Summary
Le plancher est une structure essentielle des neurones de la moelle épinière en développement, fournissant des signaux diffusibles de progéniteurs et la différenciation. Nous décrivons une méthode pour produire des varangues milieu conditionné, à appliquer au tissu de la moelle épinière frais, et d'évaluer les conséquences sur les protéines d'intérêt par la biochimie.
Abstract
Au cours du développement, les progéniteurs et les neurones post-mitotiques reçoivent des signaux de territoires adjacents qui régulent leur sort. La plaque de sol est un groupe de cellules gliales tapissant le canal épendymaire en position ventrale. La plaque de sol exprime morphogènes clés contribuant à la structuration de lignées de cellules dans la moelle épinière. À des stades de développement plus tard, la plaque de sol réglemente la navigation des axones de la moelle épinière, agissant comme une barrière pour empêcher le passage des axones homolatéraux et franchissement de la ligne médiane de contrôle par les axones commissure 1. Ces fonctions sont réalisées grâce à la sécrétion de diverses signaux de guidage. Certains de ces indices agir comme attractifs et répulsifs pour les axones en croissance tandis que d'autres réglementent les récepteurs d'orientation et de signalisation en aval de moduler la sensibilité des axones aux 2,3 signaux de guidage locales. Nous décrivons ici une méthode qui permet l'étude des propriétés des signaux provenant du sol plaque dans une variété de dévecontextes lopmental, sur la base de la production de support de plancher Plate conditionné (FP cm) 4-6. Nous illustrons ensuite l'utilisation de ce FP cm dans le cadre de guidage axonal. Tout d'abord, la moelle épinière est isolé à partir d'embryons de souris à E12.5 et de la plaque de fond est disséqué et cultivées dans une matrice plasma-thrombine (figure 1). Deuxième deux jours plus tard, le tissu commissure sont disséqués à partir d'embryons E12.5, trituré et exposé à la FP cm. Troisièmement, le tissu est traité pour analyse par Western blot de marqueurs commissure.
Introduction
La plaque de sol est un centre de formation de motif bien connu de la moelle épinière en développement, jouent un rôle clé dans la spécification des progéniteurs et les lignées de cellules post-mitotiques et contrôler la navigation des axones 7,8. La procédure expérimentale décrite ici pour produire FP cm permet aux enquêteurs d'évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux de plaque dérivé étage dans un des contextes différents des processus de développement, de la structuration et la survie cellulaire à cellulaire et la migration des axones.
Pour illustrer l'utilisation de tels FP cm, les tissus de la moelle épinière dorsale contenant des neurones commissurales sont disséqués, dilacérées et stimulées avec du FP cm. Les tissus peuvent ensuite être traitées pour l'analyse Western blot. Cela permet d'instruction des règlements de la machine de guidage axonal par des signaux libérés plancher plat. Procédé de traitement de tissu frais dilacérées maintient le grand avantage de conserver le micro-environnement des cellules au sein de ee tissu. Ainsi, les conséquences du traitement par FP cm ou n'importe quels types de traitement sont évaluées de façon plus physiologique que dans des conditions de culture cellulaire et tissulaire.
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Protocol
JOUR 1
Une. Dissection de la moelle épinière étage Plate (FP) de E12.5 embryons de souris
Remarque: L'ensemble de la procédure nécessite l'utilisation de conditions stériles. Il est préférable d'effectuer la dissection sous une hotte à dissection pour éviter la contamination. La surface de la hotte doit être nettoyé avec de l'éthanol. Tous les instruments de dissection doivent être stérilisés et conservés dans une boîte de Pétri stérile. Les liquides (milieu, le milieu de dissection) doivent être maintenus fermés et mis dans un bain de glace. Chaque embryon doit être recueilli dans goutte frais individu. Ceci est important pour la préservation des tissus. La dissection est réalisée avec Dumont # 5 forceps. Pour transférer les embryons entre plats, saisir le cordon ombilical ou la tête sans aucun dommage pour le cerveau postérieur. Il est essentiel de ne pas endommager la moelle épinière pour mener à bien la dissection. Préparer froid tampon phosphate salin (PBS), solution saline équilibrée de Hank froide (HBSS) -6,5% de glucose et d'une salle moyenne neurobasal de température.
