Summary
यहाँ हम एक आभासी वास्तविकता के वातावरण में व्यवहार के दौरान माउस प्रांतस्था के दो photon इमेजिंग में शामिल प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का वर्णन है.
Abstract
यह व्यवहार 1-6 दौरान आनुवंशिक रूप से पहचान कोशिकाओं की गतिविधि की पुरानी माप के लिए अनुमति देता है के रूप में हाल के वर्षों में, दो photon इमेजिंग, तंत्रिका विज्ञान में एक अमूल्य उपकरण बन गया है. यहाँ हम जानवर एक आभासी वास्तविकता पर्यावरण navigates जबकि माउस प्रांतस्था में दो photon इमेजिंग प्रदर्शन करने की विधियों का वर्णन. हम एक चमकते जलाया आभासी वातावरण में एक बर्ताव जानवर में इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण हैं कि प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के पहलुओं पर ध्यान केंद्रित. हम यहाँ संबोधित कर रहे हैं कि इस प्रयोगात्मक सेटअप में उठता है कि प्रमुख समस्याओं:, मस्तिष्क गति संबंधी कलाकृतियों को न्यूनतम आभासी वास्तविकता प्रक्षेपण प्रणाली से प्रकाश रिसाव को कम करने, और लेजर प्रेरित ऊतकों को नुकसान को न्यूनतम. हम भी आभासी वास्तविकता पर्यावरण को नियंत्रित करने के लिए और शिष्य को ट्रैक करने की नमूना सॉफ्टवेयर प्रदान करते हैं. इन प्रक्रियाओं और संसाधनों के साथ यह चूहों बर्ताव में इस्तेमाल के लिए एक पारंपरिक दो photon माइक्रोस्कोप कन्वर्ट करने के लिए संभव हो जाना चाहिए.
Introduction
(आनुवंशिक GCaMP5 7 या आर GECO 8, या OGB या Fluo4 तरह कृत्रिम रंगों की तरह इनकोडिंग) कैल्शियम संकेतक के दो photon इमेजिंग चूहों 1-6 बर्ताव में neuronal गतिविधि को मापने का एक शक्तिशाली विधि के रूप में उभरा है. यह लगभग 800 माइक्रोन मस्तिष्क की सतह 9,10 नीचे तक है, के पास भी कार्रवाई संभावित प्रस्ताव पर कोशिकाओं के सैकड़ों की गतिविधि का एक साथ माप सक्षम बनाता है. इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग कैल्शियम संकेतक (GECIs) का उपयोग neuronal गतिविधि चिरकाल 5,11,12 मापा जा सकता है, और आनुवंशिक रूप से परिभाषित प्रकार की कोशिकाओं में 13. साथ में, इन तरीकों विवो में neuronal अभिकलन के अध्ययन में नई संभावनाओं की एक भीड़ को खोलने कि अस्थायी और स्थानिक संकल्प की एक डिग्री प्रदान करते हैं.
सर्जिकल हस्तक्षेप इमेजिंग के लिए माउस मस्तिष्क बेनकाब और लेबल करने के लिए आवश्यक है. कोशिकाओं को आमतौर पर एक पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वीर का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट हैं GECI वितरण और एक कपाल खिड़की के लिए हमें (AAV) प्रणाली मस्तिष्क के लिए ऑप्टिकल पहुँच प्राप्त करने के लिए इंजेक्शन स्थल पर प्रत्यारोपित किया जाता है. एक सिर बार फिर दो photon माइक्रोस्कोप के नीचे सिर निर्धारण के लिए खोपड़ी से जुड़ा हुआ है. जाग इमेजिंग के साथ समस्याओं का सबसे तैयारी में अस्थायित्व से उठता है के रूप में इन चरणों के डिजाइन और कार्यान्वयन के लिए महत्वपूर्ण है. आदर्श रूप में यहाँ वर्णित प्रक्रिया सर्जरी के बाद कई महीने तक की पुरानी इमेजिंग के लिए अनुमति चाहिए.
