Summary
Aqui nós descrevemos os procedimentos experimentais envolvidos em dois fótons de imagem de rato córtex durante o comportamento em um ambiente de realidade virtual.
Abstract
Nos últimos anos, dois fótons de imagem tornou-se uma ferramenta valiosa na neurociência, uma vez que permite a medição crônica da atividade de células geneticamente identificados durante comportamento 1-6. Aqui nós descrevemos métodos para realizar imagem de dois fótons em rato córtex enquanto o animal navega um ambiente de realidade virtual. Nós nos concentramos nos aspectos dos procedimentos experimentais, que são fundamentais para a imagem em um animal se comportar em um ambiente virtual iluminado. Os principais problemas que surgem nesta configuração experimental que nós aqui endereço são: minimizar artefatos de movimento do cérebro relacionada, minimizando luz vazamento do sistema de projeção de realidade virtual, e minimizando o dano tecidual induzida por laser. Nós também fornecemos software de amostra para controlar o ambiente de realidade virtual e fazer o acompanhamento dos alunos. Com estes processos e os recursos que deveria ser possível converter um microscópio de dois fotões convencional para uso em comportando ratinhos.
Introduction
Dois fótons de imagem de cálcio (indicadores geneticamente codificados como GCaMP5 7 ou R-GECO 8 ou corantes sintéticos como OGB ou Fluo4) emergiu como um poderoso método de medir a atividade neuronal em ratos comportando 1-6. Ele permite a medição simultânea da actividade de centenas de células de acção quase único potencial resolução, até cerca de 800 um abaixo da superfície do cérebro 9,10. Além disso, por meio de indicadores de cálcio geneticamente codificados (Gecis) atividade neuronal pode ser medido cronicamente 5,11,12, e em tipos de células geneticamente definidas 13. Juntos, estes métodos proporcionam um grau de resolução temporal e espacial, que abre um grande número de novas possibilidades para o estudo de computação neuronal in vivo.
A intervenção cirúrgica é necessária para expor e rotular o cérebro do rato para a imagem latente. As células são tipicamente transfectados utilizando um recombinante vir adeno-associado nos sistema (AAV) para entrega GECI e uma janela craniana é implantado no local da injecção para ter acesso óptico ao cérebro. Uma barra de cabeça é então ligado ao crânio para fixação da cabeça sob o microscópio de dois fotões. A concepção e implementação dessas medidas é fundamental, como a maioria dos problemas com a imagem acordado surgem de instabilidades na preparação. Idealmente o procedimento descrito aqui deve permitir a imagem crônica de até vários meses após a cirurgia.
Para ativar o comportamento visualmente guiado durante dois fótons de imagem, o rato fixo cabeça fica em um ar apoiado esteira esférica, que ele pode usar para navegar em um ambiente de realidade virtual. Locomotion do mouse sobre a esteira é acoplado ao movimento no ambiente virtual que é exibido em uma tela toroidal em torno do 14,15 mouse. Variáveis comportamentais, tais como locomoção, estímulo visual, e posição da pupila podem ser gravadas 6.
t "> Nós descrevemos os procedimentos envolvidos em dois fótons de imagem crônica em camundongos explorando um ambiente de realidade virtual Os principais pontos abordados são:. redução de artefatos de movimento, a redução do vazamento de luz, a maximização do número de células gravadas simultaneamente, e minimização de danos foto. Nós também fornecemos detalhes sobre como configurar a esteira apoiada pelo ar, controle de aluno eo ambiente de realidade virtual. Os procedimentos descritos aqui pode ser usado para geração de imagens de populações de células marcadas com fluorescência em camundongos fixos na cabeça em um potencialmente grande variedade de paradigmas comportamentais .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos com animais foram aprovados e realizados em conformidade com as diretrizes do Departamento de Cantão Basel-Stadt Veterinária.
1. Hardware e Software Setup
- Dois fótons configuração microscópio de varredura:
- Use um laser infravermelho pulsado como fonte de iluminação (largura de pulso <120 FSEC).
- Use uma cabeça de leitura composto por um scanner de ressonância 8 ou 12 kHz e um padrão galvanometer Nota:. Isso permite taxas de quadro de 40 ou 60 Hz em 750 x 400 pixels. A alta taxa de quadros é fundamental para minimizar a distorção da imagem de movimento do cérebro induzido. Além disso, a rápida varredura de ressonância resulta em um rendimento de sinal maior e reduz fotodegradação 16 e fototoxicidade.
- Use uma alta velocidade z-passo piezo-eléctrico para sequencialmente imagens intercaladas tempo, adquirir em várias profundidades Nota:. Isto é opcional e utilizado para aumentar a produção de dados, em detrimento da taxa de quadros.