1.1 vertébrale dissection du cordon
Les animaux sont traités selon les directives de protection des animaux du Centre National de la Recherche Scientifique suivantes directives européennes. Le procédé de l'euthanasie est dislocation cervicale, il consiste à appliquer une pression sur le col et la dislocation de la colonne vertébrale à partir du cerveau. Cette méthode est recommandée pour les modèles animaux de la souris, et peut être effectuée d'une manière rapide et efficace.
- Euthanasier une souris enceinte à E12.5 de gestation (0,5 ME = nattes premier jour suivant). Placez la souris face ventrale.
- Faire tremper l'abdomen avec 70% d'éthanol. Pincer la peau de l'abdomen avec une pince Adson et couper à travers la peau et les couches péritonéale avec des ciseaux chirurgicaux. Faire une incision et l'utiliser pour couper des deux côtés de la souris pour exposer la cavité abdominale.
- Une chaîne d'embryons est présent sur chaque côté de la souris. Saisissez une corne de l'uterus dans le tissu entre les deux embryons et disséquer rupture à partir de la partie extérieure. Transférer l'utérus intact pour une boîte de Pétri de 100 mm avec du PBS froid sur la glace.
- Extraire les embryons à partir de tissus extra-embryonnaires. Saisissez le tissu placentaire (en rouge foncé) avec deux paires de pinces et tirez doucement pour déchirer le tissu et éliminer les embryons du sac de l'utérus.
Remarque: Pour une meilleure conservation, la collecte des embryons de leur utérus sac un par un.
- Les prochaines étapes sont effectuées sous loupe binoculaire et dissection capot. Placez un embryon dans une goutte de froid HBSS-glucose 6,5%.
- En utilisant des pinces, décapiter l'embryon.
Remarque: Couper entre la mâchoire inférieure et le cerveau postérieur, la partie postérieure de la rhombencéphale est important pour les prochaines étapes.
- Placez l'embryon face ventrale vers le bas avec la partie antérieure face à l'expérimentateur.
- Pincer la peaude l'embryon avec une paire de forceps et avec l'autre paire se détacher de la peau.
Remarque: Cette étape doit être répétée jusqu'à ce que la peau est complètement retiré de la partie antérieure de l'embryon.
- Tournez le côté embryon antérieure à la gauche. Avec une pince "cerner" l'embryon dans la partie antérieure. Avec les autres pinces saisissent la peau et tirez vers le côté rostral de l'embryon. La moelle épinière est alors accessible.
- Utilisez un côté de la pince pour couper les méninges qui enveloppent encore la moelle épinière. La moelle épinière est maintenant ouvert.
- Tournez le côté embryon antérieure à la droite.
- Détacher le tissu de la moelle épinière à partir du côté du col de l'embryon. Faites glisser la pince sous la moelle épinière (les pinces doivent être tenus fermés pour éviter d'endommager la moelle épinière). Les pinces doivent être visibles dans la moelle épinière. Petits mouvements de rotation en vertu de la moelle épinière sont suffisantes pour détacher latissu et le ganglion de la racine dorsale (DRG) entourant.
Remarque: Laisser les tissus environnants attaché ajouter du poids à la moelle épinière, ce qui augmente la probabilité de casser lors de l'étape suivante.
- Placez la moelle épinière isolée dans une nouvelle goutte de froid HBSS-glucose 6,5%.
- Placer la colonne vertébrale dans une position à plat, les méninges sur la face supérieure et antérieure à une distance à partir de l'expérimentateur.
- "Cerner" la moelle épinière à l'aide du cerveau postérieur restant avec une pince, et avec les deuxièmes pinces saisissent les méninges. Décoller les méninges à partir du côté rostrale de la moelle épinière.
Remarque: le mouvement doit être lente et constante afin d'éviter toute rupture de la moelle épinière. Mouvements vibratoires peuvent faciliter le détachement des méninges.
1.2 FP dissection
- Pincez le cerveau postérieur avec une pince.
