ثقافة معزولة الأنسجة الطابق بلور وإنتاج مشروطة متوسطة لتقييم خصائص وظيفية من الطابق إشارات اطلاق سراحهم لوحة

Summary

لوحة الكلمة هو بنية حاسمة من وضع الحبل الشوكي، وتوفير إشارات إنتشاري إلى الأسلاف والتفريق الخلايا العصبية. نحن تصف طريقة لإنتاج لوحة الطابق مكيفة المتوسطة، لتطبيقه على أنسجة الحبل الشوكي الطازجة، وتقييم العواقب على البروتينات من الاهتمام من خلال الكيمياء الحيوية.

Abstract

خلال التنمية، والأسلاف والخلايا العصبية بعد الإنقسامية تلقي إشارات من الأراضي المجاورة التي تنظم مصيرهم. في لوحة الكلمة هو مجموعة من الخلايا الدبقية بطانة القناة البطانة العصبية في موقف بطني. في لوحة تعبر عن الكلمة morphogens الرئيسية المساهمة في الزخرفة الأنساب الخلايا في الحبل الشوكي. في مراحل النمو في وقت لاحق، والكلمة لوحة ينظم الملاحة من محاور عصبية في الحبل الشوكي، التي تعمل كحاجز لمنع عبور المحاور المماثل وعبور خط الوسط السيطرة من قبل المحاور صواري ^1. يتم تحقيق هذه المهام من خلال إفراز العظة التوجيه المختلفة. بعض هذه الإشارات بمثابة جاذبة وطارد للمحاور المتزايد في حين أن آخرين تنظيم مستقبلات التوجيه وإشارات المصب لتعديل حساسية المحاور إلى العظة التوجيه المحلي ^2،3. نحن هنا وصف الأسلوب الذي يسمح بالتحقيق في خصائص الكلمة لوحة إشارات المشتقة في مجموعة متنوعة من ديفيسياقات lopmental، استنادا إلى إنتاج المتوسطة الطابق بلايت مكيفة (FP ^{سم) و 4-6.} نحن بعد ذلك مثالا على استخدام هذا FP ^سم في سياق توجيهات محوار. أولا، يتم عزل الحبل الشوكي من جنين فأر في E12.5 ويتم تشريح لوحة الكلمة من وزراعتها في مصفوفة البلازما الثرومبين (الشكل 1). في وقت لاحق الثانية يومين، يتم تشريح الأنسجة صواري خروج من أجنة E12.5، المسحوقة وتتعرض لFP ^سم. الثالثة، تتم معالجة الأنسجة لتحليل لطخة غربية من علامات صواري.

Introduction

في لوحة الأرض هي مركز الزخرفة المعروفة من الحبل الشوكي النامي، ولعب دورا رئيسيا في تحديد الأسلاف والأنساب خلية تالية للتفتل والسيطرة على محور عصبي الملاحة ^7،8. إجراء التجارب وصفها هنا لإنتاج FP ^سم يسمح للمحققين لتقييم الخصائص الفنية للإشارات المشتقة من الكلمة لوحة في سياقات مختلفة من العمليات التنموية، من الزخرفة الخلية والبقاء على قيد الحياة إلى الخلية والهجرة محور عصبي.

لتوضيح استخدام هذه FP ^سم، يتم تشريح الأنسجة الحبل الشوكي الظهري تحتوي على الخلايا العصبية صواري، dilacerated وحفز مع FP ^سم. ويمكن بعد ذلك معالجة الأنسجة لتحليل لطخة غربية. وهذا يسمح التحقيق أنظمة آلية التوجيه محوار بواسطة الكلمة لوحة إشارات الافراج عنهم. طريقة العلاج من الأنسجة الطازجة dilacerated يحمل ميزة كبيرة للحفاظ على المكروية من الخلايا داخل اله الأنسجة. وبالتالي يتم تقييم الآثار المترتبة على العلاج FP ^سم أو أي نوع من أنواع العلاج بطريقة أكثر من الفسيولوجية في الخلايا وظروف زراعة الأنسجة.

