Kultur av isolerat Floor Plate Tissue och produktion av konditionerat medium för att bedöma funktionella egenskaper hos golvplatta utgivna Signaler

Summary

Golvplattan är en viktig struktur för utvecklings ryggmärgen, ger diffunderbara signaler till stamceller och differentierande neuroner. Vi beskriver en metod för att tillverka golvplatta medium, för att tillämpa den på färsk ryggmärgsvävnad, och att bedöma konsekvenserna på proteiner av intresse med biokemi.

Abstract

Under utveckling, progenitorceller och post-mitotiska neuroner emot signaler från angränsande områden som reglerar deras öde. Golvet-plattan är en grupp av gliaceller kantar ependymceller kanalen vid ventrala positionen. Golvet-plattan uttrycker nyckel morfogener bidrar till mönstring av cell linjer i ryggmärgen. Vid senare utvecklingsstadier, reglerar golvplattan navigering av axoner i ryggmärgen, som agerar som en barriär för att förhindra passage av ipsilaterala axoner och kontrollerande mittlinjen korsning av commissural axoner ^1. Dessa funktioner uppnås genom att utsöndringen av olika vägledning ledtrådar. Några av dessa signaler fungerar som tilldragande och avskräckningsmedel för de växande axoner medan andra reglerar väglednings receptorer och nedströms signalering att modulera känsligheten hos axoner till de lokala vägledning ledtrådar ^2,3. Här beskriver vi en metod som gör det möjligt att undersöka egenskaperna för golv-plattan härledda signaler i olika utvecklopmental sammanhang, baserat på produktionen av Golvplatta medium (FP ^{cm) 4-6.} Vi exemplifierar då användningen av denna FP ^cm i samband med axon vägledning. För det första är ryggmärg isolerad från musembryo vid E12.5 och eldstadsplanet dissekeras ut och odlas i ett plasma-trombmatrisen (figur 1). Andra två dagar senare, är commissural vävnad dissekeras ut från E12.5 embryon, finfördelas och exponeras för FP ^cm. För det tredje, är den vävnad bearbetas för Western blot-analys av commissural markörer.

Introduction

Golvet-plåt är ett välkänt mönstring centrum för utvecklings ryggmärgen, spelar nyckelroller i specifikationen av progenitorceller och postmitotiska cellhärstamningar och kontrollerande axonet navigering ^7,8. Den experimentella procedur som beskrivs här för att producera FP ^cm låter utredare för att bedöma de funktionella egenskaperna hos golvplatt-härledda signaler i en olika sammanhang av utvecklingsprocesser, från cell mönstring och överlevnad för cell-och Axon migration.

För att illustrera användningen av en sådan FP ^cm, dorsala ryggmärgen vävnader innehållande commissural neuroner dissekeras, dilacerated och stimulerades med FP ^cm. Vävnaderna kan sedan bearbetas för Western blot-analys. Detta gör det möjligt att undersöka föreskrifter axonet vägledning maskiner från golv-plattan släpptes signaler. Den metod för behandling av dilacerated färsk vävnad håller den stora fördelen av att bevara den mikromiljö av celler i: tee vävnad. Sålunda konsekvenserna av behandling av FP ^cm eller några typer av behandling utvärderas på ett mer fysiologiskt sätt än i cell-och vävnadsodlingsbetingelser.

Protocol

DAG 1

1. Dissektion av ryggmärgen golvplattan (FP) från E12.5 musembryon

Anmärkning: Hela förfarandet kräver användning av sterila betingelser. Det är att föredra att utföra dissektionen under ett dissektion huva för att undvika kontaminering. Bör rengöras Ytan av huven med etanol. Alla dissektionsinstrument måste steriliseras och förvaras i en steril petriskål. Vätskorna (medium dissektion medel) måste hållas stängda och sätta i ett isbad. Varje embryo bör tas på individuell frisk droppe. Detta är viktigt för vävnadsbevarande. Dissektionen utförs med Dumont # 5 pincett. För att överföra embryon mellan rätterna, grepp navelsträngen eller huvudet utan några skador på bakhjäman. Det är viktigt att inte skada ryggmärgen att framgångsrikt slutföra dissektion. Förbered kall fosfatbuffrad saltlösning (PBS), kall Hanks balanserade saltlösning (HBSS) -6,5% glukos och rumstemperatur Neurobasal medium.

