Summary
Плиты перекрытия является одним из важнейших структура развивающихся спинного мозга, обеспечивающих к диффузии сигналы предшественников и дифференцированных нейронов. Мы описываем способ получения от пола пластины кондиционированной среды, чтобы применить его на свежий ткани спинного мозга, и для оценки последствий на интерес белков по биохимии.
Abstract
Во время разработки, предшественники и постмитотических нейроны получают сигналы от прилегающих территорий, которые регулируют их судьбу. Пол-пластина представляет собой группу из глиальных клеток, выстилающих эпендимных канал в вентральной позиции. Пол-пластина выражает ключевые морфогены способствующих паттерна клеточных клонов в спинном мозге. На более поздних стадиях развития, пол-пластина регулирует навигацию аксонов в спинном мозге, действуя как барьер, чтобы предотвратить переправу ипсилатеральных аксонов и контрольного средней линии пересечения на комиссуральных аксонов 1. Эти функции достигается за счет секреции различных сигналов наведения. Некоторые из этих сигналов действовать в качестве аттрактантов и репеллентов для растущих аксонов, а другие регулировать наведения рецепторы и ниже по потоку сигналов для модуляции чувствительность аксонов к местным сигналы наведения 2,3. Здесь мы опишем метод, позволяющий исследовать свойства пола пластин, полученных сигналов в различных развиlopmental контексты, основанные на производстве пола плиты кондиционированной среды (FP см) 4-6. Мы тогда примером использования этого FP см в контексте аксонов. Во-первых, спинной мозг изолирован от мышиного эмбриона на E12.5, а пол-пластина вырезали и культивируют в плазменно-тромбина матрицы (рис. 1). Второй через два дня, спаечный ткани отсекают от эмбрионов E12.5, растирают и подвергается FP см. В-третьих, ткань обрабатываются для Вестерн-блот-анализа комиссуральных маркеров.
Introduction
Пол-пластина известный рисунка центр развивающегося спинного мозга, играя ключевую роль в спецификации предшественников и постмитотических клеточных линий и контроля аксонов навигацию 7,8. Экспериментальная процедура, описанная здесь, чтобы произвести FP см позволяет исследователям для оценки функциональных свойств плит, полученных сигналов этаже в различных контекстах процессов развития, от клеток паттерна и выживания к клетке и аксонов миграции.
Чтобы проиллюстрировать использование такого FP см, спинной ткани спинного мозга, содержащие спаечный нейронов расчленены, dilacerated и стимулировали с FP см. Ткани могут быть обработаны для Вестерн-блоттинга. Это позволяет исследовать регламент аксонов машин по пол-пластинчатых выпущенных сигналов. Метод лечения dilacerated свежей ткани имеет большое преимущество сохранения микросреду ячеек в гоэ ткани. Таким образом, последствия лечения FP см или любых видов лечения оцениваются в более физиологической способом, чем в клетке и ткани условий культивирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ДЕНЬ 1
1. Рассечение спинного мозга плиты Этаж (FP) от E12.5 эмбрионов мыши
Примечание: Вся процедура требует использования стерильных условиях. Предпочтительно, чтобы выполнить рассечение под капотом рассечение, чтобы избежать загрязнения. Поверхность капота должны быть очищены этанолом. Все рассечение инструменты должны быть стерильными и хранится в стерильную чашку Петри. Жидкости (средний, рассечение среды) должны храниться закрывали и помещали в ледяную баню. Каждый эмбрион должны быть собраны в индивидуальном свежей капли. Это важно для сохранения ткани. Рассечение осуществляется с Дюмон # 5 щипцами. Для передачи эмбрионов между блюдами, сцепление пуповины или руководитель без ущерба для заднего мозга. Очень важно, чтобы не повредить спинной мозг, чтобы успешно завершить рассечение. Подготовка холодным забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), сбалансированный солевой раствор Хэнка холодной (HBSS) -6,5% глюкозы и температура в помещении Neurobasal среднего.