Protocol

DAY 1

1. تشريح الحبل الشوكي الدور لوحة (FP) من E12.5 أجنة الفئران

ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء بأكمله استخدام ظروف معقمة. فمن الأفضل لإجراء تشريح تحت غطاء تشريح لتجنب التلوث. يجب تنظيف السطح من هود مع الايثانول. يجب تعقيم جميع الأدوات تشريح ويوضع في طبق بتري معقمة. السوائل (المتوسطة، تشريح المتوسطة) يجب أن تبقى مغلقة ووضعها في حمام جليدي. وينبغي جمع كل جنين في انخفاض الطازجة الفردية. هذا مهم للحفاظ على الأنسجة. يتم إجراء تشريح مع دومون # 5 ملقط. لنقل الأجنة بين الأطباق، وقبضة الحبل السري أو رئيس دون أي ضرر على الدماغ المؤخر. فمن الأهمية بمكان عدم تلف الحبل الشوكي لاستكمال تشريح بنجاح. إعداد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، محلول الملح الباردة هانك المتوازن (HBSS) -6.5٪ الجلوكوز ودرجة حرارة الغرفة المتوسطة Neurobasal.

1.1 تشريح الحبل الشوكي

يتم التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من المركز الوطني للبحوث العلميه التالية التوجيهات الأوروبية. طريقة القتل الرحيم هو خلع عنق الرحم، وتتكون من الضغط على رقبته وخلع العمود الفقري من الدماغ. ينصح بهذا الأسلوب لنماذج حيوانية الماوس، ويمكن أن يؤديها في وسيلة سريعة وفعالة.

1. الموت ببطء ماوس حاملا في E12.5 من الحمل (E0.5 = حصيرة اليوم الأول التالي). ضع الماوس الجانب بطني حتى.
2. نقع البطن مع الايثانول 70٪. قرصة جلد البطن مع ملقط أدسون وقطع طريق الجلد وطبقات البريتوني مع مقص جراحي. إجراء شق واستخدامها لقطع على جانبي الماوس لفضح تجويف البطن.
3. سلسلة من الأجنة موجود على كل جانب من الفأرة. فهم قرن واحد من يوتRUS في الأنسجة بين اثنين من الأجنة وتشريح بها بدءا من الجزء الخارجي. نقل الرحم سليمة إلى 100 ملم طبق بتري مع برنامج تلفزيوني الباردة على الجليد.
4. استخراج الأجنة من أنسجة خارج الجنينية. فهم نسيج المشيمة (باللون الأحمر الداكن) مع اثنين من أزواج من ملقط وسحب بهدوء لتمزيق الأنسجة وإزالة الأجنة من الكيس الرحم.

ملاحظة: للحصول على أفضل الحفظ، وجمع الأجنة من الرحم الكيس بهم واحدا تلو الآخر.

5. تتم الخطوات التالية تحت العدسة المكبرة مجهر التشريح وغطاء محرك السيارة. وضع الجنين واحد في قطرة من البرد الجلوكوز HBSS 6.5٪.
6. باستخدام ملقط، قطع رأس الجنين.

ملاحظة: قص بين الفك السفلي والدماغ المؤخر، والجزء الخلفي من الدماغ المؤخر المهم للخطوات المقبلة.

7. وضع وجهه بطني الجنين إلى أسفل مع الجزء الأمامي تواجه المجرب.
8. قرصة الجلدالجنين مع زوج واحد من ملقط ومع الزوج الآخر سحب بعيدا الجلد.

ملاحظة: هذه الخطوة لابد من تكرار حتى تتم إزالة الجلد تماما من الجزء الأمامي من الجنين.

9. بدوره الجانب الجنين الأمامي إلى اليسار. مع واحد ملقط "ماهيتها" الجنين في الجزء الأمامي. مع ملقط الأخرى انتزاع الجلد وسحب نحو الجانب منقاري من الجنين. الحبل الشوكي يمكن الوصول إليه ذلك الحين.
10. استخدام جانب واحد من ملقط لقطع السحايا التي لا تزال التفاف الحبل الشوكي. الحبل الشوكي مفتوح الآن.
11. بدوره الجانب الجنين الأمامي إلى اليمين.
12. فصل الأنسجة من الحبل الشوكي بدءا من الجانب عنق الرحم للجنين. حرك ملقط تحت الحبل الشوكي (ينبغي أن تعقد ملقط مغلقة لتجنب الضرر الحبل الشوكي). ملقط يجب أن تكون مرئية تحت الحبل الشوكي. الحركات تدويرية صغيرة تحت الحبل الشوكي هي كافية لفصلالأنسجة المحيطة والعقد الجذرية الظهرية (DRG).

