़ने.

13. ठंड HBSS-6.5% ग्लूकोज की एक ताजा ड्रॉप में पृथक रीढ़ की हड्डी रखें.
14. एक फ्लैट की स्थिति, दूर प्रयोगकर्ता से ऊपर और पूर्वकाल ओर तानिका में रीढ़ की हड्डी रखें.
15. एक संदंश के साथ शेष पश्चमस्तिष्क का उपयोग रीढ़ की हड्डी "नीचे पिन", और दूसरा संदंश तानिका हड़पने के साथ. रीढ़ की हड्डी की विजय - स्तम्भ की ओर से शुरू तानिका छील.

नोट: आंदोलन रीढ़ की हड्डी में से किसी को तोड़ने से बचने के लिए धीमी और स्थिर होना चाहिए. थरथानेवाला आंदोलनों तानिका की टुकड़ी सुविधा कर सकते हैं.

1.2 एफपी विच्छेदन

1. एक संदंश के साथ पश्चमस्तिष्क पिंच.
2. एफपी केंद्रीय टीआरए हैऊतक के nsparent हिस्सा. एक स्केलपेल का उपयोग मंजिल की थाली में कटौती.

नोट: एक ही गुणवत्ता के साथ दोनों पक्षों में कटौती करने के लिए, विजय - स्तम्भ की ओर से शुरू और बारी - बारी से दाएं और मंजिल की थाली के बाईं ओर काटा.

3. कमरे के तापमान पर Neurobasal मध्यम में विच्छेदित एफपी संरक्षण.

2. एफपी संस्कृति

नोट: सभी कदम एक टिशू कल्चर हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. ताजा मध्यम और हौसले से thawed खुराक और अभिकर्मकों का प्रयोग करें. बाँझ कांच coverslips, गर्म neurobasal + B27, प्लाज्मा, और HBSS-थ्रोम्बिन तैयार करें.

2.1 एफपी संस्कृति

1. एक 100 मिमी पेट्री डिश और प्रत्येक coverslip के केंद्र में पिपेट 20 μl प्लाज्मा में कई बाँझ coverslips रखें.
2. प्रत्येक प्लाज्मा बूंद में 2-4 एफपी स्थानांतरण और प्लाज्मा ड्रॉप करने के लिए अगले 20 μl HBSS-थ्रोम्बिन जोड़ने के लिए और ध्यान से मिश्रण. Coverslips रखेंकमरे के तापमान पर दस मिनट की एक न्यूनतम प्लाज्मा की जमावट की अनुमति देने के लिए.

नोट: आंशिक विच्छेदन के मामले में पूरा विच्छेदन और अधिक के मामले में स्थानांतरण दो एफपीएस. एक विंदुक टिप के साथ धीरे - धीरे मिलाएं और एफपी explants के साथ संपर्क से बचें.

प्लाज्मा थक्का जमावट की निशानी के रूप में कुछ माइक्रोन से पलटा. जमावट प्लाज्मा थक्का की टुकड़ी से बचने के लिए समय से पहले बंद कर दिया जाना चाहिए.

3. 24 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक coverslip स्थानांतरण और Neurobasal + B27 के 500 μl जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा सेते

3 दिन

3. एफपी वातानुकूलित माध्यम (एफपी ^{सेमी)} फसल काटने वाले

नोट: फसल काटने वाले एक टिशू कल्चर हुड में बाँझ शर्तों के तहत किया जाना चाहिए. सतह पर तैरनेवाला संस्कृति पेरी के दौरान दूषित है या मंजिल प्लेट (अर्थ चल रहे हैं, तो वे मर गया है हो सकता हैआयुध डिपो) तो यह अच्छी तरह से एफपी ^सेमी फसल नहीं है.

3.1 एफपी ^सेमी कटाई

1. प्रत्येक अच्छी तरह से ध्यान से मध्यम हार्वेस्ट.

नोट: polymerized प्लाज्मा थ्रोम्बिन मिश्रण या किसी भी एफपी टुकड़े पिपेट मत करो.

2. सेल्सियस -80 पर 100 μl aliquots स्टोर

4 दिन

4. E12.5 माउस भ्रूण से रीढ़ की हड्डी जोड़ संबंधी न्यूरॉन्स के विच्छेदन

नोट: यह तैयारी बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन करने की आवश्यकता नहीं है. भ्रूण इकट्ठा करने के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रिया का पालन करें. तैयार करें ठंड पीबीएस, ठंड HBSS-6.5% ग्लूकोज और ठंड neurobasal.