दो photon इमेजिंग के दौरान नेत्रहीन निर्देशित व्यवहार को सक्षम करने के लिए, सिर तय माउस यह एक आभासी वास्तविकता वातावरण नेविगेट करने के लिए उपयोग कर सकते हैं जो एक हवाई समर्थित गोलाकार ट्रेडमिल, पर बैठता है. ट्रेडमिल पर माउस की हरकत माउस 14,15 आसपास एक toroidal स्क्रीन पर प्रदर्शित किया जाता है कि आभासी वातावरण में आंदोलन के लिए युग्मित है. ऐसी हरकत, दृश्य उत्तेजना, और शिष्य की स्थिति के रूप में व्यवहार चर 6 रिकॉर्ड किया जा सकता है.
टी "> हम एक आभासी वास्तविकता के वातावरण की खोज चूहों में पुरानी दो photon इमेजिंग में शामिल प्रक्रियाओं का वर्णन संबोधित प्रमुख बिंदु इस प्रकार हैं:. आंदोलन कलाकृतियों की कमी, प्रकाश रिसाव की कमी, एक साथ दर्ज कोशिकाओं की संख्या को अधिकतम, और के न्यूनतम फोटो नुकसान. हम भी हवा का समर्थन ट्रेडमिल, शिष्य ट्रैकिंग, और आभासी वास्तविकता वातावरण स्थापित करने पर जानकारी प्रदान करते हैं. यहाँ वर्णित प्रक्रियाओं व्यवहार मानदंड का एक संभावित विस्तृत विविधता में सिर तय चूहों में fluorescently लेबल सेल आबादी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी और कैंटन बेसल स्टैड के पशु चिकित्सा विभाग के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया.
1. हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर सेटअप
- दो photon खुर्दबीन स्कैनिंग सेटअप:
- एक रोशनी स्रोत (पल्स चौड़ाई <120 FSEC) के रूप में एक स्पंदित अवरक्त लेजर का उपयोग करें.
- . एक 8 या 12 kHz गुंजयमान स्कैनर और एक मानक बिजली की शक्ति नापने नोट से बना एक स्कैन सिर का उपयोग करें: यह 750 x 400 पिक्सल पर 40 या 60 हर्ट्ज के फ्रेम दर सक्षम बनाता है. एक उच्च फ्रेम दर मस्तिष्क गति प्रेरित छवि विरूपण को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, तेजी से गुंजयमान स्कैनिंग एक उच्च संकेत उपज में परिणाम और कम कर देता है 16 और phototoxicity photobleaching.
- कई गहराई में अधिग्रहण समय interleaved छवियों क्रमिक करने के लिए एक Piezo बिजली उच्च गति Z-Stepper का उपयोग नोट:. यह वैकल्पिक और फ्रेम दर की कीमत पर डेटा उपज बढ़ाने के लिए किया है.
- AM प्रयोग करेंऊतक लेजर जोखिम को कम करने के लिए echanical blanker. गुंजयमान स्कैनर के आयाम पर निर्भर करता है blanker की चौड़ाई समायोजित नोट:. कारण एक गुंजयमान स्कैनर का स्कैन पथ के sinusoidal प्रकृति के कारण, लेजर बीम स्कैन से बदलाव बिंदुओं पर तुलनात्मक रूप से धीमी गति से चलता है. लेजर जोखिम सबसे बड़ा है, जहां इन प्रतिवर्तन बिंदुओं पर ऊतक के नुकसान को रोकने के लिए, एक यांत्रिक blanker लेजर बीम बंद हो जाता है कि स्कैन और ट्यूब लेंस के बीच फोकल हवाई जहाज़ में शुरू की है.
- . डाटा अधिग्रहण के लिए एक क्षेत्र प्रोग्राम गेट सरणी (FPGA) नोट के साथ संयोजन में एक उच्च गति digitizer (800 मेगाहर्ट्ज) का उपयोग करें: FPGA उच्च पास फिल्टर और पिक्सल में पीएमटी संकेत डिब्बे. एक बैंड पास फिल्टर में पीएमटी एम्पलीफायर परिणाम पर FPGA और प्रभावी कम पास फिल्टर पर उच्च पास फिल्टर का संयोजन मोटे तौर पर लेजर (80 मेगाहर्ट्ज) की पुनरावृत्ति दर के आसपास केंद्रित. नमूना FPGA कोड एक पूरक के रूप में प्रदान की जाती है.