ملاحظة: ترك الأنسجة المحيطة المرفقة تضيف وزنا إلى الحبل الشوكي، وبالتالي زيادة احتمال كسرها خلال الخطوة التالية.

13. وضع الحبل الشوكي معزولة في قطرة جديدة من البرد الجلوكوز HBSS 6.5٪.
14. وضع الحبل الشوكي في وضع مسطح، والسحايا على الجانب العلوي والأمامي بعيدا عن المجرب.
15. "دبوس أسفل" النخاع الشوكي باستخدام الدماغ المؤخر المتبقية مع ملقط واحد، والثانية مع ملقط انتزاع السحايا. تقشر السحايا بدءا من الجانب منقاري من الحبل الشوكي.

ملاحظة: يجب أن تكون الحركة بطيئة وثابتة لتجنب أي كسر من الحبل الشوكي. يمكن الحركات الاهتزازية تسهيل مفرزة من السحايا.

1.2 FP تشريح

1. قرصة الدماغ المؤخر مع ملقط واحد.
2. وFP هو الهيئة المركزيةجزء nsparent من الأنسجة. باستخدام مشرط قطع لوحة الكلمة.

ملاحظة: لخفض كلا الجانبين بنفس الجودة، بدء من الجانب منقاري وبالتناوب قطع الجانب الأيمن والجانب الأيسر من لوحة الكلمة.

3. الحفاظ على FP تشريح في المتوسطة Neurobasal في درجة حرارة الغرفة.

2. FP الثقافة

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود. استخدام متوسطة جديدة وملاحق إذابة طازجة والكواشف. إعداد coverslips معقمة الزجاج، neurobasal دافئ + B27، والبلازما، وHBSS-الثرومبين.

2.1 الثقافة FP

1. وضع عدة coverslips العقيمة في طبق بتري 100 ملم وماصة 20 ميكرولتر البلازما في وسط كل ساترة.
2. نقل 2-4 FP في كل قطرة البلازما وإضافة 20 ميكرولتر HBSS-الثرومبين بجانب انخفاض البلازما وتخلط بعناية. إبقاء لل coverslipsمدة لا تقل عن عشر دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح التخثر للبلازما.

ملاحظة: نقل اثنين من ضباط في حالة تشريح كاملة وأكثر من ذلك في حالة تشريح جزئية. مزيج ببطء مع طرف ماصة وتجنب الاتصال مع إإكسبلنتس FP.

الجلطة البلازما تتراجع بضعة ميكرومتر كعلامة من التخثر. يجب ألا توقف تخثر قبل الأوان، لتجنب مفرزة من تجلط البلازما.

3. نقل كل ساترة في 24 لوحة جيدا وإضافة 500 ميكرولتر من Neurobasal + B27. احتضان 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.

DAY 3

3. FP مكيفة متوسطة (FP ^سم) حصاد

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ حصاد تحت ظروف معقمة في نسيج الثقافة هود. إذا طاف الملوثة أو إذا وحات الطابق تطفو (بمعنى أنها قد لقوا حتفهم خلال شبه الثقافةالتطوير التنظيمي) ثم لا حصاد FP ^{سم من} هذه البئر.

3.1 ^سم FP الحصاد

1. حصاد بعناية متوسطة من كل بئر.

ملاحظة: لا ماصة للبلمرة مزيج البلازما الثرومبين أو أي شظايا FP.

2. تخزين 100 ميكرولتر مأخوذة في -80 درجة مئوية.

DAY 4

4. تشريح الحبل الشوكي الخلايا العصبية صواري من E12.5 أجنة الفئران

ملاحظة: لا يحتاج هذا المستحضر الذي سيتم تنفيذه تحت ظروف معقمة. اتبع الإجراء الموضح أعلاه لجمع الأجنة. إعداد برنامج تلفزيوني الباردة، الباردة HBSS 6.5٪ الجلوكوز وneurobasal الباردة.

