Culture of Isolert Floor Plate Tissue og Produksjon av kondisjonerte medium å vurdere funksjonelle egenskaper gulvplate utgitt Signaler

Summary

En gulvplate er en viktig struktur av utviklingsryggmargen, gir diffusible signaler til stamfedre og differensierende nevroner. Vi beskriver en metode for å produsere gulv-plate kondisjonerte medium, for å bruke den på ny ryggmargsvevet, og for å vurdere konsekvensene av proteiner som er av interesse ved biokjemi.

Abstract

Under utvikling, stamfedre og post-mitotiske nevroner mottar signaler fra tilstøtende områder som regulerer deres skjebne. I gulv-plate er en gruppe av gliaceller lining ependymal kanalen ved ventral stilling. Gulvet-plate uttrykker viktige morphogens bidrar til fordelingen av celle linjene i ryggmargen. Ved senere utviklingsstadier, gulvplate regulerer navigering av axoner i ryggmargen, som fungerer som en barriere for å hindre kryssing av ipsilaterale axoner og kontrollerende midtlinjen krysset ved commissural axons ^en. Disse funksjoner oppnås ved sekresjon av forskjellige lede signaler. Noen av disse stikkordene fungere som lokkemidler for de voksende axons mens andre regulerer veiledning reseptorer og nedstrøms signal å modulere følsomheten av axoner til de lokale veiledningspekepinner ^2,3. Her beskriver vi en fremgangsmåte som gjør det mulig å undersøke egenskapene til gulv-plate avledet signaler i forskjellige utviklopmental sammenhenger, basert på produksjon av gulv-Plate kondisjonerte medium (FP ^{cm) 4-6.} Deretter eksemplifiserer bruken av denne FP ^cm i sammenheng med axon veiledning. Først blir ryggmargs isolert fra mus embryo ved E12.5 og gulv-platen blir dissekert ut og dyrket i et plasma-trombin matriks (figur 1). Andre to dager senere, er commissural vev dissekert ut fra E12.5 embryoer, triturert og utsatt for FP ^cm. For det tredje er vevet behandles for Western blot analyse av fugedannende markører.

Introduction

Gulvet-plate er et velkjent mønster sentrum av utviklingsryggmargen, som spiller nøkkelroller i spesifikasjonen av stamfedre og postmitotic celle slektslinjer og kontrollerende axon navigasjon ^7,8. Den eksperimentelle fremgangsmåte som er beskrevet her for å produsere FP ^cm kan undersøkere for å vurdere de funksjonelle egenskaper av gulvplate-avledede signaler i en ulike sammenhenger av utviklingsprosesser, fra celle mønster og overlevelse til celle og axon migrasjon.

For å illustrere anvendelsen av en slik FP ^cm, er ryggryggmargsvev som inneholder commissural neuroner dissekert, dilacerated og stimulert med FP ^cm. Vevet kan så bli behandlet for Western blot analyse. Dette gjør det mulig å undersøke reguleringer av axon veiledning maskiner av gulv-plate utgitt signaler. Metoden for behandling av dilacerated friskt vev har den store fordelen av å bevare den mikromiljøet av celler innenfor the vev. Dermed konsekvensene av behandlingen av FP ^cm eller noen typer behandling vurderes i et mer fysiologisk måte enn i celler og vev kultur forhold.

Protocol

DAG 1

En. Disseksjon av ryggmargen gulvplate (FP) fra E12.5 mus embryoer

Merk: Hele prosedyren krever bruk av sterile forhold. Det er foretrukket å utføre disseksjon under en disseksjon hette for å unngå forurensning. Overflaten av hetten bør renses med etanol. Alle disseksjon instrumenter må steriliseres og oppbevares i en steril petriskål. Væskene (medium, disseksjon medium) må holdes lukket og satt i et isbad. Hvert embryo skal samles i individuelle fersk dråpe. Dette er viktig for vev bevaring. Disseksjon utføres med Dumont # 5 tang. For å overføre embryoene mellom rettene, grep den navlestreng eller hodet uten noen skade på hindbrain. Det er viktig ikke å skade ryggmargen for å fullføre disseksjon. Forbered kaldt fosfatbufret saltvann (PBS), kald Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -6,5% glukose og romtemperatur Neurobasal medium.