4.1 स्पाइनल कॉर्ड विच्छेदन

1. संदंश का प्रयोग, भ्रूण सिर काटना.

नोट: निचले जबड़े और पश्चमस्तिष्क के बीच में कटौती, पश्चमस्तिष्क के पीछे भाग के लिए महत्वपूर्ण हैअगले कदम.

2. प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़ पूर्वकाल भाग के साथ एक ताजा ड्रॉप में भ्रूण उदर चेहरा नीचे रखें.
3. एक संदंश के साथ भ्रूण की त्वचा चुटकी और एक दूसरे के साथ त्वचा दूर खींच.

नोट: यह कदम त्वचा पूरी तरह से भ्रूण के पूर्वकाल भाग से हटा दिया जाता है जब तक दोहराया जाना है.

4. बाईं ओर भ्रूण पूर्वकाल ओर मुड़ें. एक संदंश के साथ पूर्वकाल भाग में भ्रूण "नीचे पिन". अन्य संदंश के साथ, त्वचा समझ और रीढ़ की हड्डी को बेनकाब करने के लिए, भ्रूण की विजय - स्तम्भ पक्ष की ओर खींचो.
5. अभी भी रीढ़ की हड्डी में लपेट कि तानिका कटौती करने के लिए संदंश के एक तरफ का प्रयोग करें. रीढ़ की हड्डी अब संपर्क में है और खुला है.
6. सही करने के लिए भ्रूण पूर्वकाल पक्ष रखें.
7. भ्रूण की ग्रीवा ओर से शुरू रीढ़ की हड्डी से ऊतक को अलग करें. रीढ़ की हड्डी (बंद संदंश रखना) के तहत संदंश स्लाइड. के लिएCEPS रीढ़ की हड्डी के नीचे दिखाई चाहिए. रीढ़ की हड्डी के नीचे छोटे घूमनेवाला आंदोलनों आसन्न ऊतकों और पृष्ठीय रूट ganglia (डीआरजी) को अलग करने के लिए पर्याप्त हैं.
8. ठंड HBSS-6.5% ग्लूकोज की एक नई बूंद में पृथक रीढ़ की हड्डी स्थानांतरण.
9. एक फ्लैट की स्थिति, दूर प्रयोगकर्ता से ऊपर और पूर्वकाल ओर तानिका में रीढ़ की हड्डी रखें.
10. दूसरी संदंश तानिका हड़पने के साथ, एक संदंश के साथ शेष पश्चमस्तिष्क का उपयोग रीढ़ की हड्डी "नीचे पिन". रीढ़ की हड्डी की विजय - स्तम्भ की ओर से शुरू तानिका छील.

4.2 जोड़ संबंधी न्यूरॉन विच्छेदन

1. एक संदंश के साथ पश्चमस्तिष्क पिंच.
2. जोड़ संबंधी न्यूरॉन्स रीढ़ की हड्डी (पृष्ठीय पक्ष) की सबसे पार्श्व भाग में स्थित हैं. ठीक एक स्केलपेल के साथ इस पार्श्व भाग काट दिया.

नोट: रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय भाग सेल डी के अंतर से उदर भाग से प्रतिष्ठित किया जा सकताensity, उदर भाग अधिक अपारदर्शी जा रहा है.

नोट: एक ही गुणवत्ता के साथ दोनों पक्षों में कटौती करने के लिए, विजय - स्तम्भ की ओर से शुरू और बारी - बारी से दाएं की और बाईं ओर की एक छोटी लंबाई में कटौती.

3. तत्काल उपयोग के लिए बर्फ पर Neurobasal मध्यम में विच्छेदित ऊतक संरक्षण.

5. एफपी ^{मुख्यमंत्री के} साथ जोड़ संबंधी ऊतकों के उपचार

नोट: यह प्रक्रिया बाँझ शर्तों की आवश्यकता नहीं है. ऊतक व्यक्ति 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्र किया जाना चाहिए. जमे हुए एफपी ^सेमी केवल एक बार इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कई refreezing से बचें. गर्म एफपी ^सेमी तैयार (37 डिग्री सेल्सियस).

जोड़ संबंधी न्यूरॉन्स के 5.1 उपचार

1. छोटे कैंची के साथ जोड़ संबंधी ऊतक Dilacerate.