1.1 Ryggmärgen dissektion

Djur behandlas enligt riktlinjerna för djurskötsel centrumets National de la Recherche Scientifique följande europeiska direktiv. Metoden för dödshjälp är halsdislokation, det består av ett tryck på nacken och stördes ryggraden från hjärnan. Detta förfarande rekommenderas för mus djurmodeller och kan utföras på ett snabbt och effektivt sätt.

1. Euthanize en gravid mus vid E12.5 av dräktigheten (E0.5 = första dagen efter mattor). Placera musen ventrala sida upp.
2. Blöt buken med 70% etanol. Nyp om huden i buken med Adson pincett och skär genom huden och de peritoneala skikten med kirurgisk sax. Gör ett snitt och använda den för att skära på båda sidan av musen för att exponera bukhålan.
3. En sträng av embryon är närvarande på vardera sidan av musen. Ta tag i ett horn av uterus i vävnaden mellan två embryon och dissekera ut från den yttre delen. Överför intakt livmoder till en 100 mm petriskål med kall PBS på is.
4. Utdrag embryon från extra-embryonala vävnader. Ta tag i moderkakan vävnad (i mörkrött) med två par pincett och dra försiktigt riva vävnaden och ta bort embryon från livmodersäcken.

Anm: För en bättre konservering, samla embryon från sin livmoder sac en efter en.

5. Nästa steg görs under kikare förstoringsglas och dissektion huva. Placera ett embryo i en droppe kall HBSS-6,5% glukos.
6. Använd pincett, halshugga embryot.

OBS: Skär mellan underkäken och bakhjäman, är viktigt för nästa steg den bakre delen av bakhjäman.

7. Placera embryot ventrala sidan nedåt med den främre delen mot försöksledaren.
8. Nyp hudenav embryot med en pincett och med det andra paret dra bort huden.

OBS: Detta steg måste upprepas tills huden är helt bort från den främre delen av embryot.

9. Vrid embryot främre sidan till vänster. Med en pincett "fingret" embryot i den främre delen. Med de andra tång griper huden och dra mot den rostrala sidan av embryot. Ryggmärgen är sedan tillgänglig.
10. Använd den ena sidan av pincett för att klippa hjärnhinnorna som fortfarande wrap ryggmärgen. Ryggmärgen är nu öppen.
11. Vrid embryot främre sidan till höger.
12. Drag av vävnaden från ryggmärgen med början från den cervikala sidan av embryot. Skjut pincetten i ryggmärgen (tången bör hållas stängda för att undvika ryggmärgsskada). Tången måste vara synligt under ryggmärgen. Små roterande rörelser inom ryggmärgen är tillräckliga för att ta lossomgivande vävnad och dorsala rotganglier (DRG).

OBS: Lämnar fäst omgivande vävnad tyngd till ryggmärgen, vilket ökar sannolikheten för att bryta det under nästa steg.

13. Placera den isolerade ryggmärgen i en färsk droppe kall HBSS-6,5% glukos.
14. Placera ryggmärgen i ett plant läge, hjärnhinnor på toppen och främre sidan bort från försöksledaren.
15. "Nåla ner" ryggmärgen med hjälp av återstående hindbrain med en pincett, och med den andra pincett tag hjärnhinnorna. Skala av hjärnhinnorna början från den rostrala sidan av ryggraden.

Anm: Rörelsen bör vara långsam och konstant för att undvika brott på ryggmärgen. Vibrerande rörelser kan underlätta avskiljandet av hjärnhinnorna.

