Summary
La piastra è una struttura fondamentale delle sviluppo del midollo spinale, che forniscono segnali diffusibili di progenitori e differenziazione dei neuroni. Descriviamo un metodo per produrre pavimento piatto mezzo condizionato, per applicarla al tessuto del midollo spinale fresco, e di valutare le conseguenze sulle proteine di interesse da biochimica.
Abstract
Durante lo sviluppo, progenitori e neuroni post-mitotici ricevono segnali da territori adiacenti che regolano il loro destino. Il pavimento piatto è un gruppo di cellule gliali di rivestimento del canale ependimale in posizione ventrale. Il piano piastra esprime morphogens chiave che contribuiscono al patterning di linee cellulari nel midollo spinale. Nelle fasi successive dello sviluppo, al piano piastra regola la navigazione degli assoni nel midollo spinale, agendo come barriera per impedire il passaggio degli assoni ipsilaterali e controllo attraversamento linea mediana da assoni commissurali 1. Queste funzioni sono raggiunti attraverso la secrezione di vari segnali di orientamento. Alcuni di questi segnali agiscono come attrattivi e repellenti per gli assoni crescenti mentre altri regolano recettori di orientamento e di segnalazione a valle di modulare la sensibilità degli assoni ai segnali locali di orientamento 2,3. Qui si descrive un metodo che consente di studiare le proprietà del pavimento piastra segnali derivati in una varietà di svicontesti lopmental, basate sulla produzione di medio Floor-Plate condizionata (FP cm) 4-6. Abbiamo poi esemplificare l'uso di questo FP cm nel contesto di guida degli assoni. In primo luogo, il midollo spinale è isolato da embrione di topo a E12.5 e il pavimento piastra è sezionato fuori e coltivato in una matrice plasma-trombina (Figura 1). Seconda due giorni dopo, il tessuto commissurali vengono sezionati fuori da embrioni E12.5, triturato ed esposto al cm FP. In terzo luogo, il tessuto vengono elaborati per l'analisi Western Blot dei marcatori commissurali.
Introduction
Il pavimento piastra è un centro patterning ben noto della sviluppo midollo spinale, che gioca un ruolo chiave nella specificazione dei progenitori e linee cellulari postmitotici e controllare la navigazione assone 7,8. La procedura sperimentale descritta qui di produrre FP cm consente agli investigatori di valutare le proprietà funzionali dei segnali piatto di derivazione piano di un diversi contesti di processi di sviluppo, di patterning cellulare e la sopravvivenza delle cellule e la migrazione degli assoni.
Per illustrare l'uso di tale FP cm, i tessuti del midollo spinale dorsale che contengono neuroni commissurali sono sezionati, dilacerated e stimolate con la FP cm. I tessuti possono poi essere elaborati per l'analisi Western Blot. Questo permette di indagare disposizioni della macchinari guida degli assoni dal pavimento piatto segnali rilasciati. Il metodo di trattamento di tessuto fresco dilacerated detiene il grande vantaggio di preservare il microambiente delle cellule all'interno the tessuto. Così le conseguenze del trattamento da FP cm o qualsiasi tipo di trattamento sono valutate in modo più fisiologico che in cellule e condizioni di coltura tissutale.
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Protocol
GIORNO 1
1. La dissezione del midollo spinale Piastra (FP) da E12.5 embrioni di topo
Nota: L'intera procedura richiede l'uso di condizioni di sterilità. È preferibile effettuare la dissezione sotto una cappa dissezione per evitare la contaminazione. La superficie della cappa deve essere pulito con etanolo. Tutti gli strumenti di dissezione devono essere sterilizzati e tenuti in una piastra di Petri sterile. I liquidi (medio, medio dissezione) devono essere mantenuti chiusi e messi in un bagno di ghiaccio. Ogni embrione deve essere raccolto in singoli fresco goccia. Questo è importante per la conservazione del tessuto. La dissezione viene eseguita con Dumont # 5 pinze. Per trasferire gli embrioni tra piatti, afferrare il cordone ombelicale o la testa senza alcun danno alla hindbrain. E 'fondamentale non danneggiare il midollo spinale per completare con successo la dissezione. Preparare freddo Soluzione tampone fosfato (PBS), soluzione salina bilanciata freddo di Hank (HBSS) -6,5% di glucosio e la temperatura stanza di medie Neurobasal.