- Dombeck और उनके सहयोगियों के डिजाइन पर आधारित एयर समर्थित ट्रेडमिल सेटअप 2
- कम से कम 10 मिमी भीतरी व्यास की एक हवा की आपूर्ति ट्यूब का उपयोग कर एक हवा की आपूर्ति लाइन के लिए गेंद धारक कनेक्ट करें. गेंद धारक हवा की आपूर्ति इनलेट के पार अनुभाग अधिकतम और मुख्य हवा की आपूर्ति और गेंद धारक नोट के बीच ट्यूबिंग की पर्याप्त राशि जगह:. वृद्धि क्रॉस सेक्शन और हवा की आपूर्ति ट्यूबिंग की वृद्धि की लंबाई शोर पीढ़ी को कम करता है.
- एक कस्टम डिजाइन और 3 डी मुद्रित गेंद धारक में एक polystyrene फोम गेंद (20 सेमी व्यास) रखें.
- व्यवहार प्रतिमान केवल आगे (और पिछड़े) हरकत की आवश्यकता है, गेंद के किनारे पर एक पिन (जैसे एक 19 जी चमड़े के नीचे सुई) डालने से क्षैतिज (पिच) अक्ष के लिए गेंद के आंदोलन को प्रतिबंधित नोट:. आमतौर पर जानवरों के लिए अनुकूल यह कम रोटेशन प्रतिमान में बहुत जल्दी सेटअप.
- एक या दो ऑप्टिकल कंप्यूटर चूहों का उपयोग कर गेंद का ट्रैक आंदोलनक्रमशः, दो के आसपास गति या सभी तीन कुल्हाड़ियों का पता लगाने के लिए नोट:. कंप्यूटर चूहों आदर्श इमेजिंग के साथ कम से कम हस्तक्षेप के लिए एक अवरक्त डायोड के साथ काम करना चाहिए.
- आभासी वास्तविकता पर्यावरण सेटअप
- आभासी वास्तविकता वातावरण तैयार नोट:. Panda3D, एक स्वतंत्र रूप से उपलब्ध खेल इंजन पर आधारित एक नमूना पर्यावरण, एक पूरक के रूप में प्रदान की जाती है. आभासी पर्यावरण की वस्तुओं Wings3D, एक खुला स्रोत 3 डी नमूना बनानेवाला का उपयोग कर उत्पन्न कर रहे हैं. नमूना कार्यक्रम एक डाटा अधिग्रहण कार्ड पर स्थिति की जानकारी पढ़ता है और आभासी वातावरण में आंदोलन में यह अनुवाद. कोड भी एक toroidal स्क्रीन पर पेश होने के लिए पर्यावरण के लिए आवश्यक nonlinear परिवर्तन करता है. toroidal स्क्रीन का विस्तृत निर्माण अन्यत्र 14,17 वर्णित किया गया है.
- आभासी वातावरण प्रदर्शित करने के लिए एलईडी प्रोजेक्टर या एलईडी बैकलिट कंप्यूटर स्क्रीन का प्रयोग करें. एक gating Cir एकीकृत. इमेजिंग नोट दौरान एल ई डी के तेजी से चंचल के लिए CUIT: दृश्य उत्तेजना के दौरान दो photon इमेजिंग में एक अंतर्निहित समस्या उद्देश्य परिरक्षण द्वारा कम किया जा सकता है जो दृश्य उत्तेजना प्रणाली, से होने वाले प्रकाश रिसाव है. में इमेजिंग के दौरान दृश्य उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया एलईडी एरेनास के साथ किया जाता है लेकिन, जैसा दृश्य उत्तेजना प्रणाली से प्रकाश रिसाव पूरी तरह से, (डेटा का अधिग्रहण नहीं कर रहे हैं) गुंजयमान स्कैनर के टर्नअराउंड अंक के लिए प्रोजेक्टर का प्रकाश उत्पादन सिंक्रनाइज़ करके समाप्त कर दिया जा सकता है ड्रोसोफिला 18. इस दृश्य उत्तेजना और डाटा अधिग्रहण के लिए एक प्रभावी उच्च गति प्रत्यावर्तन (देखें चित्र 2) में यह परिणाम है. चंचल आवृत्ति (24 kHz) चंचल नहीं रह पशु द्वारा माना जाता है, जो ऊपर, झिलमिलाहट संलयन सीमा से ऊपर परिमाण के आदेश है. एक वाणिज्यिक एलईडी प्रोजेक्टर के लिए इस संशोधन के इलेक्ट्रॉनिक सर्किट आरेख चित्रा 3 में दिखाया गया है.