- Use amecânica redutor para reduzir a exposição ao laser para o tecido. Ajustar a largura do redutor de acordo com a amplitude do scanner de ressonância Nota:. Devido à natureza sinusoidal do percurso de varrimento de um scanner de ressonância, o feixe de laser se move lenta comparativamente aos pontos de resposta de verificação. Para evitar danos do tecido nesses pontos de rotação em que a exposição do laser é maior, um redutor mecânico é introduzido no plano focal entre a verificação e lentes de tubo que interrompe o feixe de laser.
- Para aquisição de dados usar um digitalizador de alta velocidade (800 MHz) em combinação com um gate array programável em campo (FPGA) Nota:. Os filtros passa-alta FPGA e escaninhos do sinal PMT em pixels. A combinação do filtro passa-alto em FPGA e o filtro de passagem baixa efectiva no resultado amplificador PMT em um filtro passa-banda centrado aproximadamente em torno da frequência de repetição do laser (80 MHz). FPGA código de exemplo é fornecido como um complemento.
- Instalação de esteira pneumática com base no design de Dombeck e colegas 2
- Ligue o suporte da esfera para uma linha de fornecimento de ar usando um tubo de, pelo menos, 10 mm de diâmetro interno de alimentação de ar. Maximizar a seção transversal do titular bola de entrada de alimentação de ar e coloque uma ampla quantidade de tubulação entre o principal suprimento de ar e suporte a bola Nota:. Seção transversal aumentada e aumento do comprimento do tubo de alimentação de ar reduz a geração de ruído.
- Coloque uma bola de espuma de poliestireno (20 cm de diâmetro) em um suporte de bola e 3D-impressos personalizados.
- Se o paradigma comportamental requer apenas para a frente (ou para trás) a locomoção, para restringir o movimento da bola para o (tom) de eixo horizontal através da inserção de um pino (por exemplo, uma agulha hipodérmica 19 G), no lado da bola Nota:. Animais tipicamente adaptar a a configuração muito mais rápido neste reduzido paradigma rotação.
- Movimento faixa da bola usando um ou dois ratos de computador ópticopara detectar o movimento em torno de dois ou todos os três eixos, respectivamente Nota:. Os ratos de computador deve idealmente operar com um diodo infravermelho para menos interferência com a imagem latente.
- Configuração do ambiente de realidade virtual
- Prepare o ambiente de realidade virtual Nota:. Um exemplo de ambiente baseado em Panda3D, um motor de jogo disponível gratuitamente, é fornecido como um complemento. Os objetos do ambiente virtual são gerados usando Wings3D, um modelador 3D de código aberto. O programa de exemplo lê informações de posição em um cartão de aquisição de dados e traduz isso em movimento no ambiente virtual. O código também realiza a transformação não-linear necessário para o ambiente a ser projetada em uma tela toroidal. A construção detalhada do ecrã toroidal tenha sido descrita em outro lugar 14,17.
- Utilize projetores LED ou telas de computador LED backlit para apresentar o ambiente virtual. Integrar um cir gatingcuit para rápido cintilação dos LEDs durante o exame Nota:. Um problema inerente em dois fótons de imagem durante a estimulação visual é vazamento de luz proveniente do sistema de estimulação visual, que pode ser reduzido, protegendo o objetivo. No entanto, a fuga de luz do sistema de estimulação visual pode ser totalmente abolida por sincronizar a saída de luz do projetor para os pontos de rotação do scanner de ressonância (quando os dados não são adquiridos), como é feito com arenas de LED usados para estimulação visual durante o exame em 18 de Drosophila. Isso resulta em uma alternância de alta velocidade efectiva de estimulação visual e de aquisição de dados (ver Figura 2). A frequência de cintilação (24 kHz) é ordens de magnitude acima do limiar de fusão de cintilação, acima do qual a cintilação não é mais percebida pelo animal. O diagrama de circuito electrónico da presente modificação de um projector de LEDs comerciais é mostrado na Figura 3.
- Filhoteil rastreamento
- Use uma câmera de vídeo baseado CMOS (30 fps) para rastreamento de posição da pupila. Certifique-se de que a câmara não contém um filtro de bloqueio de infravermelho Nota:. A pupila é visível em alto contraste durante as gravações, devido à luz difusa do laser de excitação de dois fótons de sair através do olho. Posição da pupila eo diâmetro é extraído em tempo real usando o software programado personalizado baseado no projeto de Sakatani e Isa 19.