1.1 spinale dissezione del cavo
Gli animali sono trattati secondo le linee guida di cura degli animali del Centre National de la Recherche Scientifique seguenti direttive europee. Il metodo di eutanasia è dislocazione cervicale, e composto di applicare pressione al collo e lussazione della colonna vertebrale dal cervello. Questo metodo è consigliato per modelli animali di topo, e può essere eseguito in modo veloce ed efficiente.
- Euthanize un mouse incinta a E12.5 di gestazione (E0.5 = primo giorno successivo stuoia). Posizionare il mouse lato ventrale.
- Mettere a bagno l'addome con il 70% di etanolo. Pizzicare la pelle dell'addome con pinze Adson e tagliare attraverso la pelle e gli strati peritoneali con forbici chirurgiche. Fare un'incisione e usarlo per tagliare su entrambi i lati del mouse per esporre la cavità addominale.
- Una stringa di embrioni è presente su ogni lato del mouse. Afferrare un corno delle uterus nel tessuto tra due embrioni e sezionarlo partendo dalla parte esterna. Trasferire l'utero intatto per una piastra di Petri 100 mm con PBS freddo su ghiaccio.
- Estrarre gli embrioni dai tessuti extra-embrionali. Afferrare il tessuto placentare (in rosso scuro) con due paia di pinze e tirare dolcemente a strappare il tessuto e rimuovere gli embrioni dal sacco uterina.
Nota: per una migliore conservazione, raccogliere gli embrioni dal loro sac uterino uno per uno.
- I prossimi passi sono fatti sotto lente di ingrandimento binoculare e cappuccio dissezione. Mettere un embrione in una goccia di freddo HBSS-6.5% di glucosio.
- Utilizzando pinze, decapitare l'embrione.
Nota: Tagliare tra la mandibola e la hindbrain, la parte posteriore del hindbrain è importante per i passi successivi.
- Posizionare la faccia ventrale dell'embrione giù con la parte anteriore rivolta verso lo sperimentatore.
- Pizzicare la pelledell'embrione con un paio di pinze e con l'altra coppia tirare via la pelle.
Nota: Questa operazione deve essere ripetuta fino a quando la pelle viene completamente rimosso dalla parte anteriore dell'embrione.
- Girare il lato embrione anteriore a sinistra. Con una pinza "fissare" l'embrione nella parte anteriore. Con le altre pinze afferrano la pelle e tirare verso la parte rostrale dell'embrione. Il midollo spinale è quindi accessibile.
- Utilizzare un lato della pinza per tagliare le meningi che ancora avvolgono il midollo spinale. Il midollo spinale è ora aperto.
- Girare il lato embrione anteriore a destra.
- Staccare il tessuto dal midollo spinale partendo dal lato cervicale dell'embrione. Far scorrere la pinza sotto il midollo spinale (le pinze devono essere tenute chiuse per evitare danni al midollo spinale). Le pinze devono essere visibili nel midollo spinale. Piccoli movimenti rotatori sotto il midollo spinale sono sufficienti a staccare l'tessuti e gangli delle radici dorsali (DRG) circostante.
Nota: Lasciando tessuto circostante divisoria aggiungere peso al midollo spinale, aumentando così la probabilità di rottura durante la fase successiva.
- Posizionare il midollo spinale isolato in una fresca goccia di freddo HBSS-6.5% di glucosio.
- Posizionare il midollo spinale in posizione pianeggiante, meningi sul lato superiore e anteriore distanti sperimentatore.
- "Pin down" il midollo spinale tramite il hindbrain rimanente con una pinza, e con la seconda pinza afferrare le meningi. Staccare le meningi a partire dal lato rostrale del midollo spinale.
Nota: Il movimento deve essere lento e costante per evitare qualsiasi rottura del midollo spinale. Movimenti vibratori possono facilitare il distacco delle meningi.