1.1 Ryggmargs disseksjon

Dyr blir behandlet i henhold til retningslinjene dyr omsorg av Centre National de la Recherche Scientifique følgende europeiske direktiver. Metoden for eutanasi er cervical dislokasjon, det består av påføring av trykk til halsen og dislocating ryggsøylen fra hjernen. Denne metoden anbefales for musedyremodeller, og kan utføres på en rask og effektiv måte.

1. Avlive en gravid mus på E12.5 av svangerskapet (E0.5 = første dag etter matting). Plasser musen ventral siden opp.
2. Sug i magen med 70% etanol. Klem huden på magen med Adson tang og skjære gjennom huden og peritoneal lag med kirurgisk saks. Lag et snitt og bruke den til å kutte på begge side av musen til å eksponere bukhulen.
3. En streng av embryoer er til stede på hver side av musen. Ta tak ett horn av uterus i vevet mellom to embryoer og dissekere den ut med start fra ytre del. Overfør intakt uterus til en 100 mm petriskål med kald PBS på is.
4. Pakk ut embryoer fra ekstra-embryonale vev. Ta tak i placenta vev (i mørk rød) med to par pinsett og dra sakte å rive vevet og fjerner embryoene fra livmor sac.

Merk: For en bedre bevaring, samle embryoer fra sin livmor sac en etter en.

5. De neste trinnene er gjort under kikkerten forstørrelsesglass og disseksjon hette. Plasser ett embryo i en dråpe kaldt HBSS-6,5% glukose.
6. Bruk pinsett, halshogge embryoet.

Merk: Klipp mellom underkjeven og hindbrain, er den bakre delen av hindbrain viktig for de neste trinnene.

7. Plasser embryo ventral ansiktet ned med den fremre delen som vender mot eksperimentator.
8. Klyp hudenav embryoet med en pinsett, og med det andre paret trekker bort huden.

Merk: Dette trinnet må gjentas inntil huden er helt fjernet fra den fremre delen av embryo.

9. Snu embryo fremre side til venstre. Med en tang "peke ut" fosteret i den fremre delen. Med de andre tang ta tak i huden og dra mot rostral side av embryo. Ryggmargen er deretter tilgjengelig.
10. Bruk den ene siden av tang for å klippe hjernehinnene som fortsatt brytes ryggmargen. Ryggmargen er nå åpen.
11. Snu embryo fremre side til høyre.
12. Ta av vev fra ryggmargen med start fra den cervikale side av embryo. Skyv tang under ryggmargen (tang skal holdes lukket for å unngå ryggmargen skade). Pinsett må være synlig under ryggmargen. Små roterende bevegelser under ryggmargen er tilstrekkelig til å ta avomkringliggende vev og dorsal root ganglia (DRG).

Merk: Leaving festet omliggende vev legge vekt på ryggmargen, og dermed øke sannsynligheten for å bryte det i løpet av neste trinn.

13. Plasser isolert ryggmarg i en frisk dråpe kald HBSS-6,5% glukose.
14. Plasser ryggmargen i en flat posisjon, hjernehinnene på toppen og fremre side bort fra eksperimentator.
15. "Pin ned" ryggmargen ved hjelp av den gjenværende hindbrain med en pinsett, og med de andre tang hente hjernehinnene. Skrelle av hjernehinnene start fra rostral side av ryggmargen.

Merk: Den bevegelsen bør være langsom og konstant for å unngå brudd i ryggmargen. Vibrerende bevegelser kan lette avløsning av hjernehinnene.

