Summary
바닥 플레이트, 척수 개발 조상에 확산 신호를 제공하고 분화 신경의 중요한 구조이다. 우리는 바닥 플레이트 조정 배지를 생산하는 신선한 척수 조직에 적용하는, 생화학 의해 그 단백질에 영향을 평가하는 방법을 서술.
Abstract
개발하는 동안, 조상 및 사후 유사 분열 뉴런은 자신의 운명을 통제 인접 지역에서 신호를 수신합니다. 바닥 판은 복부 위치에 뇌실막 운하 안감 glial 세포의 그룹입니다. 바닥 판은 척수에있는 세포 계통의 패턴에 기여 키 morphogens을 표현한다. 나중에 발달 단계에서, 바닥 판은 commissural 축삭 1로 동측의 축삭과 제어 중간 선 횡단의 횡단을 방지하기 위해 장벽 역할을 척수에있는 축삭의 탐색을 조절한다. 이 기능은 여러지도 단서의 분비를 통해 달성된다. 다른 사람들이 현지지도 단서 2,3에 축삭의 감도를 조절하는 지침 수용체 및 다운 스트림 신호를 조절하면서 이러한 신호의 일부는 성장 축삭에 대한 유인 및 방충제 역할을합니다. 여기에서 우리는 deve을의 다양한 바닥 판 파생 된 신호의 특성을 조사 할 수있는 방법을 설명합니다바닥 플레이트 에어컨 매체 (FP의 CM) 4-6의 생산에 따라 lopmental 상황. 우리는 그 다음 축삭의 맥락에서이 FP의 cm의 사용을 예증. 첫째, 척수는 E12.5에서 마우스 배아에서 분리되어 바닥 판은 밖으로 해부 및 플라즈마 트롬빈 매트릭스 (그림 1)에서 재배된다. 둘째 이틀 후, commissural 조직은 E12.5 배아로부터 해부 분쇄 및 FP의 CM에 노출되어 있습니다. 셋째, 조직은 commissural 마커의 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리됩니다.
Introduction
바닥 판은 조상과 postmitotic 세포 계통의 사양에 중요한 역할을 수행하고 축삭 탐색 7,8를 제어, 개발 척수의 잘 알려진 패턴 센터입니다. FP의 CM을 생산하기 위해 여기에 설명 된 실험 절차는 수사관 세포 패턴과 생존의 세포와 축삭 이주, 발달 과정의 다양한 상황에서 바닥 판에서 파생 된 신호의 기능적 특성을 평가할 수 있습니다.
이러한 FP의 CM의 사용을 설명하기 위해, commissural 신경 세포를 포함하는 등의 척수 조직은 해부 dilacerated 및 FP의 CM로 자극된다. 조직은 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리 될 수있다. 이 바닥 판 발매 신호에 의한 축삭지도 기계의 규정을 조사 할 수 있습니다. dilacerated 신선한 조직의 치료 방법 일 이내에 세포 미세 환경을 보존하는 큰 장점을 보유전자 조직. 따라서 FP의 cm 의해 치료 또는 치료의 종류의 영향은 세포 및 조직 배양 조건에서보다 더 많은 생리적 방법으로 평가된다.
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Protocol
1 일
1. E12.5 마우스 배아에서 척수 바닥 플레이트 (FP)의 해부
참고 : 전체 절차는 멸균 조건의 사용을 필요로한다. 이것은 오염을 피하기 위해 해부 후드 절개를 수행하는 것이 바람직하다. 후드의 표면은 에탄올로 청소해야합니다. 모든 해부 악기 멸균 페트리 접시에 소독 및 보관해야합니다. 액체 (매체, 해부 매체는) 밀폐 보관하고 얼음 욕조에 넣어해야합니다. 각각의 배아 개별 신선한 하락에 수집되어야한다. 이 조직 보존을위한 중요합니다. 해부는 뒤몽 # 5 포셉으로 수행된다. 요리, 그립 후뇌에 손상없이 탯줄 또는 머리 사이의 배아를 전송합니다. 그것은 성공적으로 절개를 완료하기 위해 척수 손상되지 중요합니다. 준비 차가운 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), 차가운 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) -6.5 %의 포도당과 실내 온도 neurobasal 매체.