1.2 FP dissezione
- Stringere la hindbrain con una pinza.
- La FP è il TRA centralensparent parte del tessuto. Usando un bisturi tagliare il pavimento piatto.
Nota: Per tagliare entrambi i lati con la stessa qualità, partire dal lato rostrale e alternativamente tagliare il lato destro ed il lato sinistro della lastra di fondo.
- Conservare il FP sezionato in Neurobasal mezzo a temperatura ambiente.
2. FP Cultura
Nota: Tutti i passaggi devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di coltura di tessuti. Utilizzare mezzo fresco e integratori e reagenti appena scongelati. Preparare coprioggetto sterili di vetro, caldo Neurobasal + B27, plasma e HBSS-trombina.
2.1 cultura FP
- Posizionare diversi coprioggetto sterili in un piatto 100 millimetri Petri e pipetta 20 microlitri di plasma nel centro di ogni coprioggetto.
- Trasferire 2-4 FP in ciascuna goccia di plasma e aggiungere 20 microlitri HBSS-trombina accanto alla goccia plasma e miscelare accuratamente. Mantenere i coprioggettiper almeno dieci minuti alla temperatura ambiente per permettere la coagulazione del plasma.
Nota: Trasferimento due PQ in caso di dissezione completa e più in caso di dissezione parziale. Mescolare lentamente con un puntale ed evitare il contatto con gli espianti FP.
Il coagulo di plasma ritrae un paio di micron come un segno della coagulazione. La coagulazione non deve essere disattivato, per evitare il distacco del coagulo di plasma.
- Trasferire ogni vetrino in una piastra a 24 pozzetti e aggiungere 500 ml di Neurobasal + B27. Incubare 48 ore a 37 ° C.
GIORNO 3
3. FP condizionata Media (FP cm) raccolta
Nota: raccolta deve essere eseguita in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale. Se il surnatante è contaminato o se solai sono galleggianti (nel senso che potrebbe essere morto durante i peri culturaod) allora non raccogliere il cm FP da questo bene.
3.1 FP cm di raccolta
- Raccolta accuratamente il mezzo da ogni pozzetto.
Nota: Non dispensare il mix di plasma-trombina polimerizzato o eventuali frammenti di FP.
- Conservare aliquote di 100 microlitri a -80 ° C.
GIORNO 4
4. La dissezione del midollo spinale commissurale neuroni da E12.5 embrioni di topo
Nota: Questo preparato non deve essere eseguita in condizioni sterili. Seguire la procedura sopra descritta per raccogliere gli embrioni. Preparare PBS freddo, freddo HBSS-6.5% glucosio e Neurobasal freddo.
4.1 spinale dissezione del cavo
- Utilizzando pinze, decapitare l'embrione.
Nota: Taglio tra mandibola e hindbrain, la parte posteriore del hindbrain è importante per laprossimi passi.
- Posizionare la faccia ventrale dell'embrione giù in una goccia fresco con la parte anteriore rivolta verso l'sperimentatore.
- Pizzicare la pelle dell'embrione con una pinza e con l'altra tirare via la pelle.
Nota: Questa operazione deve essere ripetuta fino a quando la pelle viene completamente rimosso dalla parte anteriore dell'embrione.
- Girare il lato embrione anteriore a sinistra. Con una pinza "fissare" l'embrione nella parte anteriore. Con le altre pinze, afferrare la pelle e tirare verso il lato rostrale dell'embrione, per esporre il midollo spinale.
- Utilizzare un lato della pinza per tagliare le meningi che ancora avvolgono il midollo spinale. Il midollo spinale è ora esposta e aperta.
- Posizionare il lato anteriore dell'embrione a destra.
- Staccare il tessuto dal midollo spinale partendo dal lato cervicale dell'embrione. Far scorrere la pinza sotto il midollo spinale (tenere le pinze chiuse). Perfunghi porcini devono visibile sotto il midollo spinale. Piccoli movimenti rotatori sotto il midollo spinale sono sufficienti a staccare il tessuto adiacente e gangli delle radici dorsali (DRG).