1,2 FP dissektion

1. Nyp bakhjäman med en pincett.
2. Ramprogrammet är det centrala transparent del av vävnaden. Med hjälp av en skalpell skära ut golvplattan.

OBS: För att skära båda sidor med samma kvalitet, starta från den rostrala sidan och omväxlande skära till höger och vänster sida av golvplattan.

3. Bevara den dissekerade FP i Neurobasal medium vid rumstemperatur.

2. FP Kultur

OBS: Alla steg skall utföras under sterila förhållanden i en vävnadsodling huva. Använd färskt medium och nyligen tinade kosttillskott och reagenser. Förbered sterila glas täckglas, varm Neurobasal + B27, plasma och HBSS-trombin.

2,1 FP kultur

1. Placera flera sterila täckglas i en 100 mm petriskål och pipett 20 ul plasma i mitten av varje täckglas.
2. Överför 03:58 FP i varje plasma droppe och tillsätt 20 l HBSS-trombin bredvid plasma droppe och försiktigt blanda. Håll täckunder minst tio minuter vid rumstemperatur för att tillåta koagulering av plasman.

OBS: Överför två ramprogrammen i händelse av fullständig dissekering och mer vid delvis dissekering. Blanda långsamt med en pipett och undvika kontakt med FP explants.

Den plasmakoagel drar några um som ett tecken på koagulationen. Den koagulering får inte stoppas i förtid, för att undvika avlossning av plasmakoagel.

3. Överför varje täckglas i en 24-brunnsplatta och tillsätt 500 pl av Neurobasal + B27. Inkubera 48 timmar vid 37 ° C.

DAG 3

3. FP-konditionerat medium (FP ^cm) Skörd

OBS: Skörde bör utföras under sterila förhållanden i en vävnadsodling huva. Om vätskan är förorenad eller om golvplattor är flytande (vilket innebär att de kan ha dött under kultur period) då inte skörda FP ^cm från denna brunn.

3,1 FP ^cm skörd

1. Skörda försiktigt mediet från varje brunn.

Obs: Inte pipett polymeriserade plasma-trombin mix eller någon FP fragment.

2. Förvara 100 | il alikvoter vid -80 ° C.

DAG 4

4. Dissektion av ryggmärgs commissural nervceller från E12.5 musembryon

Anmärkning: Denna beredning behöver inte utföras under sterila betingelser. Följ förfarandet som beskrivs ovan för att samla in embryon. Förbered kall PBS, kall HBSS-6,5% glukos och kallt Neurobasal.

4.1 Ryggmärgen dissektion

1. Använd pincett, halshugga embryot.

Anm: Skär mellan underkäken och bakhjäman, är viktigt för den bakre delen av hindbrainnästa steg.

2. Placera embryot ventrala nedåt i en ny nedgång med den främre delen mot försöksledaren.
3. Nyp huden av embryot med en pincett och med den andra en dra bort huden.

OBS: Detta steg måste upprepas tills huden är helt bort från den främre delen av embryot.

4. Vrid embryot främre sidan till vänster. Med en pincett "fingret" embryot i den främre delen. Med de andra pincett, ta tag i huden och dra mot den rostrala sidan av embryot, för att exponera ryggmärgen.
5. Använd den ena sidan av pincett för att klippa hjärnhinnorna som fortfarande wrap ryggmärgen. Ryggmärgen är nu exponerad och öppen.
6. Placera embryot främre sidan till höger.
7. Drag av vävnaden från ryggmärgen med början från den cervikala sidan av embryot. Skjut pincetten i ryggmärgen (hålla pincetten stängda). Förceps must synlig under ryggmärgen. Små roterande rörelser inom ryggmärgen är tillräckliga för att lösgöra den intilliggande vävnad och dorsalrotsganglier (DRG).
8. Överför isolerade ryggmärgen i en ny droppe kall HBSS-6,5% glukos.
9. Placera ryggmärgen i ett plant läge, hjärnhinnor på toppen och främre sidan bort från försöksledaren.
10. "Nåla ner" ryggmärgen med hjälp av återstående hindbrain med en pincett, med den andra pincett tag hjärnhinnorna. Skala av hjärnhinnorna början från den rostrala sidan av ryggraden.