1.1 спинного рассечение шнур
Животные, рассматриваются в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными в Национальном центре де ла Научных Исследований следующим европейским директивам. Метод эвтаназии шейки дислокации, он состоит из оказания давления на шею и вывихнул позвоночник от мозга. Этот метод рекомендуется для мышиных моделях на животных, и могут быть выполнены в быстрым и эффективным способом.
- Усыпить беременную мышь на E12.5 беременности (E0.5 = первый день после матирования). Поместите мыши вентральной стороной вверх.
- Замочите живота с 70% этанола. Зажмите кожу живота с Adson пинцетом и прорезать кожу и перитонеальных слоев с хирургическими ножницами. Сделайте надрез и использовать его, чтобы сократить по обе стороны от мыши, чтобы разоблачить брюшной полости.
- Строка эмбрионов присутствует на каждой стороне мыши. Возьмитесь одной рог ЮтРусь в ткани между двумя эмбрионов и рассекают его, начиная с внешней части. Перенести нетронутыми матки к 100 мм чашки Петри с холодной PBS на льду.
- Извлечение эмбрионов из экстра-эмбриональных тканей. Возьмитесь за ткани плаценты (в темно-красный) с двумя парами пинцетом и вытащить мягко порвать ткань и удалить эмбрионов от матки мешок.
Примечание: Для лучшего сохранения, собирать эмбрионы из их матки мешок по одному.
- Следующие шаги делаются под бинокулярного увеличительное стекло и рассечение капюшона. Поместите один эмбрион в капле холодной HBSS-6.5% глюкозы.
- Использование щипцов, обезглавить эмбрион.
Примечание: Cut между нижней челюсти и заднего мозга, задняя часть заднего мозга важно для следующих шагов.
- Поместите эмбриона вентральной лицом вниз с передней части, обращенной к экспериментатору.
- Зажмите кожуэмбриона с одной парой щипцов и с другой парой оторваться кожу.
Примечание: Этот шаг должен быть повторен, пока кожа не полностью удаляется из передней части эмбриона.
- Поверните эмбрион переднюю сторону влево. С одной щипцов "придавить" эмбрион в передней части. С другими щипцы захватить кожу и потяните на ростральной стороне эмбриона. Спинной мозг становится доступен.
- Используйте одну сторону пинцетом, чтобы сократить мозговых оболочек, которые все еще обернуть спинной мозг. Спинной мозг в настоящее время открыт.
- Поверните эмбрион переднюю сторону вправо.
- Отделить ткани из спинного мозга, начиная от шейки стороне эмбриона. Вставьте пинцет под спинного мозга (щипцы должны проводиться закрыто, чтобы исключить повреждение спинного мозга). Щипцы должны быть видны в спинном мозге. Небольшие вращательные движения под спинного мозга являются достаточными, чтобы отсоединитьокружающие ткани и ганглии задних корешков (DRG спинной).
Примечание: Выход прилагается окружающих тканей добавить вес к спинному мозгу, тем самым увеличивая вероятность разбить его на следующем шаге.
- Поместите изолированный спинной мозг в свежем капли холодной HBSS-6.5% глюкозы.
- Поместите спинной мозг в плоском положении, мозговых оболочек на верхней и передней стороне от экспериментатора.
- "Придавить" спинной мозг, используя оставшийся задний мозг с одним пинцетом, и со второй щипцы захватить мозговых оболочек. Снимите мозговых оболочек, начиная с ростральной части спинного мозга.
Примечание: Движение должно быть медленным и постоянным, чтобы избежать нарушение спинного мозга. Вибрационные движения могут облегчить отряд мозговых оболочек.
1.2 FP рассечение
- Зажмите задний мозг с одним щипцами.
- FP является центральным траnsparent часть ткани. Использование скальпеля вырезать плиты перекрытия.
Примечание: Чтобы вырезать обе стороны с тем же качеством, начать с ростральной стороны и поочередно вырезать правую сторону и левую сторону плиты пола.
- Сбережение рассеченные FP в Neurobasal среде при комнатной температуре.
2. FP Культура
Примечание: Все шаги должны быть выполнены в стерильных условиях в капот культуры ткани. Используйте свежую среду и недавно талой добавки и реагенты. Подготовить стерильные покровные стекла, теплый Neurobasal + B27, плазмы и HBSS-тромбина.