- Le FP est la tra centralnsparent partie du tissu. Avec un scalpel découper la plaque de sol.
Remarque: Pour couper les deux côtés avec la même qualité, commencer par la face rostrale et couper alternativement du côté droit et le côté gauche de la plaque de sol.
- Conserver la FP disséqué en milieu Neurobasal à la température ambiante.
2. FP Culture
Remarque: Toutes les mesures doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte de culture de tissu. Utilisez milieu frais et les suppléments et les réactifs fraîchement décongelé. Préparer des lamelles de verre stériles, neurobasal chaud + B27, le plasma et HBSS-thrombine.
2.1 FP culture
- Placer plusieurs lamelles stériles dans une boîte de Petri de 100 mm et la pipette 20 ul de plasma dans le centre de chaque lamelle.
- Transfert de deux à quatre FP dans chaque goutte de plasma et d'ajouter 20 ul de HBSS-thrombine à côté de la chute de plasma et mélanger soigneusement. Gardez les lamellespendant au moins dix minutes à température ambiante pour permettre la coagulation du plasma.
Remarque: Le transfert de deux MF en cas de dissection complète et plus en cas de dissection partielle. Mélanger doucement avec une pipette et éviter tout contact avec des explants de PF.
Le caillot de plasma se rétracte quelques um comme un signe de la coagulation. La coagulation ne doit pas être interrompue prématurément, afin d'éviter le détachement du caillot de plasma.
- Transférer chaque lamelle dans une plaque de 24 puits et ajouter 500 ul de Neurobasal + B27. Incuber 48 heures à 37 ° C.
JOUR 3
3. FP milieu conditionné (FP cm) récolte
Remarque: La récolte doit être effectuée dans des conditions stériles dans une hotte de culture de tissu. Si le surnageant est contaminé ou si les plaques de sol sont flottantes (ce qui signifie qu'ils aurait pu mourir pendant les péri de la cultureod) alors ne pas récolter la FP cm à partir de ce bien.
3.1 FP cm récolte
- Récolter soigneusement le milieu de chaque puits.
Note: Ne pas pipeter le mélange plasma-thrombine polymérisé ou des fragments de PF.
- Stocker des aliquotes de 100 ul à -80 ° C.
JOUR 4
4. Dissection de la moelle épinière Commissural neurones de E12.5 embryons de souris
Remarque: Cette préparation n'a pas besoin d'être effectuées dans des conditions stériles. Suivez la procédure décrite ci-dessus pour recueillir les embryons. Préparer PBS froid, froid HBSS-6.5% de glucose et neurobasal froid.
4.1 vertébrale dissection du cordon
- En utilisant des pinces, décapiter l'embryon.
Remarque: Couper entre la mâchoire inférieure et le cerveau postérieur, la partie postérieure du cerveau postérieur est important pour l'prochaines étapes.
- Placez l'embryon face ventrale dans une nouvelle chute avec la partie antérieure face à l'expérimentateur.
- Pincer la peau de l'embryon avec une pince et l'autre se détacher de la peau.
Remarque: Cette étape doit être répétée jusqu'à ce que la peau est complètement retiré de la partie antérieure de l'embryon.
- Tournez le côté embryon antérieure à la gauche. Avec une pince "cerner" l'embryon dans la partie antérieure. Avec les autres pinces, saisir la peau et tirez vers le côté rostral de l'embryon, d'exposer la moelle épinière.
- Utilisez un côté de la pince pour couper les méninges qui enveloppent encore la moelle épinière. La moelle épinière est maintenant exposée et ouverte.
- Placez la face antérieure de l'embryon vers la droite.
- Détacher le tissu de la moelle épinière à partir du côté du col de l'embryon. Faites glisser la pince sous la moelle épinière (maintenir la pince fermée). Pourcèpes doivent visible sous la moelle épinière. Petits mouvements de rotation en vertu de la moelle épinière sont suffisantes pour détacher le tissu adjacent et le ganglion de la racine dorsale (DRG).
- Transférer la moelle épinière isolée dans une nouvelle goutte de froid HBSS-glucose 6,5%.