1.1 척수의 해부
동물은 유럽 지침 다음 센터 국립 드 라 공들인 Scientifique의 동물 관리 지침에 따라 처리됩니다. 안락사의 방법은 자궁 경부 전위, 그것은 목에 압력을 적용하고 뇌에서 척추 탈구로 구성되어 있습니다. 이 방법은 마우스 동물 모델에게 추천하고, 신속하고 효율적인 방식으로 수행 될 수있다.
- 임신 (E0.5 = 첫 날 다음 매트)의 E12.5에서 임신 한 쥐를 안락사. 마우스 복부 측면을 위로 놓습니다.
- 70 % 에탄올로 복부를 적시십시오. Adson 집게와 복부의 피부를 조이고 수술 가위로 피부와 복막 레이어를 잘라. 절개를하고 복강을 노출 마우스의 양측에 잘라 사용.
- 배아의 문자열은 마우스의 양쪽에 존재한다. UTE의 하나의 뿔을 잡고두 개의 배아와 외부 부분에서 시작을 해부 사이의 조직에서 RUS. 얼음 차가운 PBS와 100mm 페트리 접시에 그대로 자궁을 전송합니다.
- 여분의 배아 조직에서 배아를 추출합니다. 포셉 두 쌍의 태반 조직 (어두운 빨강)을 잡고 조직을 찢어 자궁 주머니에서 배아를 제거하기 위해 부드럽게 잡아 당깁니다.
참고 : 더 나은 보호를 위해, 자신의 자궁 주머니 하나 하나의 배아를 수집합니다.
- 다음 단계는 양안 돋보기 및 해부 후드 아래에 이루어집니다. 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 드롭 한 배아를 놓습니다.
- 집게를 사용하여 배아 목을 벨.
참고 : 아래 턱뼈와 후뇌 사이에 잘라, 후뇌의 뒤쪽 부분은 다음 단계에 중요합니다.
- 실험에 직면 앞쪽 부분에 배아 복부 얼굴을 아래로 놓습니다.
- 피부를 꼬집어집게 일쌍와 다른 쌍을 사용하여 태아의 피부을 당깁니다.
주 :이 단계는 피부가 완전 배아의 앞쪽 부분에서 제거 될 때까지 반복되어야한다.
- 왼쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다. 한 집게로 앞쪽 부분에 배아를 "아래로 핀". 다른 집게는 피부를 잡아 배아의 주동이의쪽으로 끌어와. 척수는 액세스 할 수 있습니다.
- 여전히 척수를 감싸는 수막을 잘라 집게의 한면을 사용합니다. 척수는 지금 열려 있습니다.
- 오른쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다.
- 배아의 자궁 경관 측면에서 시작하여 척수 조직을 분리합니다. 척수 (집게가 척수 손상을 방지하기 위해 폐쇄 개최한다)에서 집게를 밀어 넣습니다. 집게는 척수에서 볼 수 있어야합니다. 척수에서 작은 회전하는 움직임을 분리하기에 충분하다조직과 후근 신경절 (DRG)를 둘러싼.
참고 : 출발 연결된 주변 조직 따라서 다음 단계 중에 파괴의 가능성을 증가, 척수에 무게를 추가 할 수 있습니다.
- 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 신선한 방울의 고립 된 척수를 놓습니다.
- 평면, 멀리 실험에서 위쪽과 앞쪽 측면에 수막에 척수를 놓습니다.
- 한 집게로 남아있는 후뇌를 사용하여 척수를 "핀 내려", 두 번째 집게는 수막을 잡아와. 척수의 주동이의 측면에서 시작하여 수막을 벗겨.
참고 : 움직임 척수의 분열을 방지하기 위해 천천히 일정해야한다. 진동 운동은 수막의 분리를 용이하게 할 수있다.
1.2 FP 해부
- 한 집게와 후뇌 핀치.
- FP는 중앙 TRA이며조직의 nsparent 부분. 메스를 사용하여 바닥 판을 잘라.
참고 : 동일한 품질로 양쪽을 잘라, 주동이의 측면에서 시작하여 교대로 오른쪽 바닥 판의 왼쪽을 잘라.