- पिल्लाआईएल ट्रैकिंग
- शिष्य स्थिति पर नज़र रखने के लिए एक CMOS आधारित वीडियो कैमरा (30 एफपीएस) का प्रयोग करें. कैमरा एक अवरक्त अवरुद्ध फिल्टर नहीं है कि नोट सुनिश्चित करें:. शिष्य की वजह से आंख के माध्यम से बाहर निकलने दो photon उत्तेजना लेजर से भटका प्रकाश में रिकॉर्डिंग के दौरान उच्च विपरीत पर दिख रहा है. छात्र स्थिति और व्यास Sakatani और ईसा 19 के डिजाइन पर आधारित कस्टम क्रमादेशित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर वास्तविक समय में निकाला जाता है.
2. जेनेटिक कैल्शियम सूचक और खिड़कियों के प्रत्यारोपण का इंजेक्शन
पहले से निम्नलिखित परिवर्धन के साथ वर्णित के रूप में एक कैल्शियम सूचक 20 और कपाल खिड़की 21 के आरोपण का इंजेक्शन प्रदर्शन कर रहे हैं:
- वायरस समाधान के साथ backfilled और एक दबाव इंजेक्शन प्रणाली से जुड़े एक गिलास इंजेक्शन पिपेट का उपयोग हित के क्षेत्र में वायरस इंजेक्षन. पिपेट के आधार पर दबाव को समायोजित भीतरीव्यास, आम तौर पर लगभग. 70-140 एम्बार, 1-2 मिनट के पाठ्यक्रम पर वायरस समाधान के लगभग 100 NL इंजेक्षन. कम आवृत्ति (2 हर्ट्ज पर 0.05 सेकंड दालों) में दिया कम मात्रा इंजेक्शन दालों इंजेक्शन दौरान पिपेट साथ वायरस की बाढ़ को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ध्यान दें:. इंजेक्शन की मात्रा की निगरानी करने के लिए, पिपेट छोटे पर चिह्नित किया जा सकता है , एक स्टीरियो खुर्दबीन के नीचे समान स्थान लंबाई (जैसे 0.5 मिमी). चिह्नों के बीच meniscus के विस्थापन तो इंजेक्शन की मात्रा का अनुमान किया जा सकता है.
- कई सप्ताह के बाद इंजेक्शन यह लगभग 500 मीटर की एक व्यास के साथ घनी लेबल की कोशिकाओं के एक सांस में परिणाम चाहिए. ब्याज के क्षेत्र में GECI अभिव्यक्ति की प्रभावकारिता GECI और प्रमोटर संयोजन का विकल्प है, साथ ही संक्रामक अनुमापांक और प्रयोग पुनः संयोजक AAV की सीरोटाइप पर निर्भर करता है नोट:. एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, AAV2/1-EF1α-GCaMP5 के इंजेक्शन के साथ एक वायरल तैसासंतोषजनक अभिव्यक्ति में एक माउस के परिणाम की प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था में 8 X 10 से 12 जीसी / एमएल के ईआर में लगभग दो सप्ताह के इंजेक्शन (चित्रा 1) के बाद.
- सिर बार माउस का दृश्य क्षेत्र में बाधा डालती नहीं चाहिए, लेकिन व्यवहार के दौरान स्थिर इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त कठोर होना चाहिए. यह आमतौर पर सिर पट्टी के दोनों तरफ लगाव के दो अंक (चित्रा 1 देखें) की आवश्यकता है. मजबूती से खोपड़ी के लिए सिर पट्टी संलग्न करने के लिए, सिर पट्टी संलग्न किया जाएगा, जहां उजागर खोपड़ी के क्षेत्र को अधिकतम और सुखाने के लिए सुनिश्चित करें. इसके अतिरिक्त, एक छुरी या एक सिरिंज का उपयोग, जिससे gluing के लिए सतह क्षेत्र बढ़ रही सतही खांचे बनाने के लिए खोपड़ी खरोंच. दंत सीमेंट के साथ सिर पट्टी संलग्न करने से पहले cyanoacrylate ऊतक चिपकने के साथ अस्थि आवरण.