4.1 تشريح الحبل الشوكي

1. باستخدام ملقط، قطع رأس الجنين.

ملاحظة: قص بين الفك السفلي والدماغ المؤخر، والجزء الخلفي من الدماغ المؤخر المهم للالخطوات المقبلة.

2. وضع الوجه لأسفل بطني الجنين في قطرة جديدة مع الجزء الأمامي تواجه المجرب.
3. قرصة جلد الجنين مع واحد ملقط ومع الآخر سحب بعيدا الجلد.

ملاحظة: هذه الخطوة لابد من تكرار حتى تتم إزالة الجلد تماما من الجزء الأمامي من الجنين.

4. بدوره الجانب الجنين الأمامي إلى اليسار. مع واحد ملقط "ماهيتها" الجنين في الجزء الأمامي. مع ملقط الأخرى، فهم الجلد وسحب نحو الجانب منقاري من الجنين، لفضح الحبل الشوكي.
5. استخدام جانب واحد من ملقط لقطع السحايا التي لا تزال التفاف الحبل الشوكي. يتعرض الحبل الشوكي الآن ومفتوحة.
6. وضع الجانب الأمامي الجنين إلى اليمين.
7. فصل الأنسجة من الحبل الشوكي بدءا من الجانب عنق الرحم للجنين. حرك ملقط تحت الحبل الشوكي (الحفاظ على ملقط مغلقة). إلىيجب الفطر الابيض مرئية تحت الحبل الشوكي. الحركات تدويرية صغيرة تحت الحبل الشوكي تكفي لفصل الأنسجة المجاورة والعقد الجذرية الظهرية (DRG).
8. نقل النخاع الشوكي معزولة في قطرة جديدة من البرد الجلوكوز HBSS 6.5٪.
9. وضع الحبل الشوكي في وضع مسطح، والسحايا على الجانب العلوي والأمامي بعيدا عن المجرب.
10. "دبوس أسفل" النخاع الشوكي باستخدام الدماغ المؤخر المتبقية مع ملقط واحد، مع ملقط الثاني انتزاع السحايا. تقشر السحايا بدءا من الجانب منقاري من الحبل الشوكي.

4.2 صواري عصبون تشريح

1. قرصة الدماغ المؤخر مع ملقط واحد.
2. توجد الخلايا العصبية صواري في الجزء الأكثر الجانبي للحبل الشوكي (الجانب الظهري). قطع هذا الجزء الجانبي مع مشرط الغرامة.

ملاحظة: الجزء الظهري في النخاع الشوكي يمكن تمييزها عن الجزء البطني من قبل الفرق من الخلايا دensity، والجزء البطني كونها أكثر غموضا.

ملاحظة: لخفض كلا الجانبين بنفس الجودة، بدء من الجانب منقاري وبالتناوب قطع صغيرة من طول الجانب الأيمن والجانب الأيسر.

3. الحفاظ على الأنسجة تشريح في المتوسطة Neurobasal على الجليد للاستخدام الفوري.

5. علاج الأنسجة صواري مع FP ^سم

ملاحظة: لا يتطلب هذا الإجراء ظروف معقمة. وينبغي جمع الأنسجة في الفرد 1.5 مل أنابيب. يجب استخدام المجمدة FP ^سم مرة واحدة فقط. تجنب عن تجميد متعددة. إعداد الحارة FP ^سم (37 درجة مئوية).

5.1 العلاج من الخلايا العصبية صواري

1. Dilacerate الأنسجة صواري مع مقص صغير.

ملاحظة: قص الأنسجة صغيرة قدر الإمكان، إلى تحفيز إمكانية الوصول إلى الخلايا.

2. التوزيع العادل الأنسجة بين التجريبية المختلفة العلاج الظروف تحكم وFP ^سم العلاج.
3. أجهزة الطرد المركزي شظايا الأنسجة في 800 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
4. التحقق من إعادة تقسيم بين الأنابيب.

ملاحظة: إذا كان لإعادة توزيع اللازمة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى حتى شظايا موزعة بالتساوي.

5. إزالة طاف.
6. إضافة ^سم والسيطرة العلاجات FP الحارة إلى الأنسجة.