2.1 FP культура
- Место несколько стерильных покровные в чашку Петри 100 мм и пипетка 20 мкл плазмы в центре каждого покровное.
- Трансфер 3:58 FP в каждой капле плазмы и добавить 20 мкл HBSS-тромбина рядом с падения плазмы и тщательно перемешать. Держите покровныев течение как минимум десяти минут при комнатной температуре, чтобы позволить коагуляции плазмы.
Примечание: Передача двух кадров в секунду в случае полного вскрытия и более в случае частичного вскрытия. Смешайте медленно с кончика пипетки и избегать контактов с эксплантов FP.
Плазма сгусток втягивается несколько мкм в знак коагуляции. Коагуляция не должен быть остановлен преждевременно, чтобы избежать отделение сгустка плазмы.
- Передача каждого покровное в 24-луночный планшет и добавляют 500 мкл Neurobasal + B27. Выдержите 48 ч при 37 ° С
ДЕНЬ 3
3. FP кондиционированной среды (FP см) Уборочная
Примечание: Заготовка должна быть выполнена в стерильных условиях в капот культуры ткани. Если верхний слой загрязнен или если пол пластины плавающей (то есть они, возможно, умер во время культивирования период), то не урожай FP см от этого хорошо.
3.1 FP см уборки
- Урожай тщательно среду из каждой лунки.
Примечание: Не пипетки полимеризованный смесь плазменный тромбина или любые фрагменты FP.
- Храните 100 мкл аликвоты при -80 ° С
ДЕНЬ 4
4. Рассечение спинного мозга спаечный нейронов от E12.5 эмбрионов мыши
Примечание: Этот препарат не должны быть выполнены в стерильных условиях. Следуйте процедуре, описанной выше для сбора эмбрионов. Подготовьте холодный PBS, холодная ССРХ-6,5% глюкозы и холодная Neurobasal.
4.1 спинного рассечение шнур
- Использование щипцов, обезглавить эмбрион.
Примечание: Cut между нижней челюсти и заднего мозга, задняя часть заднего мозга важна дляСледующие шаги.
- Поместите эмбриона вентральной лицом вниз в свежем капли с передней части, обращенной к экспериментатору.
- Зажмите кожу эмбриона с одним пинцетом и с другой вырваться кожу.
Примечание: Этот шаг должен быть повторен, пока кожа не полностью удаляется из передней части эмбриона.
- Поверните эмбрион переднюю сторону влево. С одной щипцов "придавить" эмбрион в передней части. С другими щипцов, возьмитесь за кожу и потяните на ростральной стороне эмбриона, чтобы разоблачить спинной мозг.
- Используйте одну сторону пинцетом, чтобы сократить мозговых оболочек, которые все еще обернуть спинной мозг. Спинной мозг сейчас подвергается и открытым.
- Расположите эмбриона переднюю сторону вправо.
- Отделить ткани из спинного мозга, начиная от шейки стороне эмбриона. Вставьте пинцет под спинного мозга (держать щипцы закрыты). ДляБелые грибы должны видны под спинного мозга. Небольшие вращательные движения под спинного мозга являются достаточными для отсоединения прилегающей ткани и ганглии задних корешков (DRG спинной).
- Перенести изолированный спинной мозг в новом капли холодной HBSS-6.5% глюкозы.
- Поместите спинной мозг в плоском положении, мозговых оболочек на верхней и передней стороне от экспериментатора.
- "Придавить" спинной мозг, используя оставшийся задний мозг с одним пинцетом, со второй щипцы захватить мозговых оболочек. Снимите мозговых оболочек, начиная с ростральной части спинного мозга.
4.2 комиссуральных Нейрон рассечение
- Зажмите задний мозг с одним щипцами.
- Спаечный нейронов расположены в наиболее боковой части спинного мозга (спинной стороне). Вырежьте эту боковую часть с тонкой скальпеля.
Примечание: дорсальной части спинного мозга можно отличить от вентральной части по разнице клеточной Density, вентральной части быть более непрозрачным.
