Summary
여기에서 우리는 가상 현실 환경에서 동작하는 동안 마우스 피질의 두 광자 영상에 포함 된 실험 절차에 대해 설명합니다.
Abstract
이 동작을 1-6 동안 유전자 식별 세포의 활동의 만성 측정을 허용하는 최근 몇 년 동안, 두 광자 이미징, 신경 과학에서 매우 중요한 도구가되고있다. 여기서 우리는 동물이 가상 현실 환경을 탐색하는 동안 마우스 피질에서 두 광자 이미징을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 밝은 조명을 가상 환경에서 행동하는 동물 이미징 열쇠입니다 실험 절차의 측면에 초점을 맞추고있다. 우리가 여기에 주소가이 실험 장치에서 발생하는 주요 문제 : 뇌 운동 관련 유물을 최소화 가상 현실 프로젝션 시스템에서 빛의 누출을 최소화하고, 레이저 유도 조직의 손상을 최소화. 또한 가상 현실 환경을 제어하고 동공 추적 할 샘플 소프트웨어를 제공한다. 이러한 절차 및 그와는 생쥐 행동에 사용하기위한 종래 이광자 현미경으로 변환 할 수 있어야한다.
Introduction
(유전자 GCaMP5 7 R-GECO 8, OGB 또는 Fluo4 같은 합성 염료와 같은 인코딩) 칼슘 지표의 두 광자 영상은 쥐에게 1-6 행동에 신경 활동을 측정하는 강력한 방법으로 떠오르고있다. 약 800 μm의 뇌 표면 9,10 아래까지 거의 하나의 활동 전위 해상도에서 수백 개의 셀의 활동의 동시 측정을 가능하게합니다. 또한, 유전자에 의해 코딩 칼슘 지표 (GECIs)하여 신경 활성 만성적 5,11,12을 측정 할 수 있고, 유 전적으로 정의 세포 유형 13. 함께,이 방법은 생체 내에서 신경 계산의 연구에 새로운 가능성의 군중을 열어 시간과 공간 해상도의 정도를 제공합니다.
외과 적 수술은 이미지에 마우스 뇌를 노출하고 레이블 할 필요가있다. 셀은 일반적으로 재조합 아데노 - 관련 비르를 사용하여 형질 GECI 배송 및 두개골 창 우리 (AAV) 시스템은 뇌에 광 액세스를 얻기 위해 주사 부위에 주입된다. 헤드 바는 다음 두 광자 현미경으로 머리 고정 용 두개골에 부착된다. 웨이크 이미징 문제의 대부분은 제조에서 불안정성으로부터 발생으로 다음 단계의 설계 및 구현은 중요하다. 이상적으로 여기에 기술 된 절차는 수술 후 수개월까지의 만성 이미징을 허용한다.
두 광자 이미징 동안 시각적으로 유도 동작을 사용하려면, 머리 고정 마우스는 가상 현실 환경을 탐색하는 데 사용할 수있는 공기를 지원하는 구형 디딜 방아에 앉아있다. 트레드밀 마우스 운동력은 마우스 14,15를 둘러싼 환형 화면에 표시되는 가상 환경으로의 이동에 연결된다. 그러한 운동, 시각적 자극과 동공 위치와 같은 행동 변수가 6을 기록 할 수있다.
t는 "> 우리는 가상 현실 환경을 탐험 생쥐의 만성 두 광자 이미징에 관련된 절차에 대해 설명합니다 해결하는 핵심 사항은 다음과 같습니다. 운동 유물의 감소, 빛 누수의 감소를 동시에 기록 세포의 수의 최대화 및 최소화 사진을 손상. 우리는 또한 공중 지원 디딜 방아, 눈동자 추적, 가상 현실 환경을 설정하는 방법에 대한 세부 사항을 제공합니다. 여기에서 설명하는 절차는 행동 패러다임의 잠재적 다양한 머리 고정 생쥐의 형광 표지 세포 인구 이미징 사용할 수 있습니다 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물의 절차는 승인 광저우 바젤 슈타 트의 수의학 부서의 지침에 따라 수행 하였다.
1. 하드웨어 및 소프트웨어 설치
- 두 광자 주사 현미경 설정 :
- 조명 원 (펄스 폭 <120 FSEC)로 펄스 적외선 레이저를 사용합니다.