ملاحظة: يجب أن يتم تعديل حجم لكمية من بيليه وينبغي أن يكون على الأقل ضعف حجم بيليه.

7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ملاحظة: بلطف يهز كل 10-15 دقيقة

8. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 1 دقيقة، وإزالة العلاج.
9. إضافة العازلة تحلل

ملاحظة: يجب أن يتم تعديل مستوى الصوت إلى لجبل بيليه وينبغي أن يكون على الأقل ضعف حجم بيليه.

10. ماصة صعودا وهبوطا ل resuspend بيليه.

ملاحظة: يمكن أن تستخدم أيضا لدوامة.

11. احتضان 15 دقيقة على الجليد.
12. أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
13. إبقاء طاف وقياس كمية البروتين مع مقايسة برادفورد ^9.
14. إضافة 6X Laemmli العازلة.
15. احتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد محتوى البروتين.

ملاحظة: عينات يمكن استخدامها على الفور أو يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية.

16. تقييم آثار العلاج بواسطة لطخة غربية ^10.

ملاحظة: 50 ميكروغرام من مجموع البروتينات على الأقل يجب أن يتم تحميل لكل حارة.

Representative Results

تم علاج الأنسجة صواري من قبل FP ^سم وتمت معالجة العينات لتحليل مستويات مستقبلات في لطخة غربية. وقد تبين تطبيق FP ^سم إلى زيادة مستويات مستقبلات التوجيه، PlexinA1، التي تتوسط حساسية المحاور صواري لخط الوسط طارد Semaphorin3B بعد عبور (الشكل 2). وكشف هذا أن الإشارات الصادرة عن FP تنظيم مستويات PlexinA1 ^4،6.

الشكل 1. خطط لإجراء تشريح لعزل الطابق بليت. ويوضح الخطوات المختلفة للتشريح والإجراء الثقافة. 1) بقطع رأس الجنين؛ 2-3) إزالة الجلد؛ 4) فتح السحايا؛ 5-6) إزالة الحبل الشوكي من جنين؛ 7) إزالة الرجالINGES؛ 8-9) تشريح خارج الكلمة لوحة و 10) إضافة الثرومبين إلى المزيج FP-البلازما والانتظار 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل إضافة مستنبت. 11-12) تشريح خارج الخلايا العصبية الظهرية؛ 13) dilacerate الأنسجة. ج: القطب الأمامي من الجنين. P: القطب الخلفي للجنين. الأسهم تصور اتجاه الحركة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2. نتيجة ممثل. أ) تم جمع الأنسجة الشوكي الظهرية، dilacerated وحفز مع لوحة الطابق مكيفة المتوسطة والسيطرة المتوسطة. و lysed العينات ومعالجتها لطخة غربية. كما تم بحث البروتينات مع الأجسام المضادة للPlexinA1، وβ-الأكتين. عيوضح النموذجية المتعلقة بصحة زيادة مستويات PlexinA1 في العينة حفز مع الكلمة لوحة مكيفة المتوسط. ب) يبين طخة نقطة التعبير عن GDNF في FP ^سم بالمقارنة مع انها متوسطة السيطرة.

Discussion

إنتاج الأرض وحة مكيفة المتوسطة يوفر وسيلة فعالة وسهلة لتقييم الخصائص البيولوجية لوحة الطابق إشارات الافراج عنهم.

مصفوفة البلازما الثرومبين يوفر حالة ممتازة للبقاء الأنسجة. ومع ذلك، هذه البيئة المخصب قد يكون وجود قيود لبعض أنواع التجارب. وبالتالي، يمكن أيضا الأنسجة الكلمة لوحة زراعتها في مصفوفة الاغاروز. ويمكن تقييم نوعية الكلمة لوحة مكيفة المتوسط ​​عن طريق الكشف عن أرضية لوحة الإشارات المعروفة المفرج عنهم، مثل GDNF (الشكل 2)، وشش Netrin ^11. وجودهم في المتوسط ​​مكيفة يمكن تقييمها من قبل لطخة غربية أو وصمة عار نقطة.