- 실온에서 Neurobasal 배지에서 해부 FP를 보존.
2. FP 문화
참고 : 모든 단계는 조직 문화 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 신선한 매체와 갓 해동 보충 및 시약을 사용합니다. 멸균 유리 커버 슬립, 따뜻한 neurobasal + B27, 플라즈마 및 HBSS - 트롬빈을 준비합니다.
2.1 FP 문화
- 100mm 배양 접시에 각각의 coverslip의 중심에 피펫 20 μL 플라즈마의 여러 불임의 coverslips를 놓습니다.
- 각 플라즈마 드롭 2-4 FP를 전송하고 플라즈마 드롭 옆에 20 ㎕의 HBSS - 트롬빈을 추가하고 조심스럽게 섞는다. 커버 슬립을 유지실온에서 충분히의 최소 혈장의 응고를 허용하기 위해.
참고 : 부분 절개의 경우 완전 해부 등의 경우 이전 두 FPS를. 피펫 팁 천천히 혼합 FP 외식과의 접촉을 피하십시오.
플라즈마 응고 응고의 표시로 몇 μm의 후퇴. 응고 플라즈마 응고의 분리를 방지하기 위해, 중간에 중지 할 수 없습니다해야합니다.
- 24 웰 플레이트의 각 coverslip에 전송하고 Neurobasal + B27의 500 μl를 추가합니다. 37 ℃에서 48 시간을 품어
3 일
3. FP 된 배지 (FP의 CM) 수확
참고 : 수확은 조직 배양 후드에서 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 상층 액을 배양 요정 중에 오염이나 바닥 플레이트 (의미 부동 한 경우에는 사망 할 수있는 경우OD)을 잘에서 FP의 CM을 수확하지 않습니다.
3.1 FP 센티미터 수확
- 각 우물에서주의 깊게 매체를 수확.
참고 : 중합 플라즈마 트롬빈 혼합 또는 FP 조각을 피펫하지 마십시오.
- C. -80 °에서 100 ㎕의 분취 량을 저장
DAY 4
4. E12.5 마우스 배아에서 척수 Commissural 뉴런의 해부
참고 :이 제제는 무균 조건 하에서 수행 할 필요가 없습니다. 배아를 수집하기 위해 위에서 설명한 절차를 따르십시오. 준비 차가운 PBS, 차가운 HBSS - 6.5 %의 포도당과 차가운 neurobasal.
4.1 척수의 해부
- 집게를 사용하여 배아 목을 벨.
참고 : 아래 턱뼈와 후뇌 사이에 잘라, 후뇌의 뒤쪽 부분은 중요하다다음 단계.
- 실험에 직면 전반부와 신선한 드롭 배아 복부 얼굴을 아래로 놓습니다.
- 한 집게로 태아의 피부를 조이고 다른 하나는 피부을 당깁니다.
주 :이 단계는 피부가 완전 배아의 앞쪽 부분에서 제거 될 때까지 반복되어야한다.
- 왼쪽에있는 태아의 전방 측을 켭니다. 한 집게로 앞쪽 부분에 배아를 "아래로 핀". 다른 겸자로, 피부를 잡아 척수를 노출하는, 배아 주동이쪽으로 당긴다.
- 여전히 척수를 감싸는 수막을 잘라 집게의 한면을 사용합니다. 척수는 이제 노출 열려 있습니다.
- 오른쪽에있는 배아 전방 측을 배치합니다.
- 배아의 자궁 경관 측면에서 시작하여 척수 조직을 분리합니다. 척수 (폐쇄 집게를 유지)에서 집게를 밀어 넣습니다. 에CEPS는 척수에서 볼 수 있어야합니다. 척수에서 작은 회전하는 운동은 인접 조직과 후근 신경절 (DRG)를 분리하기에 충분하다.
- 차가운 HBSS 6.5 % 포도당의 새로운 드롭에 고립 된 척수를 전송합니다.
- 평면, 멀리 실험에서 위쪽과 앞쪽 측면에 수막에 척수를 놓습니다.
- 두 번째 집게가 수막을 잡아 함께, 하나의 집게로 남아있는 후뇌를 사용하여 척수를 "핀 내려". 척수의 주동이의 측면에서 시작하여 수막을 벗겨.