- Trasferire il midollo spinale isolato in una nuova goccia di freddo HBSS-6.5% di glucosio.
- Posizionare il midollo spinale in posizione pianeggiante, meningi sul lato superiore e anteriore distanti sperimentatore.
- "Pin down" il midollo spinale tramite il hindbrain rimanente con una pinza, con la seconda pinza afferrare le meningi. Staccare le meningi a partire dal lato rostrale del midollo spinale.
4.2 commissurale Neuron dissezione
- Stringere la hindbrain con una pinza.
- I neuroni commissurale si trovano nella parte più laterale del midollo spinale (lato dorsale). Tagliare questa parte laterale con un bel bisturi.
Nota: La parte dorsale del midollo spinale può essere distinto dalla parte ventrale per differenza di cella densità, la parte ventrale essere più opaco.
Nota: Per tagliare entrambi i lati con la stessa qualità, partire dal lato rostrale e alternativamente tagliare una piccola lunghezza del lato destro e del lato sinistro.
- Conservare il tessuto sezionato in Neurobasal mezzo su ghiaccio per un uso immediato.
5. Trattamento del tessuto commissurale con l'cm FP
Nota: Questa procedura non richiede condizioni sterili. Il tessuto deve essere raccolto in singole provette da 1,5 ml. Il congelato FP cm deve essere utilizzato solo una volta. Evitare il ricongelamento aerei. Preparare calda cm FP (37 ° C).
5.1 Trattamenti di neuroni commissurali
- Dilacerate il tessuto commissurali con piccole forbici.
Nota: Tagliare il tessuto più piccolo possibile, per potenziare l'accessibilità delle cellule.
- Distribuire equamente il tessuto tra il diverso trattamento di controllo delle condizioni sperimentali e FP trattamento cm.
- Centrifugare i frammenti di tessuto a 800 xg per 1 min a 4 ° C.
- Controllare la ripartizione tra i tubi.
Avvertenza: Se necessario ridistribuire e centrifugare di nuovo fino frammenti sono equamente distribuiti.
- Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere i cm di controllo e trattamenti caldi FP ai tessuti.
Nota: Il volume deve essere regolato alla quantità di pellet e dovrebbe essere almeno il doppio del volume del pellet.
- Incubare a 37 ° C per 30 min.
Nota: Agitare delicatamente ogni 10-15 minuti
- Centrifugare a 800 xg per 1 minuto e rimuovere il trattamento.
- Aggiungere il tampone di lisi
Nota: il volume deve essere regolato a unmontaggio del pellet e dovrebbe essere almeno il doppio del volume del pellet.
- Pipetta su e giù per risospendere il pellet.
Nota: Un vortice può anche essere usato.
- Incubare 15 min in ghiaccio.
- Centrifugare a 14000 g per 15 min a 4 ° C.
- Conservare il surnatante e misurare la quantità di proteina con un saggio Bradford 9.
- Aggiungi 6x Laemmli Buffer.
- Incubare a 95 ° C per 5 minuti per denaturare il contenuto proteico.
Nota: I campioni possono essere utilizzati immediatamente o possono essere conservati a -80 ° C.
- Valutare gli effetti del trattamento mediante Western blot 10.
Nota: Almeno 50 microgrammi di proteine totali dovrebbero essere caricati per ogni corsia.
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Representative Results
Commessurali tessuti sono stati trattati dal cm FP ed i campioni sono stati processati per l'analisi dei livelli di recettore in Western blot. Applicazione delle cm FP ha mostrato di aumentare i livelli di un recettore orientamento, PlexinA1, che media la sensibilità degli assoni commessurali alla linea mediana repellente Semaphorin3B dopo aver attraversato (Figura 2). Ciò ha rivelato che i segnali diffusi dalla FP regolare i livelli di PlexinA1 4,6.