في هذا الإجراء يتم دراسة الخلايا في المكروية وطنهم. هذا يمنع مزيد من المعلومات على نوع من الخلايا في الأنسجة التي تتفاعل مع العلاج. كما لوحة الكلمة ليس بنية متجانسة، وتركيز الفعلمكونات إيف مثل WNTS قد تكون مختلفة بين الثقافات اعتمادا على المنطقة تشريح على طول محور rostro-الذيلية.

الكيمياء الحيوية في الأنسجة dilacerated الطازجة يحمل ميزة لدراسة الخلايا في المكروية وطنهم. وبالتالي، يتم التحقيق السلوكيات خلية في الظروف التي ألخص قدر الإمكان السياق الأصلية الخاصة بهم ^12. لا يحتوي على الخلايا العصبية في النخاع الشوكي الظهري صواري ذلك إلا آثار FP ^سم ويمكن أيضا أن تقيم في الخلايا العصبية صواري مثقف.

يمكن تطبيقها على المديين المتوسط ​​وأنواع مختلفة من الخلايا والأنسجة الثقافات. وهناك مجموعة كبيرة من المعلمات يمكن تقييمها من هوية الخلية، وبقاء الخلية، موت الخلايا، وتمايز الخلايا. يمكن معالجة عينات للتحليل البروتينات.

معلمة مهمة إعداد الأنسجة الطازجة dilacerated هو إعادة تقسيم الأنسجة لمراقبة وعلاجات تجريبية. فمن الاستيرادالنمل لجمع الأنسجة الأولى في أنبوب واحد وdilacerate الأنسجة قبل جماعي لفصل العينات. وهذا يحد من الاختلاف في تركيز البروتين بعد الكشف عن تحلل بين العينات.

نلاحظ أن HBSS الغلوكوز يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. Neurobasal كما يمكن الاحتفاظ بها لمدة شهر واحد على 4 درجات مئوية. ويمكن تخزين مأخوذة B27 في -20 درجة مئوية لفترة طويلة وعند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد. وينبغي أن تكون مأخوذة البلازما تخزينها في -20 درجة مئوية، ويمكن أعيد تجميدها مرة أخرى بعد الاستخدام. ويمكن أيضا أن يتم تخزين مأخوذة الثرومبين في -20 درجة مئوية و لا يمكن أن أعيد تجميدها مرة أخرى.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents Required
PBS	Invitrogen	14190-094
HBSS, Ca2+/Mg2+- free	Invitrogen	14170-088
Glucose	Sigma	G-7021
Neurobasal	Invitrogen	21103-049
Plasma	Sigma	P-3266	1 mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate)
Thrombin	Sigma	T-4648	10 mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate)
B27	Invitrogen	17504-044	50x
HEPES (260 g/mol)	Sigma	H-7006
EDTA	Sigma	E-5513	0.5 M, pH 8
MgCl2	Euromedex	2189	1M
Glycerol	VWR	24388.295
IGEPAL	Sigma	I-3021
Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche	04 693 116 001
Sodium Orthovanadate (Na3VO4)	Sigma	S-6508
Distilled H2O
Table 1.Reagents required.
Tools and Materials
Surgical scissors	Fine Science Tools	14002-12
Adson forceps	Fine Science Tools	11027-12
Dumont #5 Fine Tips forceps	Fine Science Tools	11254-20
Microknives	Fine Science Tools	10136-14
Table 2. Tools and materials.
Dissection and FP culture Ethanol 70% dissection hood dissection microscope Petri dishes glass coverslips 18 mm x 18 mm Bunsen gas burner 24-well plate tissue culture incubator (37 °C, 5% CO2, humidity controlled) Centrifuge Recipes FP culture media Neurobasal B27 1/50e dilution from stock HBSS-thrombin HBSS 1 ml Thrombin 10 mg/ml 30 μl Lysis Buffer pH 7,4 HEPES (260 g/mol) 25 mM EDTA (pH 8) 5 mM MgCl2 1 mM Glycerol 10% IGEPAL (NP40) 0.10% Protease Inhibitor Cocktail 1x Sodium Orthovanadate 0.2 M H2O Laemmli Buffer Tris 0.5 M, pH 6,8 375 mM SDS 6% Glycerol 60% DTT 0.6 M Bromophenol blue H2O