3. प्रयोगात्मक प्रक्रिया
- वायरस इंजेक्शन के बाद दो से तीन सप्ताह, महामारी के तहत स्पष्टता और अभिव्यक्ति के लिए कपाल खिड़की प्रत्यारोपण की जांचप्रतिदीप्ति रोशनी. सतही रक्त वाहिकाओं का स्पष्ट रूप से दिखाई और तेजी से परिभाषित सीमाओं खिड़की प्रत्यारोपण (चित्रा 1 देखें) इमेजिंग के लिए उपयुक्त है कि एक अच्छा संकेत हैं.
- उपाय और नमूना पर 50 मेगावाट के नीचे एक मूल्य के लिए लेजर शक्ति को समायोजित.
- गोलाकार ट्रेडमिल के लिए airflow चालू करें.
- खुर्दबीन के नीचे सिर निर्धारण के लिए, संक्षेप तनाव कम करने के लिए isoflurane के साथ पशु anesthetize. एक isoflurane संज्ञाहरण कंटेनर में पशु रखें और जानवर बंद हो जाता है (लगभग 10 सेकंड) आगे बढ़ जब तक प्रतीक्षा करें. पशु निकालें और तुरंत सिर खुर्दबीन के नीचे यह तय कर लो.
- अभी भी जानवर के लिए उपयोग के लिए अनुमति देने के लिए पशु के लिए संभव के रूप में बंद दृश्य प्रदर्शन प्रणाली रखें. कम दृश्य से संपर्क पशु प्रयोगकर्ता के साथ, कम पशु प्रयोग के प्रारंभिक चरण के दौरान किया जाएगा पर जोर दिया है.
- कपाल खिड़की प्रत्यारोपण धूल और गंदगी से मुक्त है सुनिश्चित करें. पानी के साथ साफयदि आवश्यक हो.
- कपाल खिड़की और जल विसर्जन उद्देश्य के बीच विसर्जन माध्यम के रूप में स्पष्ट अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें. इस वजह से पानी के वाष्पीकरण या रिसाव के लिए धीमी गति छवि गिरावट की समस्याओं का हल और पानी धारण करने के लिए सिर पट्टी पर एक शंकु माउंट करने की जरूरत alleviates नोट:. अपकेंद्रित्र जेल से पहले सभी हवाई बुलबुले को दूर, और किसी भी हवा बनाने के लिए नहीं देखभाल करने के लिए उपयोग जेल के आवेदन के दौरान बुलबुले. एयर बुलबुले गंभीर रूप से छवि गुणवत्ता नीचा कर सकते हैं.
- प्रकाश परिरक्षण के लिए उद्देश्य और सिर पट्टी के चारों ओर काले टेप का एक टुकड़ा लपेटें.
- इसकी अंतिम स्थिति के लिए आभासी वातावरण के मैदान में ले जाएँ और शिष्य ट्रैकिंग के लिए वीडियो कैमरे को समायोजित.
- प्रयोग के दौरान इस्तेमाल किया स्कैन आयाम मैच के लिए लेजर blanker सेट करें.
- डेटा रिकॉर्डिंग शुरू.
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Representative Results
एक GECI साथ लेबल सेल आबादी की दो photon कैल्शियम इमेजिंग में छवि गुणवत्ता काफी हद तक कपाल खिड़की प्रत्यारोपण की गुणवत्ता पर निर्भर करता है. वायरस इंजेक्शन कपाल खिड़की के बाद दो सप्ताह स्पष्टता के लिए निरीक्षण किया जाना चाहिए. कोई दानेदार ऊतक या हड्डी regrowth दिखाई (चित्रा 1 ए) होना चाहिए. इसके अलावा, सतही रक्त वाहिकाओं के पैटर्न में कोई बदलाव नहीं रहना चाहिए और vasculature की सीमाओं को तेजी से परिभाषित किया जाना चाहिए. इसी समय, GECI अभिव्यक्ति भी जाँच की जा सकती. लेबल कोशिकाओं की बोली एक epifluorescence खुर्दबीन (चित्रा 1 बी) के तहत स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए.