4.2 Commissural 신경 해부
- 한 집게와 후뇌 핀치.
- Commissural 신경 세포는 척수 (등쪽)의 대부분의 측면 부분에 위치하고 있습니다. 미세 메스이 측면 부분을 잘라.
주 : 척수의 지느러미 부분 셀 (D)의 차이에 의해 복부 부분으로부터 구별 될 수있다ensity, 복부 부분이 불투명하게되고.
참고 : 동일한 품질로 양쪽을 잘라, 주동이의 측면에서 시작하여 교대로 오른쪽과 왼쪽의 작은 길이를 잘라.
- 즉시 사용을위한 얼음에 Neurobasal 매체의 해부 조직을 보존.
5. FP의 CM과 Commissural 조직의 치료
참고 :이 절차는 무균 조건을 필요로하지 않습니다. 조직은 각각 1.5 ML 튜브에 수집되어야한다. 냉동 FP 센티미터 한 번만 사용해야합니다. 여러 재 냉동하지 마십시오. 따뜻한 FP의 CM을 준비합니다 (37 ° C).
commissural 신경의 5.1먼트
- 작은 가위로 commissural 조직을 Dilacerate.
참고 : 최대한 작게 조직을 잘라 세포의 접근성을 강화시킬 수 있습니다.
- 상당히 다른 실험 조건 제어 처리 및 FP 센티미터 치료 사이의 조직을 배포합니다.
- 4 ℃에서 1 분 800 XG에서 조직 조각을 원심 분리기
- 튜브 사이의 재분할을 확인합니다.
참고 : 조각까지 다시 필요 재분배와 원심 분리기가 동일하게 분배하는 경우.
- 뜨는을 제거합니다.
- 조직에 따뜻한 FP의 CM 및 제어 처리를 추가합니다.
주 : 볼륨 펠렛의 양을 조절할 수 있어야하며, 적어도 두번 펠릿의 양이어야한다.
- 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
참고 : 부드럽게 매 10 ~ 15 분을 흔들
- 1 분 800 XG에 원심 분리기 및 처리를 제거합니다.
- 용해 버퍼를 추가
주 : 볼륨을 조정해야펠릿의 실장 및 적어도 두 펠릿 볼륨이어야한다.
- 최대 피펫 아래로 펠렛을 재현 탁 할 수 있습니다.
참고 : 와류가 또한 사용될 수있다.
- 얼음에 15 분 알을 품다.
- 4 ℃에서 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기
- 뜨는을 유지하고 브래드 분석 (9)와 단백질의 양을 측정합니다.
- 배의 램리 버퍼를 추가합니다.
- 단백질 함량을 변성 5 분 동안 95 ° C에서 알을 품다.
참고 : 샘플은 즉시 사용할 수 있습니다 또는 -80 ° C.에 저장할 수 있습니다
- 웨스턴 블롯 (10)에 의한 처리의 효과를 평가한다.
참고 : 전체 단백질의 적어도 50 μg은 각 레인에로드해야합니다.
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Representative Results
Commissural 조직은 FP의 CM에 의해 처리하고, 시료는 웨스턴 블롯에있는 수용체 수준의 분석을 위해 처리되었습니다. FP의 CM의 응용 프로그램 (그림 2)을 교차 한 후 중간 선 구충제 Semaphorin3B에 commissural 축삭의 감도를 매개 안내 수용체, PlexinA1의 수준을 높일 것으로 나타났다. 이 FP에 의해 발표 신호가 PlexinA1 수준에게 4,6를 조절하는 것으로 나타났다.