Figura 1. Schemi di procedura di dissezione per isolare la lastra di fondo. Vengono illustrate le varie fasi della dissezione e la procedura di coltura. 1) tagliare la testa dell'embrione, 2-3), togliere la pelle; 4) aprire le meningi, 5-6) togliere il midollo spinale dall'embrione, 7) rimuovere gli uominiingestione, 8-9) sezionare la piastra; 10) aggiungere la trombina per il mix FP-plasma e attendere 10-15 minuti a temperatura ambiente prima di aggiungere al terreno di coltura. 11-12) sezionare i neuroni dorsali; 13) dilacerate tessuto. A: anteriore polo dell'embrione. P: polo posteriore dell'embrione. Le frecce rappresentano la direzione del movimento. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Risultato rappresentativo. A) tessuto spinale dorsale sono stati raccolti, dilacerated e stimolato con la piastra Piano terreno condizionato e mezzo di controllo. I campioni sono stati lisati e trattati per Western blot. Le proteine sono stati sondati con anticorpi anti-PlexinA1, e β-actina. Il poto illustra l'aumento dei livelli PlexinA1 nel campione stimolato con il pavimento piastra mezzo condizionato. B) Il dot blot mostra l'espressione di GDNF in FP cm rispetto ad esso di terreno di controllo.
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Discussion
La produzione di pavimento-plate mezzo condizionato fornisce un modo efficace e semplice per valutare le proprietà biologiche del piatto piano segnali rilasciati.
La matrice di plasma-trombina offre ottime condizioni per la sopravvivenza del tessuto. Tuttavia, questo ambiente arricchito potrebbe essere una limitazione per alcuni tipi di esperimenti. Pertanto, il tessuto piastra può essere coltivato in matrice di agarosio. La qualità del mezzo piastra condizionata può essere valutato dalla rilevazione di pavimento-piastra segnali rilasciati noti, quali GDNF (Figura 2), Shh e Netrin 11. La loro presenza nel terreno condizionato può essere valutata mediante Western blot o dot blot.
In questa procedura cellule vengono studiati nel loro microambiente nativo. Questo impedisce ulteriori informazioni sul tipo di cellule nel tessuto che reagiscono al trattamento. Poiché la lastra di fondo non è una struttura omogenea, la concentrazione di attocomponenti ive come Wnts potrebbero essere differenti tra le culture seconda della zona sezionato lungo l'asse rostro-caudale.
Biochimica sul tessuto fresco dilacerated tiene il vantaggio di studiare le cellule nel loro microambiente nativo. Così, i comportamenti cellulari sono studiati in condizioni che ricapitolano il più possibile il loro contesto originario 12. Il midollo spinale dorsale non contiene solo i neuroni commissurali così gli effetti della FP cm possono essere valutate anche in neuroni in coltura commissurali.
Il terreno può essere applicata a diversi tipi di colture cellulari e tissutali. Una vasta gamma di parametri può essere valutata, dall'identità cellulare, la sopravvivenza cellulare, apoptosi e differenziazione cellulare. I campioni possono essere trattati per proteomica.
Un parametro importante della preparazione del tessuto fresco dilacerated è la ripartizione del tessuto per il controllo e trattamenti sperimentali. E 'importformica per raccogliere i tessuti prima in un unico tubo e dilacerate tessuto collettivamente prima separare i campioni. Questo limita la differenza di concentrazione di proteina rilevata dopo lisi tra i campioni.
Si noti che HBSS-glucosio può essere conservato a 4 ° C per un mese. Neurobasal può anche essere conservato per un mese a 4 ° C. Aliquote B27 possono essere conservati a -20 ° C per il lungo termine ed a 4 ° C per un massimo di una settimana. Aliquote di plasma dovrebbero essere conservare a -20 ° C e possono essere ricongelati dopo l'uso. Aliquote trombina possono essere conservati a -20 ° C e non possono essere ricongelati.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare
Acknowledgments
Ringraziamo Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, e Florie Reynaud per il loro aiuto. Il lavoro è supportato dal CNRS, programma ANR YODA e Labex DevWeCan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reagents Required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS, Ca2+/Mg2+- free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Plasma | Sigma | P-3266 | 1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thrombin | Sigma | T-4648 | 10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50x | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES (260 g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EDTA | Sigma | E-5513 | 0.5 M, pH 8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MgCl2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1.Reagents required. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tools and Materials | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microknives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Tools and materials. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
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