- . 8 또는 12 kHz의 공진 스캐너와 표준 검류계 주 구성 스캔 헤드를 사용 :이 750 X 400 픽셀에서 40 또는 60Hz의 프레임 속도를 가능하게한다. 높은 프레임 레이트는 뇌 운동 유도 화상의 왜곡을 최소화하기 위해 중요하다. 또한, 빠른 공진 스캔 높은 신호 수율 결과와 감소는 16 광독성을 photobleaching에.
- 여러 깊이에서 획득 시간 인터리빙 된 이미지를 순차적으로 압전 고속 Z-스테퍼를 사용하여 참고.이 선택 및 프레임 레이트의 희생 데이터 수율을 높이기 위해 사용된다.
- 오전을 사용하여조직에 레이저 노출을 줄이기 echanical 랭커. 스캐너의 공진 진폭에 따라 블 랭커의 폭을 조정 주 :. 인해 공진 스캐너의 스캔 경로의 정현파 성질, 레이저 빔 주사 턴어라운드 점에서 비교적 느린 이동. 레이저 노광이 가장 크다 이러한 턴어라운드 지점에서 조직의 손상을 방지하기 위해, 기계적 랭커는 레이저 빔을 정지 스캔 및 튜브 렌즈 사이의 초점면에 도입된다.
- . 데이터 수집을위한 필드 프로그래머블 게이트 어레이 (FPGA) 주와 함께 고속 디지타이저 (800 메가 헤르츠)를 사용 : FPGA 고역 통과 필터 및 화소로 PMT 신호 궤. 대역 통과 필터의 PMT 증폭기 결과에 FPGA 및 효과적인 저역 통과 필터의 고역 통과 필터의 조합은 대략 레이저 (80 메가 헤르츠)의 반복률을 중심. 샘플 FPGA 코드는 보충 교재로 제공된다.
- Dombeck 및 동료의 디자인을 기반으로 항공 지원 디딜 방아 설치 2
- 적어도 10mm 내경의 공기 공급 튜브를 이용하여 공기 공급관로 볼 홀더를 연결한다. 볼 홀더 급기 입구의 단면적을 최대화하고 메인 급기와 볼 홀더 주 사이 튜브의 충분한 양을 넣. 증가 단면과 공기 공급 튜브의 증가 된 길이는 소음 발생을 감소시킨다.
- 맞춤 설계 및 3D 인쇄 볼 홀더에 스티로폼 볼 (20cm 직경)를 놓습니다.
- 행동 패러다임은 앞으로 (뒤로) 운동이 필요한 경우, 볼의 측면에 핀 (예를 들어, 19 G 피하 주사 바늘)를 삽입하여 수평 (피치) 축에 공의 움직임을 제한 참고 :. 일반적으로 동물에 적응 이 감소 회전 패러다임에서 훨씬 빨리 설치.
- 하나 또는 두 개의 광학 컴퓨터 마우스를 사용하여 공의 궤도 운동각각 두 개의 주위에 운동 또는 세 축 모두를 감지 할 수 있습니다 :. 컴퓨터 마우스 이상적 이미징 이상 간섭 적외선 다이오드와 함께 작동해야합니다.
- 가상 현실 환경 설정
- 가상 현실 환경을 준비합니다 :. Panda3D를, 자유롭게 사용 가능한 게임 엔진을 기반으로 샘플 환경을 보충 교재로 제공된다. 가상 환경의 목적은 Wings3D, 오픈 소스 3D 모델링을 사용하여 생성됩니다. 샘플 프로그램 데이터 수집 카드에 위치 정보를 판독하고, 가상 환경에서 운동으로 이러한 변환한다. 코드는 또한 토 로이드 형 스크린 상에 투영되는 환경에 필요한 비선형 변환을 수행한다. 토 로이드 형 화면의 상세한 구성 밖에도 14, 17 설명되었다.