그림 1. 바닥 플레이트를 분리하는 절개 절차의 계획은. 해부와 문화 과정의 다른 단계가 설명된다. 1) 배아의 머리를 잘라, 2-3)는 피부를 제거, 4) 수막을 열고, 5-6) 배아에서 척수를 제거; 7) 남자를 제거inges는, 8-9) 바닥 판을 해부, 10) FP-플라즈마 믹스 트롬빈을 추가하고 배지를 추가하기 전에 실온에서 10 ~ 15 분을 기다립니다. 11 ~ 12) 등의 뉴런을 해부, 13) 조직을 dilacerate. A : 태아의 앞쪽에 극. P : 배아의 후방 극. 화살표가 이동 방향을 묘사하는 것은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 대표 결과. A) 지느러미 척추 조직을 수집 dilacerated 바닥 판 에어컨 매체 제어 매체를 자극했다. 샘플은 용해 및 웨스턴 블롯에 대한 처리되었습니다. 단백질은 항체 안티 PlexinA1과 프로빙 및 β-액틴했다. P이네는 그것의 제어 매체에 비해 점 오점이 FP에 GDNF의 식을 보여줍니다 바닥 판 에어컨 매체. B)와 CM 자극 샘플 PlexinA1 수준의 증가를 보여줍니다.
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Discussion
바닥 판 에어컨 매체의 생산은 바닥 판 출시 신호의 생물학적 특성을 평가하기위한 효율적이고 쉬운 방법을 제공합니다.
플라즈마 트롬빈 매트릭스는 조직의 생존을위한 최상의 조건을 제공합니다. 그럼에도 불구하고,이 풍부한 환경 실험의 몇 가지 유형에 대한 제한이있을 수 있습니다. 따라서, 바닥 판 조직은 또한 아가 로스 매트릭스에서 배양 될 수있다. 바닥 판 에어컨 매체의 품질은 GDNF (그림 2), 쉬와 네트 린 (11)로 알려진 바닥 판 출시 신호의 검출에 의해 평가 될 수있다. 에어컨 중간에서 자신의 존재는 서양 얼룩이나 점 오점에 의해 평가 될 수있다.
이 과정에서 세포는 그 나라의 미세 환경에서 공부하고 있습니다. 이 치료에 반응 조직에있는 세포의 종류에 대한 자세한 정보를 방지 할 수 있습니다. 바닥 판은 균일 한 구조, 행동의 농도가 아니므로같은 Wnts으로 살아야 구성 요소는 rostro - 꼬리 축을 따라 해부 지역에 따라 문화 사이에 차이가있을 수 있습니다.
신선한 dilacerated 조직에 생화학은 기본 미세 세포를 연구하는 장점을 보유하고있다. 따라서, 세포의 행동은 그 나라의 상황에 맞는 12 최대한 근접하게 요점을 되풀이 조건에서 조사 하였다. FP의 cm의 효과는 또한 배양 commissural 뉴런으로 평가 될 수 있도록 등쪽 척수는 commissural 뉴런을 포함하지 않는다.
배지는 세포 및 조직 배양의 다양한 유형에 적용될 수있다. 매개 변수의 큰 범위는 세포의 정체성, 세포 생존, 세포 사멸, 세포 분화에서 평가 될 수있다. 샘플은 단백질 체학에 처리 할 수 있습니다.
dilacerated 신선한 조직 제제의 중요한 매개 변수는 제어 및 실험적 처리를위한 조직의 재분할이다. 그것은 수입입니다개미는 하나의 튜브에 먼저 조직을 수집하고 샘플을 분리하는 집합 전에 조직을 dilacerate 할 수 있습니다. 이것은 샘플 사이 용해 후 검출 단백질 농도의 변화를 제한한다.
HBSS - 포도당이 최대 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. Neurobasal 또한 4 ℃에서 한 달 동안 유지 될 수있다 B27 분취 량은 최대 1 주일까지 장기 -20 ° C에서 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 플라즈마 분주은 -20 ° C에서 보관해야하며, 사용 후 다시 냉동 할 수 있습니다. 트롬빈 분취는 -20 ° C에서 저장 될 수 있고, 다시 냉동 될 수 없다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어
Acknowledgments
우리는 그들의 도움을 카린 Kindbeiter, 뮤리엘 Bozon 및 Florie 위 Reynaud 감사합니다. 작품은 CNRS, ANR YODA 프로그램과 Labex DevWeCan에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reagents Required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS, Ca2+/Mg2+- free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Plasma | Sigma | P-3266 | 1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thrombin | Sigma | T-4648 | 10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50x | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES (260 g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EDTA | Sigma | E-5513 | 0.5 M, pH 8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MgCl2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1.Reagents required. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tools and Materials | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microknives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Tools and materials. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
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