- Placer la colonne vertébrale dans une position à plat, les méninges sur la face supérieure et antérieure à une distance à partir de l'expérimentateur.
- "Cerner" la moelle épinière à l'aide du cerveau postérieur restant avec une pince, avec les deuxièmes pinces saisissent les méninges. Décoller les méninges à partir du côté rostrale de la moelle épinière.
4.2 Commissural Neuron dissection
- Pincez le cerveau postérieur avec une pince.
- Les neurones commissurales sont situés dans la partie la plus latérale de la moelle épinière (le côté dorsal). Découpez cette partie latérale avec un scalpel fin.
Remarque: La partie dorsale de la moelle épinière peut être distinguée de la partie ventrale par la différence de cellule densité, la partie ventrale est plus opaque.
Remarque: Pour couper les deux côtés avec la même qualité, commencer par la face rostrale et couper alternativement une petite longueur du côté droit et du côté gauche.
- Conserver le tissu disséqué en milieu Neurobasal sur la glace pour une utilisation immédiate.
5. Traitement des tissus Commissural avec le FP cm
Remarque: Cette procédure ne nécessite pas de conditions stériles. Le tissu doit être prélevé dans les différents tubes de 1,5 ml. La gelée FP cm doit être utilisé qu'une seule fois. Évitez regel multiples. Préparer chaud FP cm (37 ° C).
5.1 Traitements de neurones commissure
- Dilacerate la commissure tissu avec de petits ciseaux.
Remarque: couper le tissu le plus petit possible, afin de potentialiser l'accessibilité des cellules.
- Répartir équitablement le tissu entre les différents expérimental de traitement des conditions de contrôle et FP cm traitement.
- Centrifuger les fragments de tissus à 800 x g pendant 1 min à 4 ° C.
- Vérifiez la répartition entre les tubes.
Remarque: Si nécessaire redistribuer et centrifuger à nouveau jusqu'à ce que les fragments sont répartis de manière égale.
- Retirer le surnageant.
- Ajouter les PF cm et de contrôle des traitements chauds pour les tissus.
Remarque: le volume doit être ajustée à la quantité de la pastille et doit être au moins deux fois le volume du culot.
- Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
Remarque: Secouer doucement toutes les 10-15 min
- Centrifuger à 800 g pendant 1 min et retirez le traitement.
- Ajouter le tampon de lyse
Remarque: Le volume doit être ajusté à l'unmontage de la pastille et doit être au moins deux fois le volume du culot.
- Introduire à la pipette de haut en bas pour remettre en suspension le culot.
Remarque: un tourbillon peut également être utilisé.
- Incuber 15 min sur la glace.
- Centrifuger à 14 000 g pendant 15 min à 4 ° C.
- Gardez le surnageant et mesurer la quantité de protéine avec un dosage de Bradford 9.
- Ajouter 6x Laemmli tampon.
- Incuber à 95 ° C pendant 5 min pour dénaturer la teneur en protéines.
Note: Les échantillons peuvent être utilisés immédiatement ou sont conservés à -80 ° C.
- Évaluer les effets du traitement par Western blot 10.
Remarque: Au moins 50 pg de protéines totales devraient être chargés pour chaque voie.
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Representative Results
Commissurales tissus ont été traités par le FP cm et les échantillons ont été traités pour l'analyse des niveaux des récepteurs de Western blot. Application de la FP cm a été montré pour augmenter les niveaux d'un récepteur d'orientation, PlexinA1, qui médiatise la sensibilité des axones commissure de la ligne médiane répulsif Semaphorin3B après avoir traversé (Figure 2). Cette étude a révélé que les signaux libérés par la FP régulent les niveaux PlexinA1 4,6.