2. A injeção de Indicador de cálcio Genética e Janela Implant
A injecção de um indicador de cálcio 20 e o implante da janela craniana 21 são executadas como previamente descrito com as seguintes adições:
- Injectar o vírus na região de interesse, utilizando uma pipeta de injecção de vidro preenchido com uma solução de vírus e ligado a um sistema de injecção sob pressão. Regule a pressão em função da pipeta interna-diâmetro, tipicamente ca. 70-140 mbar, para injectar cerca de 100 nl de uma solução de vírus ao longo de 1-2 min. Pulsos de injeção de baixo volume entregue em baixa frequência (0,05 pulsos seg a 2 Hz) deve ser usado para evitar transbordamento do vírus ao longo da pipeta durante a injeção Nota:. A fim de controlar o volume de injecção, a pipeta pode ser marcada pelo pequeno , comprimentos uniformemente espaçados (por exemplo, 0,5 mm) sob um microscópio estéreo. O deslocamento do menisco entre as marcações podem, então, ser utilizado para estimar o volume injectado.
- Várias semanas após a injecção o que deverá resultar num bolo de células densamente marcados com um diâmetro de aproximadamente 500 um. A eficácia da expressão GECI na região de interesse depende da escolha de GECI e combinação promotor, bem como o título infeccioso e do serotipo do AAV recombinante usado Nota:. Como um exemplo representativo, a injecção de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 com uma teta viraler de 8 x 10 12 GC / ml para o córtex visual primário de um rato provoca a expressão satisfatória em aproximadamente duas semanas após a injecção (Figura 1).
- A barra de cabeça não deve obstruir o campo visual do mouse, mas deve ser rígida o suficiente para permitir a imagem estável durante comportamento. Isso normalmente requer dois pontos de fixação em ambos os lados da barra de cabeça (ver figura 1). Para prender firmemente a barra de cabeça para o crânio, certifique-se de maximizar e secar a área do crânio exposta, onde o bar cabeça será anexado. Além disso, utilizando um bisturi ou uma seringa, riscar o crânio para criar ranhuras superficiais, aumentando assim a área da superfície de colagem. Cubra o osso com adesivo tecidual antes de colocar a barra de cabeça com cimento dental.
3. Procedimento Experimental
- Duas a três semanas após a injeção do vírus, verifique a janela implante craniano para maior clareza e expressão sob epiiluminação de fluorescência. Limites claramente visíveis e bem definidas de vasos sanguíneos superficiais são uma boa indicação de que o implante janela é adequado para a imagem (veja a Figura 1).
- Medir e ajustar a potência do laser para um valor inferior a 50 MW na amostra.
- Ligue o fluxo de ar para a esteira esférica.
- Para a fixação da cabeça sob o microscópio, anestesiar brevemente o animal com isoflurano para reduzir o stress. Colocar o animal em um recipiente anestesia isoflurano e esperar até parar de animais em movimento (aproximadamente 10 segundos). Retire o animal e imediatamente cabeça corrigi-lo sob o microscópio.
- Posicionar o sistema de exibição visual tão próximo quanto possível para que o animal ainda permitir o acesso ao animal. O contacto inferior visuais o animal tem com o experimentador, a menos salientou o animal será durante a fase inicial da experiência.
- Certifique-se a janela de implante craniano é livre de poeira e sujeira. Limpe com águase necessário.
- Aplique o gel de ultra-som claro como o meio de imersão entre a janela craniana e objetiva de imersão em água. Isto resolve problemas de degradação da imagem lenta, devido à evaporação de água ou vazamento e alivia a necessidade de montar um cone na barra de cabeça para reter a água Nota:. Centrífuga o gel antes do uso para remover todas as bolhas de ar, e tomar cuidado para não criar qualquer ar bolhas durante a aplicação do gel. As bolhas de ar podem prejudicar seriamente a qualidade de imagem.
- Enrole um pedaço de fita preta em torno do bar objetiva e cabeça para proteção contra luz.
- Mova a arena ambiente virtual para a sua posição final e ajustar a câmera de vídeo para monitoramento dos alunos.
- Definir o redutor de laser para coincidir com a amplitude de varredura utilizado durante o experimento.
- Iniciar a gravação de dados.
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Representative Results
A qualidade da imagem em dois fotões imagiologia de cálcio de populações de células marcadas com um GECI depende em grande parte a qualidade da janela craniana do implante. Duas semanas após a injeção do vírus da janela craniana devem ser inspecionados para maior clareza. Não deve haver nenhum tecido de granulação ou crescimento do osso visível (Figura 1A). Além disso, o padrão de vasos sanguíneos superficiais deverão permanecer inalterados e limites da vasculatura deve ser bem definida. Ao mesmo tempo, a expressão GECI também pode ser marcada. Boli de células marcadas devem ser claramente visíveis ao microscópio de epifluorescência (Figura 1B).