आदर्श रूप में तैयार करने के लिए पर्याप्त माउस की हरकत से प्रेरित दो फोटॉन छवियों की विकृतियों फ्रेम पंजीकरण (चित्रा 2) के बाद छवि में दिखाई नहीं देते हैं कि इस तरह स्थिर है. गुंजयमान स्कैनर का स्कैन पथ nonlinear छवि विरूपण में जिसके परिणामस्वरूप sinusoidal है. तू दौरानrnaround अंक डेटा की वजह से स्कैन मार्ग के इस हिस्से में खींच छवि को हासिल नहीं कर रहे हैं. दृश्य उत्तेजना प्रणाली, प्रोजेक्टर के यहां एल ई डी के प्रकाश स्रोत, सही ढंग से बदलाव अंक के लिए समय है, तो प्रकाश रिसाव केवल इस समय (चित्रा 2) के दौरान स्पष्ट किया जाना चाहिए. प्रकाश स्रोत की चंचल आवृत्ति दो बार स्कैन आवृत्ति हो गया है. इस काम बनाने के लिए महत्वपूर्ण तेजी से वृद्धि कर रहे हैं और एल ई डी और नियंत्रण इलेक्ट्रॉनिक्स (चित्रा 3) के समय गिर जाते हैं.
चित्रा 1. दो सप्ताह के बाद सर्जरी एक सिर तय माउस में एक कपाल विंडो के ऊपर देखें. पशु पर बोझ को कम करते हुए (ए) सिर पट्टी, वजन और इमेजिंग प्रयोगों के दौरान व्यवहार के लिए स्थिरता को बढ़ाने के लिए आकार में अनुकूलित है. टीवह बार एल्यूमीनियम से बनाया और 1 मिमी की मोटाई है सिर. स्केल बार 5 मिमी है. (बी) के लगभग 80 NL के चार इंजेक्शन (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) के बाद GCaMP5 अभिव्यक्ति की epifluorescence छवि. इंजेक्शन गहराई लगभग 400 मीटर है. स्केल बार 1 मिमी है. सिर पट्टी (सी) Schematics. मिमी में सभी मापन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. प्रकाश रिसाव को कम करने से शोर करने के लिए संकेत सुधार. आभासी वास्तविकता पर्यावरण के प्रोजेक्टर में एलईडी प्रकाश स्रोत केवल स्कैन से बदलाव की अवधि के डेटा दर्ज नहीं कर रहे हैं जब (नारंगी बो दौरान चालू करने के लिए गुंजयमान स्कैनर को सिंक्रनाइज़ हैXES). लेजर blanker दृश्य उत्तेजना से उत्पन्न प्रकाश रिसाव के प्रभाव को वर्णन करने के लिए इस उदाहरण के लिए माइक्रोस्कोप से हटा दिया गया था. छवि (डेटा का 8 सेकंड का औसत) AAV2/1-EF1α-GCaMP5 साथ ट्रांसफ़ेक्ट माउस दृश्य प्रांतस्था में लिया गया था. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
इलेक्ट्रॉनिक्स की चित्रा 3. सर्किट आरेख एक पारंपरिक एलईडी प्रोजेक्टर झिलमिलाहट के लिए इस्तेमाल किया. Gating सर्किट गुंजयमान स्कैनर के साथ तेजी से चंचल सिंक्रनाइज़ करने के लिए एक टीटीएल इनपुट से प्रेरित है. सी 1: संधारित्र 1nF, डी 1, डी 2: डायोड 1N4148, INV1: इन्वर्टर HEF40106 (6 की 1 प्रयुक्त); LED1 - बीमर का नेतृत्व किया, R1: रोकनेवाला 47 Ω; R2: रोकनेवाला 2.2 kΩ, R3: पुनःsistor 100 Ω, T1, T5, T6, T7: ट्रांजिस्टर IF9321, टी 2: ट्रांजिस्टर BC846, T3: ट्रांजिस्टर BC170, टी -4: ट्रांजिस्टर BC856. इस सर्किट प्रोजेक्टर के सभी तीन रंग चैनल (हरे, नीले, लाल,) के लिए दोहराया जाना है कि ध्यान दें. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
व्यवहार दो photon इमेजिंग की सफलता की कुंजी दो तरह से तैयार करने की स्थिरता है:
- दिनों के बाद खिड़की आरोपण के दौरान, ऊतक के भड़काऊ प्रतिक्रियाओं दानेदार ऊतक और बाधा या भी इमेजिंग कर पाएगा कि उपास्थि के गठन की वृद्धि हो सकती है.
- प्रयोग के दौरान मस्तिष्क तंत्रिका गतिविधि से संबंधित प्रतिदीप्ति संकेत भ्रष्ट से गति कलाकृतियों को रोकने के लिए पर्याप्त रूप से स्थिर हो गया है.