Примечание: Чтобы вырезать обе стороны с тем же качеством, начать с ростральной стороны и поочередно вырезать небольшой длины с правой стороны и левой стороны.
- Сбережение рассеченные ткани в Neurobasal среды на льду для немедленного использования.
5. Лечение спаечного ткани с FP см
Примечание: Эта процедура не требует стерильных условий. Ткань должна быть собрана в отдельных 1,5 мл пробирки. Замороженный FP см должны использоваться только один раз. Избегайте многократного замораживание. Подготовьте теплую FP см (37 ° С).
5.1 Лечение комиссуральных нейронов
- Dilacerate спаечный ткани с маленькими ножницами.
Примечание: Обрежьте ткань как можно меньше, чтобы усиливать доступности клеток.
- Распределить довольно ткани между различными экспериментального лечения условия управления и FP см лечения.
- Центрифуга фрагментов тканей при 800 мкг в течение 1 мин при 4 ° С.
- Проверьте передел между трубками.
Примечание: При необходимости перераспределять и центрифуга снова до фрагментов равномерно распределены.
- Удалить супернатант.
- Добавить теплые FP см и контроля лечения к тканям.
Примечание: объем должен быть отрегулирован на сумму гранул и должно быть по крайней мере в два раза превышает объем таблетки.
- Инкубировать при 37 ° С в течение 30 мин.
Примечание: Аккуратно встряхните каждые 10-15 минут
- Центрифуга при 800 х г в течение 1 мин и удалить лечение.
- Добавить буфером для лизиса
Примечание: Громкость должна быть скорректирована в агора таблетки и должно быть по крайней мере вдвое объем осадка.
- Внесите вверх и вниз для ресуспендируют осадок.
Примечание: вихрь также может быть использован.
- Инкубировать 15 мин на льду.
- Центрифуга при 14000 мкг в течение 15 мин при 4 ° С.
- Хранить супернатант и измерить количество белка с Бредфорда 9.
- Добавить 6x Laemmli буфера.
- Инкубируют при 95 ° С в течение 5 мин для денатурации содержание белка.
Примечание: Образцы можно использовать сразу или можно хранить при -80 ° С
- Оценка последствий лечения вестерн-блоттинга 10.
Примечание: По крайней мере, 50 мкг общего белка должны быть загружены на каждой дорожке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Спаечный ткани были обработаны с помощью FP см и образцы были обработаны для анализа уровней рецепторов в вестерн-блоттинга. Применение FP см было показано, увеличить уровни рецептора руководства, PlexinA1, которая выступает посредником чувствительность комиссуральных аксонов к средней линии репеллента Semaphorin3B после пересечения (рис. 2). Это показало, что сигналы, опубликованным FP регулировать уровень PlexinA1 4,6.
Рисунок 1. Схемы процедуры вскрытия, чтобы изолировать плиты пола. Проиллюстрированы Различные этапы рассечения, а также порядок культуры. 1) отрезать эмбриона головой; 2-3) удалить кожу; 4) открыть мозговых оболочек; 5-6) удалить спинной мозг от эмбриона; 7) удалить мужчинInges; 8-9) рассекать из плиты пола; 10) добавить тромбина в смесь FP-плазменной и ждать от 10 до 15 мин при комнатной температуре перед добавлением культуральной среды. 11-12) рассекать из спинной нейронов; 13) Dilacerate ткани. : Передняя полюс эмбриона. Р: задний полюс эмбриона. Стрелки показывают направление движения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Представитель результат. А) Спинной спинного ткани были собраны, dilacerated и стимулировали плиты пола кондиционированной среды и контрольной среде. Образцы были лизированы и обработаны для вестерн-блоттинга. Белки зондировали антителами против PlexinA1 и β-актина. РХото иллюстрирует увеличение уровней PlexinA1 в образце вынужденного с пола пластина кондиционированной среды. B) дот-блот показана экспрессия GDNF в FP см по сравнению с Это контрольной среде.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Производство пола пластины кондиционированной среды обеспечивает эффективный и простой способ для оценки биологических свойств плиты перекрытия, опубликованным сигналов.