4,2 commissural Neuron dissektion

1. Nyp bakhjäman med en pincett.
2. Commissural neuroner är belägna i den mest laterala delen av ryggmärgen (ryggsidan). Skär ut denna laterala delen med en fin skalpell.

Obs: ryggdelen av ryggmärgen kan skiljas från den ventrala delen av skillnaden i cell density, den ventrala delen är mer opak.

OBS: För att skära båda sidor med samma kvalitet, starta från den rostrala sidan och omväxlande skära en liten längd på höger sida och på vänster sida.

3. Bevara den dissekerade vävnaden i Neurobasal medium på is för omedelbar användning.

5. Behandling av commissural Tissue med FP ^cm

OBS: Denna procedur kräver inte sterila förhållanden. Vävnaden bör tas på individuella 1,5 ml rör. Den frusna FP ^cm bör användas endast en gång. Undvik flera omfrysning. Förbered varm FP ^cm (37 ° C).

5.1 Behandlingar av commissural nervceller

1. Dilacerate commissural vävnad med en liten sax.

Anm: Skär vävnaden så liten som möjligt, för att potentiera tillgängligheten av cellerna.

2. Fördela rättvist vävnaden mellan de olika experimentella förhållanden kontrollbehandling och FP ^cm behandling.
3. Centrifugera vävnadsfragment vid 800 x g under 1 min vid 4 ° C.
4. Kontrollera fördelningen mellan rören.

Anm: Vid behov omfördela och centrifugera igen tills fragment jämnt fördelade.

5. Avlägsna supernatanten.
6. Lägg de varma FP ^cm och kontrollbehandlingar till vävnaderna.

Obs! Volymen skall justeras till mängden av pelleten och bör vara åtminstone två gånger volymen av pelleten.

7. Inkubera vid 37 ° C under 30 min.

OBS: Skaka försiktigt varje 10-15 min

8. Centrifugera vid 800 x g under 1 min och avlägsnande av behandling.
9. Till lysbuffert

Obs: Volymen skall anpassas till enmount av pelleten och bör vara åtminstone två gånger volymen av pelleten.

10. Pipettera upp och ner för att resuspendera pelleten.

Anmärkning: En virvel kan även användas.

11. Inkubera 15 minuter på is.
12. Centrifugera vid 14.000 xg under 15 minuter vid 4 ° C.
13. Håll supematanten och mäta mängden av protein med en Bradford-analys ^9.
14. Lägg 6x Laemmli-buffert.
15. Inkubera vid 95 ° C under 5 min för att denaturera proteininnehållet.

Notera: Prov kan användas omedelbart eller kan lagras vid -80 ° C.

16. Bedöma effekterna av behandling med Western blöt ^10.

OBS: Minst 50 mikrogram av totala proteiner ska laddas för varje bana.

Representative Results

Commissural vävnader behandlades med hjälp av FP ^cm och proven bearbetades för analys av receptornivåer i Western blöt. Tillämpning av FP ^cm visade sig öka nivåerna av en vägledning receptor, PlexinA1, som förmedlar känslighet commissural axoner med mittlinjen avvisande Semaphorin3B efter att ha korsat (Figur 2). Detta visade att signaler släpptes av FP reglerar PlexinA1 nivå ^4,6.