- 가상 환경을 표시하는 LED 프로젝터 또는 LED 백라이트 컴퓨터 화면을 사용합니다. 게이팅 CIR 통합. 촬상 주 동안 LED의 빠른 플리커위한 CUIT : 시각 자극 동안 두 광자 이미징 본질적인 문제는 대물 차폐함으로써 감소 될 수있는 시각적 자극 시스템에서 발생하는 광 누설이다. 이미징 동안 시각적 인 자극에 사용되는 LED 무대와 함께 이루어집니다 그러나, 시각적 자극 시스템에서 빛 누수가 완전히 (데이터가 수집되지 않음) 공진 스캐너의 선회 지점에 프로젝터의 빛 출력을 동기화하여 폐지 할 수있다 초파리 18. 이 시각적 인 자극 및 데이터 수집의 효과적인 고속 교대 (그림 2 참조)가 발생합니다. 플리커 주파수 (24 ㎑의) 깜빡 거림이 더 이상 동물에 의해 감지되지 않는 이상, 플리커 융합 임계 값 이상 규모의 명령입니다. 시판 LED 프로젝터에 본 변형의 전자 회로도가도 3에 도시된다.
- 새끼를 낳다일리노이 추적
- 동공 위치 추적을위한 CMOS 기반의 비디오 카메라 (30 fps)를 사용합니다. 카메라가 적외선 차단 필터를 포함하지 않는 있는지 확인하십시오 :. 학생 인해 눈을 통해 나오는 두 광자 여기 레이저에서 미광에 녹음하는 동안 높은 반면에 볼 수 있습니다. 학생의 위치와 직경은 Sakatani와 사 (19)의 디자인을 기반으로 사용자 정의 프로그래밍 소프트웨어를 사용하여 실시간으로 추출된다.
2. 유전 칼슘 표시기 및 창 임플란트의 주입
이전에 다음과 같은 추가 설명 된 바와 같이 칼슘 표시기 (20)와 두개골 창 (21)의 주입의 주입이 수행된다 :
- 바이러스 용액을 채워서 및 압력 분사 시스템에 연결된 유리 주입 피펫을 이용하여 관심 영역에 바이러스를 주입. 피펫에 따라 압력을 조정 안직경, 일반적으로 약. 70-140 밀리바, 1 ~ 2 분에 걸쳐 바이러스 솔루션의 약 100 NL을 주입한다. 저주파 (2 Hz에서 0.05 초 펄스)에 전달 저용량 분사 펄스는 주사 동안 피펫 따라 바이러스의 오버 플로우를 방지하기 위해 사용되어야한다 참고. 주입량을 모니터하기 위해, 피펫은 소규모로 표시 될 수있다 , 스테레오 현미경 균등 길이 (예 : 0.5 mm). 마킹 사이의 메 니스 커스의 변위는 주입 부피를 추정하는데 사용될 수있다.
- 몇 주 후 주입이 약 500 μm의 직경과 밀도가 표지 세포의 알약 발생한다. 또한 지역 GECI 발현 효능 GECI 프로모터 및 배합의 선택뿐만 아니라, 전염성 역가 및 사용 재조합 AAV의 혈청 형에 따라 주 :. 대표적인 예로서, AAV2/1-EF1α-GCaMP5의 분사 바이러스 가슴만족스러운 표정에 마우스 결과의 일차 시각 피질에 8 × 10 12 GC / ㎖ 어에는 약 2 주 동안 주사 (그림 1)을 배치한다.
- 헤드 바는 마우스의 시야를 방해하지 말고 행동하는 동안 안정된 영상을 허용 할 정도로 단단해야한다. 이것은 일반적으로 머리 바의 양쪽에 부착 2 점 (그림 1 참조)이 필요합니다. 단단히 두개골에 머리 막대를 연결하려면, 머리 막대가 첨부됩니다 노출 된 두개골의 영역을 극대화하고 건조해야합니다. 또한, 메스 나 주사기를 사용함으로써 접착에 대한 표면적을 증가 표면 홈을 만들 두개골 긁힐. 치과 용 시멘트로 머리 줄을 연결하기 전에 시아 노 아크릴 레이트 조직 접착제로 뼈를 커버.
3. 실험 절차
- 바이러스 주입 다음 2 ~ 3 주를, 에피에서 선명도와 표현의 두개골 창 임플란트를 확인형광 조명. 표재성 혈관 분명히 가시적이고 선명하게 정의 경계 윈도우 임플란트 (도 1 참조) 이미징에 적합 함 좋은 지표이다.
- 측정 시료에 50 mW의 이하 값으로 레이저 파워를 조정한다.
- 구형 디딜 방아로의 공기 흐름을 켭니다.
- 현미경으로 머리 고정을 위해, 간단하게 스트레스를 줄이기 위해 이소 플루 란과 동물을 마취. 이소 플루 란 마취 용기에 동물을 배치하고 동물 정지가 (약 10 초) 이동 때까지 기다립니다. 동물을 제거하고 즉시 머리 현미경으로 고정합니다.