1,2 FP disseksjon

1. Klem hindbrain med en tang.
2. FP er den sentrale transparent del av vevet. Ved hjelp av en skalpell kutte ut gulvplate.

Merk: For å kutte begge sider med samme kvalitet, start fra rostral side og vekselvis kutte høyre side og venstre side av gulvplaten.

3. Bevare dissekert FP i Neurobasal medium ved romtemperatur.

2. FP Kultur

Merk: Alle trinn skal utføres under sterile forhold i en vev kultur hette. Bruk frisk medium og ferske tinte kosttilskudd og reagenser. Forbered sterile glass dekkglass, varm Neurobasal + B27, plasma og HBSS-trombin.

2,1 FP kultur

1. Plasser flere sterile dekkglass i en 100 mm petriskål og 20 ul plasma pipetteres i midten av hver dekkglass.
2. Overfør 03:58 FP i hver plasma slipp og legge 20 mL HBSS-trombin ved siden av plasma slipp og forsiktig bland. Hold Dekki minst ti minutter ved romtemperatur for å tillate koagulering av plasma.

Merk: Transfer to fps i tilfelle av fullstendig disseksjon og mer i tilfelle av delvis disseksjon. Bland sakte med en pipette tips og unngå kontakt med FP eksplantater.

Plasma blodpropp trekkes noen mikrometer som et tegn på koagulasjon. Denne koagulering må ikke bli stoppet for tidlig, for å unngå løsgjøring av plasmaklump.

3. Overfør hver dekkglass i en 24-brønns plate og tilsett 500 mL av Neurobasal + B27. Inkuber 48 timer ved 37 ° C.

DAG 3

Tre. FP Betinget Medium (FP ^cm) Høsting

Merk: Høsting bør utføres under sterile forhold i en vev kultur hette. Dersom supernatanten blir forurenset eller dersom gulvplatene er flytende (som betyr at de kan ha dødd i løpet av kultur period) så ikke høste FP ^cm fra denne brønnen.

3.1 FP ^cm høsting

1. Høste nøye mediet fra hver brønn.

Merk: Ikke pipette polymerisert plasma-trombin mix eller noen FP fragmenter.

2. Lagre 100 mL alikvoter ved -80 ° C.

DAG 4

4. Disseksjon av ryggmargs commissural nevroner fra E12.5 mus embryoer

Merk: Dette preparatet ikke trenger å bli utført under sterile betingelser. Følg prosedyren beskrevet ovenfor for å samle embryoene. Forbered kald PBS, kaldt HBSS-6,5% glukose og kaldt Neurobasal.

4.1 Ryggmargs disseksjon

1. Bruk pinsett, halshogge embryoet.

Merk: Klipp mellom underkjeven og hindbrain, er viktig for den bakre delen av hindbrainneste trinnene.

2. Plasser embryo ventral ansiktet ned i en fersk dråpe med den fremre delen som vender mot eksperimentator.
3. Klem huden av embryoet med en tang, og med den andre trekke bort huden.

Merk: Dette trinnet må gjentas inntil huden er helt fjernet fra den fremre delen av embryo.

4. Snu embryo fremre side til venstre. Med en tang "peke ut" fosteret i den fremre delen. Med de andre pinsett, ta tak i huden og dra mot rostral side av embryo, for å avsløre ryggmargen.
5. Bruk den ene siden av tang for å klippe hjernehinnene som fortsatt brytes ryggmargen. Ryggmargen er nå utsatt og åpen.
6. Plasser embryo fremre side til høyre.
7. Ta av vev fra ryggmargen med start fra den cervikale side av embryo. Skyv tang under ryggmargen (holde tang lukket). Forsteinsopp må synlig under ryggmargen. Små roterende bevegelser under ryggmargen er tilstrekkelig til å løsne tilstøtende vev og dorsal root ganglia (DRG).
8. Overfør isolert ryggmarg i en ny dråpe kald HBSS-6,5% glukose.
9. Plasser ryggmargen i en flat posisjon, hjernehinnene på toppen og fremre side bort fra eksperimentator.
10. "Pin ned" ryggmargen ved hjelp av den gjenværende hindbrain med en tang, med de andre tang hente hjernehinnene. Skrelle av hjernehinnene start fra rostral side av ryggmargen.