Figur 1. System av dissekering förfarandet att isolera bottenplanet. De olika stegen i dissektion och kulturen förfarandet illustreras. 1) avskurna embryo huvudet, 2-3) ta bort huden, 4) öppnar hjärnhinnorna, 5-6) avlägsna ryggmärgen från embryot, 7) avlägsna mänInges, 8-9) dissekera ut golvplattan, 10) lägga till trombin till FP-plasma-mix och vänta 10 till 15 minuter i rumstemperatur innan du lägger till odlingsmediet. 11-12) dissekera ut rygg nervceller, 13) dilacerate vävnaden. A: främre stolpe av embryot. P: bakre polen av embryot. Pilarna visar riktningen på rörelsen. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Representativa resultat. A) Dorsal spinal vävnad uppsamlades, dilacerated och stimulerades med golvplattan konditionerat medium och kontrollmedium. Proverna lyserades och bearbetades för Western blöt. Proteiner sonderades med antikroppar anti-PlexinA1 och β-aktin. The poto illustrerar ökningen av PlexinA1 nivåerna i provet stimulerades med golv-plattan medium. B) I dot blot visar uttrycket av GDNF i FP ^cm jämfört med det kontrollmedium.

Discussion

Produktionen av golvplatta medium ger ett effektivt och enkelt sätt för att utvärdera de biologiska egenskaperna hos golvplatta släpptes signaler.

Den plasma-trombin matris ger utmärkt skick för vävnadsöverlevnad. Ändå kan detta berikad miljö vara en begränsning för vissa typer av experiment. Således kan golvplattan vävnad också odlas i agaros-matris. Kvaliteten på golvplattan medium kan bedömas genom detektering av kända golv-plattan släpptes signaler, såsom GDNF (figur 2), Shh och Netrin ^11. Deras närvaro i det konditionerade mediet kan bestämmas genom Western blot-eller dot-blot.

I denna procedur celler studeras i deras nativa mikromiljö. Detta förhindrar ytterligare information om den typ av celler i vävnaden som reagerar på behandlingen. Som golvplattan är inte en homogen struktur, koncentrationen av lagenive komponenter såsom Wnts kan skilja sig mellan kulturer beroende på dissekerade området längs rostro-caudal axeln.

Biokemi på färsk dilacerated vävnad håller fördelen att studera celler i sitt eget mikromiljö. Således är cell beteenden undersöks i förhållanden som rekapitulera så nära som möjligt deras infödda sammanhang ^12. Den dorsala ryggmärgen innehåller inte bara commissural nervceller så effekterna av FP ^cm kan också bedömas i odlade commissural nervceller.

Mediet kan tillämpas på olika typer av cell-och vävnadskulturer. Ett stort antal parametrar kan bedömas, från cellidentitet, cellöverlevnad, celldöd och celldifferentiering. Prover kan behandlas för proteomik.

En viktig parameter för framställningen av den dilacerated färsk vävnad är fördelningen av vävnad för kontroll-och experimentbehandlingar. Det är important att samla vävnaderna först i ett enda rör och dilacerate vävnaden kollektivt innan separera proverna. Detta begränsar skillnaden i proteinkoncentrationen detekteras efter lys mellan proverna.

Observera att HBSS-glukos kan lagras vid 4 ° C i upp till en månad. Neurobasal kan också hållas i en månad vid 4 ° C. B27 alikvoter kan lagras vid -20 ° C under lång sikt och vid 4 ° C i upp till en vecka. Plasma portioner bör förvara vid -20 ° C och kan frysas om efter användning. Trombin alikvoter kan också förvaras vid -20 ° C och kan inte frysas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents Required
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0.5 M, pH 8
MgCl2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
Distilled H2O
Table 1.Reagents required.
Tools and Materials
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
Microknives	Fine Science Tools	10136-14
Table 2. Tools and materials.
Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18 mm x 18 mm Bunsen gas burner 24-well plate tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge Recipes FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS-thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10 mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH 7,4 HEPES (260 g/mol) 25 mM EDTA (pH 8) 5 mM MgCl2 1 mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1x Sodium Orthovanadate 0.2 M H2O Laemmli Buffer Tris 0.5 M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0.6 M Bromophenol blue H2O