- 여전히 동물에 대한 액세스를 허용하는 동물에 최대한 가까운 영상 표시 시스템을 배치합니다. 이하 가시 동물 실험으로, 적은 동물은 실험의 초기 단계에서 강조 될 것이다 갖는다.
- 두개골 창 임플란트는 먼지와 먼지가 묻어 있는지 확인합니다. 물 청소필요한 경우.
- 두개골 창 및 물 침수 목표 사이의 침수 매체로 명확한 초음파 젤을 적용합니다. 이는 수분 증발 또는 누설 느린 이미지 저하의 문제를 해결하고 물을 잡아 머리 줄에 콘을 장착 할 필요가 완화 참고 :. 원심 분리기 젤을하기 전에 모든 공기 방울을 제거하고 공기를 생성하지 않도록주의하는 사용 젤을 적용하는 동안 거품. 기포가 심하게 화질을 저하시킬 수있다.
- 차광을위한 목적과 머리 바 주위에 검은 색 테이프의 조각을 감싸십시오.
- 최종 위치로 가상 환경 분야를 이동하고 동공 추적을위한 비디오 카메라를 조정합니다.
- 실험 동안에 사용 스캔 진폭과 일치하도록 레이저 블 랭커를 설정한다.
- 데이터 기록을 시작합니다.
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Representative Results
GECI로 표지 된 세포 집단의 2 광자 칼슘 이미징 화질은 크게 두개 창 임플란트의 품질에 의존한다. 바이러스 주입에게 두개골 창을 다음과 같은 두 주 동안 명확성을 위해 검사를해야한다. 더 육아 조직 또는 뼈의 재성장 표시 (그림 1A)이 없어야합니다. 더욱이, 표재성 혈관의 패턴은 변경되지 않고 남아 있어야하고 혈관의 경계가 선명하게 정의되어야한다. 동시에 GECI 발현도 확인할 수있다. 표지 세포의 리바 르주 구 아야나시 마 탄은 표면 형광 현미경 (그림 1B)에서 명확하게 볼 수 있어야합니다.
이상적으로 준비는 충분히 쥐의 운동에 의해 유도 된 두 광자 이미지의 왜곡 프레임 등록 (그림 2) 후 이미지에 표시되지 않도록 안정적이다. 공명 스캐너의 스캔 경로는 비선형 이미지 왜곡의 결과 사인입니다. TU 중rnaround 포인트 데이터로 인해 스캔 경로의이 부분에서 스트레칭 이미지를 획득하지 않습니다. 시각적 자극 시스템, 프로젝터의 여기 LED의 광원이 제대로 턴어라운드 포인트 초과하는 경우, 빛 누출은이 시간 (그림 2) 동안 명백하다. 광원의 점멸 주파수가 두 번 주사 주파수이어야한다. 이 작품을 만들기의 핵심은 빠른 상승하며 LED 및 제어 전자 장치 (그림 3)의 하강 시간.
그림 1. 이주 수술 후 머리를 고정 마우스의 두개골 윈도우의 상위 뷰입니다. 동물에 부담을 줄이면서 (A) 헤드 바, 무게 및 이미징 실험을하는 동안 동작에 대한 안정성을 증가하는 형태로 최적화되어 있습니다. 티그는 바 알루미늄 만들었고 1mm의 두께를 갖는다 향한다. 스케일 바 5 mm이다. (B) 약 80 NL의 네 개의 주사 (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) 후 GCaMP5 식의 표면 형광 이미지. 주입 깊이는 약 400 μM이다. 스케일 바 1 mm이다. 헤드 바 (C) 회로도. mm에있는 모든 측정. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 빛의 누출을 감소시켜 노이즈 신호를 개선. 가상 현실 환경의 프로젝터의 LED 광원은 검사 소요 기간 데이터가 기록되지 않습니다 (오렌지 보 동안 켜 공진 스캐너에 동기화XES). 레이저 블 랭커는 시각적 자극으로 인한 광 누설의 영향을 설명하기 위해이 예를 들어 현미경에서 제거 하였다. 이미지 (데이터의 8 초 평균)는 AAV2/1-EF1α-GCaMP5 형질 전환 마우스 시각 피질에서 촬영했다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
전자의 그림 3. 회로 다이어그램은 기존의 LED 프로젝터를 깜박하는 데 사용됩니다. 게이트 회로가 공진 스캐너와 빠른 깜박임을 동기화 TTL 입력에 의해 구동된다. C1 : 콘덴서 개의 1nF, D1, D2 : 다이오드 1N4148, INV1 : 인버터 HEF40106 (6의 1을 사용) LED1 - 빔 프로젝터의 LED, R1 : 저항 47 Ω, R2 : 저항 2.2 kΩ의, R3 : 다시sistor 100 Ω, T1, T5, T6, T7 : 트랜지스터 IF9321, T2 : 트랜지스터 BC846, T3 : 트랜지스터 BC170, T4 : 트랜지스터 BC856. 이 회로는 프로젝터의 세 가지 색상 채널 (빨강, 파랑, 녹색)에 대해 반복해야합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
행동 두 광자 이미징의 성공의 열쇠는 두 가지 방법으로 제제의 안정성 :
- 일 포스트 창 주입의 과정을 통해, 조직의 염증 반응은 육아 조직 및 방해 또는 영상을 방지 할 수 연골의 형성의 향상으로 이어질 수 있습니다.