4,2 commissural Neuron disseksjon

1. Klem hindbrain med en tang.
2. De fugedannende nevroner befinner seg i den mest laterale delen av ryggmargen (dorsalsiden). Kutt ut denne laterale delen med en fin skalpell.

Merk: Den dorsale delen av ryggmargen kan skilles fra den ventrale del av forskjellen i celle density, den ventrale delen blir mer ugjennomsiktig.

Merk: For å kutte begge sider med samme kvalitet, start fra rostral side og vekselvis kutte en liten lengde på høyre side og på venstre side.

3. Bevare dissekert vev i Neurobasal medium på is for umiddelbar bruk.

5. Behandling av fugedannende Tissue med FP ^cm

Merk: Denne prosedyren krever ikke sterile forhold. Vevstoffet bør samles opp i individuelle 1,5 ml rør. Den frosne FP ^cm bør bare brukes én gang. Unngå flere gjenfrysing. Forbered varm FP ^cm (37 ° C).

5.1 Behandlinger av commissural nevroner

1. Dilacerate den commissural vev med liten saks.

Merk: Kutt vev så liten som mulig, for å potensere tilgjengeligheten av cellene.

2. Fordel ganske vevet mellom de ulike eksperimentelle forhold kontroll behandling og FP ^cm behandling.
3. Sentrifuger vev fragmenter ved 800 x g i 1 min ved 4 ° C.
4. Kontroller repartisjonere mellom rørene.

Merk: Hvis nødvendig omfordele og sentrifuger igjen før fragmenter er likt fordelt.

5. Fjern supernatanten.
6. Legg de varme FP ^cm og kontroll behandlinger til vev.

Merk: Volumet må tilpasses mengden av pelleten og bør være minst to ganger volumet av pelleten.

7. Inkuber ved 37 ° C i 30 min.

Merk: Rist hver 10-15 min

8. Sentrifuger ved 800 x g i 1 min, og fjerner behandlingen.
9. Legg lysis buffer

Merk: Volumet må justeres til etmontering av pelleten og bør være minst to ganger volumet av pelleten.

10. Pipetter opp og ned for å resuspendere pelleten.

Merk: En virvel kan også brukes.

11. Inkuber 15 min på is.
12. Sentrifuger ved 14000 x g i 15 min ved 4 ° C.
13. Hold supernatanten og måle mengden av protein med en Bradford assay ^9..
14. Legg 6x Laemmli Buffer.
15. Inkuber ved 95 ° C i 5 minutter for å denaturere proteininnholdet.

Merk: Prøver kan brukes umiddelbart eller lagres ved -80 ° C.

16. Vurdere virkningene av behandlingen ved Western blot ^10.

Merk: Minst 50 mikrogram total proteiner bør lastes for hvert kjørefelt.

Representative Results

Fugedannende vev ble behandlet ved FP ^cm, og prøvene ble bearbeidet for analyse av reseptor-nivåer i Western blot. Anvendelse av FP ^cm ble vist å øke nivåene av et veilednings reseptor, PlexinA1, som medierer følsomheten av fugedannende axoner til midtlinjen avstøtende Semaphorin3B etter å ha krysset (figur 2). Denne viste at signalene utgitt av FP regulere PlexinA1 nivåer ^4,6.