Figure 1. Schémas de la procédure de dissection d'isoler la plaque de sol. Les différentes étapes de la dissection et la procédure de la culture sont illustrés. 1) couper la tête de l'embryon; 2-3) enlever la peau; 4) ouvrir les méninges; 5-6) retirer la moelle épinière de l'embryon; 7) retirer les hommesingestion; 8-9) dissèquent la plaque de fond 10) ajouter la thrombine au mélange FP-plasma et attendre 10 à 15 minutes à température ambiante avant d'ajouter le milieu de culture. 11-12) disséquer les neurones dorsaux; 13) dilacerate le tissu. A: pôle antérieure de l'embryon. P: pôle postérieur de l'embryon. Les flèches représentent la direction du mouvement. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Résultat représentatif. A) tissu de la moelle dorsale ont été collectées, dilacérées et stimulées avec la plaque de plancher du milieu conditionné et fluide de commande. Les échantillons ont été lysées et traitées pour buvardage de Western. Les protéines ont été sondées avec des anticorps anti-PlexinA1, et β-actine. Le photo illustre l'augmentation des niveaux PlexinA1 dans l'échantillon stimulé avec la plaque de sol milieu conditionné. B) La dot blot montre l'expression de GDNF dans FP cm par rapport à cette moyenne de commande.
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Discussion
La production de plaque de sol milieu conditionné fournit un moyen simple et efficace pour évaluer les propriétés biologiques des signaux libérés de la plaque de sol.
La matrice de plasma-thrombine offre une excellente condition de la survie de tissu. Néanmoins, cet environnement enrichi pourrait être une limitation pour certains types d'expériences. Ainsi, le tissu de la plaque de fond peut également être cultivé dans une matrice d'agarose. La qualité de la plaque de sol milieu conditionné peut être évaluée par la détection de signaux connus sol plaque libérés, comme gdnf (figure 2), Shh et Netrin 11. Leur présence dans le milieu conditionné peut être évaluée par Western blot ou dot blot.
Dans cette procédure, les cellules sont étudiés dans leur microenvironnement natif. Ceci permet d'éviter en outre des informations sur le type de cellules dans le tissu qui réagissent au traitement. Comme la plaque de fond n'est pas une structure homogène, la concentration de l'acteive composants tels que les Wnt peuvent être différentes entre les cultures en fonction de la zone disséqué le long de l'axe rostro-caudal.
Biochimie sur le tissu dilacérées frais détient l'avantage à étudier les cellules dans leur microenvironnement natif. Ainsi, les comportements cellulaires sont étudiées dans des conditions qui récapitulent aussi près que possible de leur contexte natif 12. La moelle épinière dorsale ne contient pas seulement les neurones commissure de sorte que les effets de la FP cm peuvent également être évaluées dans les neurones en culture commissure.
Le milieu peut être appliquée à divers types de cultures de cellules et de tissus. Un grand nombre de paramètres peut être évalué, à partir de l'identité cellulaire, la survie cellulaire, la mort cellulaire et la différenciation cellulaire. Les échantillons peuvent être traités pour la protéomique.
Un paramètre important de la préparation du tissu frais dilacérées est la répartition du tissu pour le contrôle et les traitements expérimentaux. Il est à l'importationant de collecter les tissus d'abord dans un seul tube et le tissu à dilacerate collectivement avant de séparer les échantillons. Ceci limite la différence de concentration de protéine détectée après lyse entre les échantillons.
Notez que HBSS-glucose peut être stocké à 4 ° C pendant jusqu'à un mois. Neurobasal peut également être conservé pendant un mois à 4 ° C. B27 aliquotes peuvent être stockées à -20 ° C pour le long terme et à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine. aliquotes de plasma doivent être conserver à -20 ° C et peuvent être recongelé après utilisation. Des aliquotes de la thrombine peuvent également être stockés à -20 ° C et ne peuvent pas être recongelé.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler
Acknowledgments
Nous remercions Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, et Florie Reynaud pour leur aide. Le travail est soutenu par le CNRS, le programme ANR YODA et Labex DevWeCan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Reagents Required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HBSS, Ca2+/Mg2+- free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Plasma | Sigma | P-3266 | 1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Thrombin | Sigma | T-4648 | 10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50x | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| HEPES (260 g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EDTA | Sigma | E-5513 | 0.5 M, pH 8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| MgCl2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 1.Reagents required. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Tools and Materials | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Microknives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Table 2. Tools and materials. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
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