- 실험 기간 동안 뇌는 신경 활동과 관련된 형광 신호를 손상시키지 모션 아티팩트를 방지하기 위해 충분히 안정되어 있습니다.
두개골 창 이식 수술이 빨리 뇌에 가능 직접 손상으로 실시해야 최소한으로 염증성 면역 반응을 유지하기 위해 어떤 희생을 치르더라도 피해야한다. 가장 중요 두개 창 임플란트는 염증을 방지하기 위해 실험 전체 기간에 대한 기밀 유지되도록하는 것이다.
뇌의 움직임을 최소화하기 위해 관련 영상 유물이 손상되지 않도록주의를 취하거나수술시 경막을 제거합니다. 남은 운동 유도 뇌 운동 모션이 결상면 (X / Y 평면)에 평행 한 평면에 한정되는 경우에 대해 보정 될 수있다. X / Y 모션의 최대 허용 표준 편차는 약 5 μm의 수 있습니다. Z-축을 따라 모션이 값은 움직임의 정도는 현미경의 분해능 한계보다 작도록, 대략 1 μM이다.
스캔 경로 선회 지점에서 공진 스캐너의 낮은 속도는 레이저에 의한 조직의 손상을 초래할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해, 레이저 스캔 망원경의 블 랭커를 사용 출강에서 차단 될 수있다. 이 블 랭커가 올바르게 설정하고 목적에 따라 평균 레이저 출력이 50 mW의 이하로 유지되는 경우, 영상은 눈에 보이는 레이저 손상을 유발하지 않고 여러 일에 장시간이 가능합니다. 레이저의 기계적 블랭킹에 다른 방법은 turnarou에서 레이저 파워를 줄이기 위해 빨리 포켈 셀을 사용하는 것이다NDS. 그러나이 방법은 세포가 일반적으로 바람직하지 않은 빔의 왜곡을 소개 포켈 단점이있다.
가상 환경을 탐색 할 수있는 머리 고정 설치류의 적성은 가능한 행동 작업 3,4,6,22의 넓은 범위를 수행하는 쥐의 대뇌 피질 세포의 이미지 인구를 만성적으로하는했다. 그러나, 머리 고정은 본질적으로 구형 디딜 방아에 행동과 운동이 억제되지 않은 운동이나 정상적인 동작에 해당하지 여러 가지 방법에 제약 점을 상기 할 필요가있다.
장래에, 여기서 설명한 가상 현실 촬상 방식의 강도 가능성 동작 동안 타겟 optogenetic 자극 칼슘 촬상의 조합 일 것이다. 이것으로 그 결과 행동 변화를 모니터링하면서 광학 시냅스 세포와 이미지를 자신의 시냅스 목표를 조작 할 수있을 것입니다. 또, 칼슘 지표 자유롭게 CEL 내에 확산L, 또한 동작 동안 세포 내 구획에 선택적으로 활성을 측정하는 것이 가능할 것이다. 때문에 운동에 의한 뇌 운동으로, 이러한 기록은 안정적인 레코딩을 얻기 어려움에 의해 제한되었다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 생물 의학 연구를위한 프리드리히 Miescher 연구소, 막스 플랑크 사회, 인간 프론티어 과학 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
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