नोट: संभव के रूप में छोटे ऊतक में कटौती, कोशिकाओं की पहुंच को शक्ति प्रदान करने के लिए.

2. काफी अलग प्रयोगात्मक शर्तों नियंत्रण उपचार और एफपी ^सेमी उपचार के बीच ऊतक बांटो.
3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 800 XG पर ऊतक टुकड़े अपकेंद्रित्र
4. ट्यूबों के बीच पुनर्विभाजन की जाँच करें.

नोट: टुकड़े जब तक फिर से आवश्यक पुनर्वितरित और अपकेंद्रित्र समान रूप से वितरित कर रहे हैं.

5. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
6. ऊतकों को गर्म एफपी ^सेमी और नियंत्रण उपचार जोड़ें.

नोट: मात्रा गोली की राशि को समायोजित किया जाना चाहिए और कम से कम दो बार गोली की मात्रा होनी चाहिए.

7. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.

नोट: धीरे हर 10-15 मिनट हिला

8. 1 मिनट के लिए 800 XG पर अपकेंद्रित्र और उपचार को हटा दें.
9. Lysis बफर जोड़ें

नोट: मात्रा एक करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिएगोली के पहाड़ और कम से कम दो बार गोली की मात्रा होनी चाहिए.

10. ऊपर पिपेट और नीचे गोली resuspend.

नोट: एक भंवर का भी इस्तेमाल किया जा सकता है.

11. बर्फ पर 15 मिनट सेते हैं.
12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र
13. सतह पर तैरनेवाला रखें और एक ब्रैडफोर्ड परख ⁹ के साथ प्रोटीन की मात्रा को मापने.
14. 6x Laemmli बफर जोड़ें.
15. प्रोटीन सामग्री denature के लिए 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.

नोट: नमूने तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या डिग्री सेल्सियस -80 पर संग्रहीत किया जा सकता है

16. वेस्टर्न ब्लॉट ¹⁰ से उपचार के प्रभाव का आकलन.

नोट: कुल प्रोटीन की कम से कम 50 ग्राम प्रत्येक लेन के लिए लोड किया जाना चाहिए.

Representative Results

जोड़ संबंधी ऊतकों एफपी ^सेमी द्वारा इलाज किया गया और नमूने पश्चिमी धब्बा में रिसेप्टर के स्तर के विश्लेषण के लिए प्रोसेस किया गया. एफपी ^सेमी का आवेदन (चित्रा 2) पार करने के बाद midline विकर्षक Semaphorin3B को जोड़ संबंधी axons की संवेदनशीलता mediates जो एक मार्गदर्शन रिसेप्टर, PlexinA1, के स्तर को बढ़ाने के लिए दिखाया गया था. इस एफपी द्वारा जारी संकेतों PlexinA1 स्तरों ^4,6 कि विनियमित का पता चला.

चित्रा 1. मंजिल थाली अलग करने के लिए विच्छेदन की प्रक्रिया की योजनाएं. विच्छेदन और संस्कृति प्रक्रिया के विभिन्न चरणों का सचित्र हैं. 1) भ्रूण सिर काट; 2-3) त्वचा को हटाने, 4) तानिका खोलने, 5-6) भ्रूण से रीढ़ की हड्डी को हटाने, 7) पुरुषों को दूरINGES, 8-9) मंजिल थाली काटना, 10) एफ पी प्लाज्मा मिश्रण करने के लिए थ्रोम्बिन जोड़ने और संस्कृति के माध्यम से जोड़ने से पहले कमरे के तापमान पर 10 से 15 मिनट इंतज़ार करो. 11-12) पृष्ठीय न्यूरॉन्स काटना, 13) ऊतक dilacerate. एक: भ्रूण के पूर्वकाल पोल. पी: भ्रूण के पीछे पोल. तीर आंदोलन की दिशा को दर्शाती है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम. ए) पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के ऊतकों, एकत्र dilacerated और मंजिल की थाली वातानुकूलित मध्यम और नियंत्रण के माध्यम से प्रेरित थे. नमूने lysed और पश्चिमी धब्बा के लिए प्रोसेस किया गया. प्रोटीन एंटीबॉडी विरोधी PlexinA1 साथ जांच, और β-actin गया. पीhoto यह नियंत्रण मध्यम की तुलना डॉट धब्बा एफपी में GDNF की अभिव्यक्ति से पता चलता है मंजिल प्लेट वातानुकूलित मध्यम. बी) के साथ ^{मुख्यमंत्री} प्रेरित नमूने में PlexinA1 के स्तर की वृद्धि दिखाता है.