Плазма-тромбина матрица обеспечивает отличную условием выживания тканей. Тем не менее, это обогащенный среда может быть ограничением для некоторых типов экспериментов. Таким образом, плиты перекрытия ткани также могут быть выращены в агарозном матрицы. Качество этаж пластины кондиционированной среды можно оценить по обнаружению известных пола пластинчатых выпущенных сигналов, таких как GDNF (рис. 2), Shh и Netrin 11. Их присутствие в кондиционированной среде можно оценить с помощью Вестерн-блоттинга или дот-блота.
В этой процедуре клетки изучаются на родном микросреды. Это предотвращает дополнительную информацию о типе клеток в ткани, что реагировать на лечение. Как плиты перекрытия не однородная структура, концентрация актаIve компоненты, такие как Wnts может отличаться между культурами в зависимости от расчлененного области вдоль ростро-каудальном оси.
Биохимия на свежем dilacerated ткани имеет преимущество для изучения клеток в родном микросреды. Таким образом, сотовые поведения исследуются в условиях, которые воспроизводят как можно ближе родном контексте 12. Спинной спинной мозг не содержать только спаечный нейронов так эффекты FP см также могут быть оценены в культивируемых комиссуральных нейронов.
Носитель может быть применен к различным типам клеток и тканевых культур. Большой диапазон параметров можно оценить, из тождества клеток, выживаемость клеток, гибели клеток и дифференцировки клеток. Образцы могут быть обработаны для протеомики.
Важным параметром при подготовке dilacerated свежей ткани является передел ткани для контрольных и экспериментальных методов лечения. Это импортмуравей собирать ткани сначала в одной пробирке и Dilacerate ткани вместе предварительное отделить образцы. Это ограничивает разность концентрации белка обнаруженного после лизиса между образцами.
Следует отметить, что HBSS-глюкозы можно хранить при температуре 4 ° С в течение одного месяца. Neurobasal также может храниться в течение одного месяца при 4 ° С. B27 аликвоты могут храниться при температуре -20 ° С в течение длительного времени и при температуре 4 ° С в течение до одной недели. Плазменные аликвоты должны быть хранить при -20 ° С и может быть замораживать после использования. Тромбина аликвоты также можно хранить при температуре -20 ° C и не может быть замораживать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать
Acknowledgments
Мы благодарим Карине Kindbeiter, Мюриэль Ас и Florie Рейно за помощь. Работа выполнена при поддержке CNRS, программы ANR Йода и Labex DevWeCan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reagents Required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS, Ca2+/Mg2+- free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Plasma | Sigma | P-3266 | 1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thrombin | Sigma | T-4648 | 10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50x | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES (260 g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EDTA | Sigma | E-5513 | 0.5 M, pH 8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MgCl2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1.Reagents required. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tools and Materials | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microknives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Tools and materials. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell. Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Placzek, M., Briscoe, J. The floor plate: multiple cells, multiple signals. Nat. Rev. Neurosci. 6, 230-240 (2005).
- Chedotal, A. Further tales of the midline. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 68-75 (1016).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Ruiz de Almodovar, C., et al. VEGF mediates commissural axon chemoattraction through its receptor Flk1. Neuron. 70, 966-978 (2011).
- Charoy, C., et al. gdnf activates midline repulsion by Semaphorin3B via NCAM during commissural axon guidance. Neuron. 75, 1051-1066 (2012).
- Kiecker, C., Lumsden, A. The role of organizers in patterning the nervous system. Annu. Rev. Neurosci. 35, 347-367 (2012).
- Le Dreau, G., Marti, E. Dorsal-ventral patterning of the neural tube: a tale of three signals. Dev. Neurobiol. 72, 1471-1481 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J. Vis. Exp. , (2010).
- Salinas, P. C. The morphogen sonic hedgehog collaborates with netrin-1 to guide axons in the spinal cord. Trends Neurosci. 26, 641-643 (2003).
- Bechara, A., et al. FAK-MAPK-dependent adhesion disassembly downstream of L1 contributes to semaphorin3A-induced collapse. EMBO J. 27, 1549-1562 (2008).