Figur 1. Ordninger av disseksjon prosedyre for å isolere gulvplate. Er de ulike trinnene i disseksjon og prosedyren kultur illustrert. 1) avskåret embryo hodet; 2-3) fjerne huden, 4) åpne hjernehinnene, 5-6) fjerner ryggmargen fra embryo, 7) fjerne menneneInges; 8-9) dissekere ut gulvet plate; 10) legge til trombin til FP-plasma mix og vente 10 til 15 minutter i romtemperatur før du legger kulturmediet. 11-12) dissekere ut dorsal nevroner, 13) dilacerate vevet. A: anterior pol av embryoet. P: bakre pol av embryoet. Pilene skildre retning av bevegelsen. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Representant resultat. A) Dorsal spinal vev ble samlet, dilacerated og stimulert med Gulvplate betinget medium og kontroll medium. Prøvene ble lysert og bearbeidet for Western blot. Proteiner ble analysert med antistoffer anti-PlexinA1, og β-aktin. Den poto illustrerer økningen av PlexinA1 nivåer i prøven stimulert med gulv-plate betinget medium. B) Den dot blot viser uttrykk for GDNF i FP ^cm i forhold til den kontroll medium.

Discussion

Produksjon av gulv-plate kondisjonerte medium gir en effektiv og enkel måte for å vurdere de biologiske egenskapene til gulvplate utgitt signaler.

Plasma-trombin matrise gir utmerket tilstand for vev overlevelse. Likevel kan dette beriket miljø være en begrensning for enkelte typer eksperimenter. Således kan bunnplaten vev også dyrkes i agarose matrise. Kvaliteten på gulvplaten kondisjonerte medium kan vurderes ved påvisning av kjente gulv-plate utgitt signaler, som GDNF (figur 2), Shh og Netrin ^11.. Deres tilstedeværelse i det kondisjonerte medium kan vurderes ved Western blot or dot blot.

I denne prosedyren celler er studert i sitt eget mikromiljøet. Dette hindrer ytterligere informasjon om den type av celler i vev som reagerer på behandlingen. Som gulvplaten er ikke en homogen struktur, konsentrasjonen av active komponenter som Wnts kan være forskjellig mellom kulturer avhengig av dissekert området langs rostro-caudal aksen.

Biokjemi på fersk dilacerated vev holder fordel å studere celler i sitt eget mikromiljøet. Dermed blir celle atferd undersøkt i forhold som rekapitulere så tett som mulig mors kontekst ^12. Den dorsale ryggmarg inneholder ikke bare commissural neuroner så effekten av FP ^cm kan også ses i dyrkede neuroner commissural.

Mediet kan anvendes på forskjellige typer av celler og vev-kulturer. Et stort spekter av parametre kan vurderes, fra celle identitet, celle overlevelse, celledød, og celledifferensiering. Prøver kan bli behandlet for proteomikk.

En viktig parameter for fremstillingen av den dilacerated friskt vev er partisjonere av vevet for kontrollen og eksperimentelle behandlinger. Det er importmaur å samle vev først i et enkelt rør og for å dilacerate vevet sammen før skille prøvene. Dette begrenser forskjellen i proteinkonsentrasjon detekteres etter lysis mellom prøvene.

Legg merke til at HBSS-glukose kan lagres ved 4 ° C i opp til en måned. Neurobasal kan også holdes i en måned ved 4 ° C. B27 alikvoter kan lagres ved -20 ° C for langvarig og ved 4 ° C i opp til en uke. Plasma alikvoter bør være butikken ved -20 ° C og kan fryses på nytt etter bruk. Trombin alikvoter kan også lagres ved -20 ° C og kan ikke fryses på nytt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents Required
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0.5 M, pH 8
MgCl2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
Distilled H2O
Table 1.Reagents required.
Tools and Materials
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
Microknives	Fine Science Tools	10136-14
Table 2. Tools and materials.
Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18 mm x 18 mm Bunsen gas burner 24-well plate tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge Recipes FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS-thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10 mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH 7,4 HEPES (260 g/mol) 25 mM EDTA (pH 8) 5 mM MgCl2 1 mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1x Sodium Orthovanadate 0.2 M H2O Laemmli Buffer Tris 0.5 M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0.6 M Bromophenol blue H2O