कपाल विंडो आरोपण सर्जरी के रूप में जल्दी से मस्तिष्क के लिए संभव है और प्रत्यक्ष क्षति के रूप में बाहर किया जाना चाहिए एक न्यूनतम करने के लिए सूजन प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया रखने के लिए हर हालत में बचा जाना चाहिए. सर्वोच्च महत्व का कपाल खिड़की प्रत्यारोपण सूजन को रोकने के लिए प्रयोग की पूरी अवधि के लिए वायुरोधी रहता है यह सुनिश्चित करने के लिए है.
मस्तिष्क गति को कम करने के लिए संबंधित इमेजिंग कलाकृतियों को नुकसान नहीं ख्याल रखना यासर्जरी के दौरान ड्यूरा मेटर हटा दें. शेष हरकत प्रेरित मस्तिष्क गति गति इमेजिंग विमान (एक्स / y विमान) को विमान समानांतर तक ही सीमित है जब के लिए सुधारा जा सकता है. एक्स / y में गति की अधिकतम संतोषजनक मानक विचलन लगभग 5 माइक्रोन है. Z-अक्ष के साथ गति के लिए इस मूल्य आंदोलन की हद माइक्रोस्कोप का संकल्प सीमा से छोटी है, ऐसी है कि मोटे तौर पर 1 माइक्रोन है.
स्कैन पथ से बदलाव अंक में सुनाई देती स्कैनर की कम स्पीड लेजर प्रेरित ऊतकों को नुकसान हो सकता है. इसे रोकने के लिए, लेजर स्कैन दूरबीन में एक blanker का उपयोग turnarounds पर अवरुद्ध किया जा सकता है. इस blanker सही ढंग से स्थापित है और उद्देश्य के तहत औसत लेजर बिजली 50 मेगावाट से नीचे रखा जाता है, तो इमेजिंग किसी भी दृश्य लेजर क्षति के कारण के बिना कई दिनों से अधिक समय की विस्तारित अवधि के लिए संभव है. लेजर की एक यांत्रिक रिक्त करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका turnarou पर लेजर शक्ति को कम करने के लिए एक तेजी से Pockels सेल का उपयोग करने के लिए हैएनडीएस. इस विधि हालांकि कोशिकाओं आम तौर पर अवांछनीय किरण विकृतियों को पेश Pockels कि नुकसान है.
आभासी वातावरण नेविगेट करने के लिए सिर तय कृन्तकों की योग्यता यह संभव व्यवहार कार्यों 3,4,6,22 की एक विस्तृत श्रृंखला प्रदर्शन चूहों के प्रांतस्था में कोशिकाओं की छवि आबादी लंबे समय तक बना दिया है. हालांकि, यह सिर निर्धारण स्वाभाविक एक गोलाकार ट्रेडमिल पर व्यवहार और हरकत अनर्गल हरकत या सामान्य व्यवहार के बराबर नहीं कई मायनों में है constrains ध्यान दें कि सार्थक है.
भविष्य में, यहाँ वर्णित आभासी वास्तविकता इमेजिंग दृष्टिकोण की ताकत संभावना व्यवहार दौरान लक्षित optogenetic उत्तेजना के साथ कैल्शियम इमेजिंग का संयोजन किया जाएगा. इसके साथ ही यह परिणामी व्यवहार में बदलाव की निगरानी करते हुए ऑप्टिकली presynaptic कोशिकाओं और छवि उनके बाद synaptic लक्ष्य में हेरफेर करना संभव होगा. इसके अलावा, के रूप में कैल्शियम संकेतक आज़ादी सीईएल के भीतर फैलानाएल, यह भी व्यवहार के दौरान subcellular डिब्बों में चुनिंदा गतिविधि को मापने के लिए संभव हो जाएगा. कारण आंदोलन प्रेरित मस्तिष्क गति के लिए, ऐसे रिकॉर्डिंग स्थिर रिकॉर्डिंग प्राप्त करने में कठिनाई द्वारा सीमित किया गया है.
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.
Acknowledgments
इस काम बायोमेडिकल रिसर्च के लिए फ्रेडरिक Miescher संस्थान, मैक्स प्लैंक सोसायटी, और मानव सीमाओं विज्ञान कार्यक्रम के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