Discussion

मंजिल प्लेट वातानुकूलित माध्यम से उत्पादन मंजिल प्लेट जारी किया संकेतों के जैविक गुणों का आकलन करने के लिए एक कुशल और आसान तरीका प्रदान करता है.

प्लाज्मा थ्रोम्बिन मैट्रिक्स ऊतक अस्तित्व के लिए उत्कृष्ट हालत में हैं. फिर भी, इस समृद्ध वातावरण प्रयोगों के कुछ प्रकार के लिए एक सीमा हो सकती है. इस प्रकार, मंजिल थाली ऊतक भी agarose मैट्रिक्स में खेती की जा सकती. मंजिल की थाली वातानुकूलित माध्यम की गुणवत्ता ऐसी GDNF (चित्रा 2), श और Netrin ¹¹ के रूप में जाना जाता है मंजिल प्लेट जारी किया संकेतों का पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. वातानुकूलित माध्यम में उनकी उपस्थिति पश्चिमी धब्बा या डॉट धब्बा द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है.

इस प्रक्रिया में कोशिकाओं को उनके पैतृक microenvironment में अध्ययन कर रहे हैं. इस इलाज के लिए प्रतिक्रिया है कि ऊतकों में कोशिकाओं के प्रकार के बारे में अधिक जानकारी रोकता है. मंजिल की थाली एक सजातीय संरचना, अधिनियम की एकाग्रता नहीं हैऐसे Wnts के रूप में Ive घटकों rostro दुम अक्ष विच्छेदित क्षेत्र के आधार पर संस्कृतियों के बीच अलग हो सकता है.

ताजा dilacerated ऊतक पर बायोकैमिस्ट्री उनके पैतृक microenvironment में कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए लाभ रखती है. इस प्रकार, सेल व्यवहार उनके देशी संदर्भ ^{में 12} से यथासंभव पुनरावृत्ति कि स्थिति में जांच कर रहे हैं. एफपी ^सेमी का प्रभाव भी सुसंस्कृत जोड़ संबंधी न्यूरॉन्स में मूल्यांकन किया जा सकता है ताकि पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी ही जोड़ संबंधी न्यूरॉन्स शामिल नहीं है.

मध्यम सेल और ऊतक संस्कृतियों के विभिन्न प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है. मानकों की एक बड़ी रेंज सेल पहचान, सेल अस्तित्व, कोशिका मृत्यु, और सेल भेदभाव से मूल्यांकन किया जा सकता. नमूने प्रोटिओमिक्स के लिए कार्रवाई की जा सकती.

Dilacerated ताजा ऊतक की तैयारी का एक महत्वपूर्ण पैरामीटर नियंत्रण और प्रयोगात्मक उपचार के लिए ऊतक के पुनर्विभाजन है. यह आयात हैचींटी एक ट्यूब में पहले ऊतकों को इकट्ठा करने और नमूनों को अलग करने के लिए सामूहिक रूप से पूर्व ऊतक dilacerate लिए. इस नमूने के बीच सेल के बाद पता चला प्रोटीन एकाग्रता के अंतर को सीमित करता है.

HBSS ग्लूकोज अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है ध्यान दें. Neurobasal भी 4 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने के लिए रखा जा सकता है B27 aliquots अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए लंबी अवधि के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. प्लाज्मा aliquots -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जाना चाहिए और उपयोग के बाद refrozen किया जा सकता है. थ्रोम्बिन aliquots भी -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और refrozen नहीं किया जा सकता.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents Required
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0.5 M, pH 8
MgCl2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
Distilled H2O
Table 1.Reagents required.
Tools and Materials
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
Microknives	Fine Science Tools	10136-14
Table 2. Tools and materials.
Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18 mm x 18 mm Bunsen gas burner 24-well plate tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge Recipes FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS-thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10 mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH 7,4 HEPES (260 g/mol) 25 mM EDTA (pH 8) 5 mM MgCl2 1 mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1x Sodium Orthovanadate 0.2 M H2O Laemmli Buffer Tris 0.5 M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0.6 M Bromophenol blue H2O