Idealmente, a preparação é estável o suficiente de modo que as distorções das imagens de dois fótons induzidos pela locomoção do mouse não são visíveis na imagem após o registro do quadro (Figura 2). O caminho de digitalização do scanner de ressonância é sinusoidal, resultando em distorção da imagem não-linear. Durante o tuDados pontos rnaround não são adquiridos devido à imagem que se estende nesta parte do caminho de varredura. Se a fonte de luz do sistema de estimulação visual, aqui os LEDs do projetor, está corretamente programado para os pontos de virada, vazamento de luz deve ser apenas aparente durante este tempo (Figura 2). A freqüência de cintilação da fonte de luz tem que ser o dobro da freqüência de varredura. A chave para fazer este trabalho são a rápida ascensão e queda tempos dos LEDs e eletrônica controladora (Figura 3).
Figura 1. Vista superior de uma janela do crânio em um mouse de cabeça fixa duas semanas após a cirurgia. (A) A barra de cabeça é otimizada de peso e forma para aumentar a estabilidade de comportamento durante experimentos com imagens, enquanto que a redução dos encargos sobre o animal. Tele cabeça barra é feita de alumínio e tem uma espessura de 1 mm. Barra de escala é de 5 mm. Imagem Epifluorescência de expressão GCaMP5 após quatro injeções (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) de aproximadamente 80 nl (B). A profundidade de injeção é de aproximadamente 400 m. Barra de escala é de 1 mm. (C) Esquemas da barra de cabeça. Todas as medidas em mm. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. Melhorar sinal ao ruído, reduzindo luz vazamento. A fonte de luz LED no projetor do ambiente de realidade virtual é sincronizado ao scanner de ressonância para ligar apenas durante os períodos de rotação de varredura quando os dados não são gravados (bo laranjaxes). O redutor de laser foi removido do microscópio para este exemplo para ilustrar o efeito de fuga de luz resultante da estimulação visual. A imagem (média de 8 segundos de dados) foi tomada no córtex visual do rato transfectadas com AAV2/1-EF1α-GCaMP5. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Esquema de circuito da eletrônica usada para piscar um projetor de LED convencional. Gating O circuito é acionado por uma entrada TTL para sincronizar rápido cintilação com o scanner de ressonância. C1: capacitor 1nF; D1, D2: diodos 1N4148; INV1: Inverter HEF40106 (1 de 6 usado); LED1 - LED do projector; R1: resistor 47 Ω; R2: resistor de 2,2 kW; R3: resistor 100 Ω; T1, T5, T6, T7: transistores IF9321; T2: transistor BC846; T3: transistor BC170; T4: transistor BC856. Note-se que este circuito tem de ser repetido para todos os três canais de cores (vermelho, verde, azul) do projetor. Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
A chave para o sucesso do comportamento de imagem de dois fotões é a estabilidade da preparação de duas maneiras:
- No decurso da implantação janela dias pós, as respostas inflamatórias do tecido pode conduzir a uma melhoria da formação de tecido de granulação e cartilagem que vai dificultar, ou mesmo impedir imagiologia.
- Durante o experimento, o cérebro tem que ser suficientemente estável para evitar artefatos de movimento a partir de corromper sinal de fluorescência atividade relacionada neural.
Para manter a resposta imune inflamatória a um mínimo a cirurgia de implante craniano janela deve ser realizado tão rapidamente quanto possível e directamente dano ao cérebro deve ser evitada a todo o custo. De extrema importância para garantir que a janela de implante craniano permanece estanque para toda a duração da experiência para prevenir a inflamação.
Para minimizar o movimento cérebro artefatos de imagem relacionados tomar cuidado para não danificar ouremover a dura-máter, durante a cirurgia. Restante locomoção induzida movimento cérebro pode ser corrigido para quando o movimento está confinada ao plano paralelo ao plano de imagem (x / y avião). O desvio padrão máximo tolerável de movimento em x / y é aproximadamente 5 mm. Para o movimento ao longo do eixo z esse valor é aproximadamente de 1 um, de tal modo que a extensão do movimento for menor que o limite de resolução do microscópio.
A baixa velocidade de scanner de ressonância para os pontos de resposta de percurso de varrimento pode levar a danos no tecido induzida por laser. Para evitar isto, o laser pode ser bloqueado nas recuperações usando um redutor do telescópio de varredura. Se este blanker está configurado corretamente e potência do laser média no âmbito do objectivo é mantida abaixo de 50 mW, a imagem latente é possível por longos períodos de tempo ao longo de vários dias, sem causar qualquer dano a laser visível. Um método alternativo para a obturação mecânica do laser é a utilização de uma célula de Pockels rápido para reduzir a energia laser no turnarouNDS. Este método, contudo, tem a desvantagem de que as células de Pockels tipicamente introduzir distorções indesejáveis de feixe.
A aptidão de roedores cabeça fixa para navegar ambientes virtuais tornou possível para cronicamente populações de imagem de células no córtex de ratos realizando uma ampla gama de tarefas comportamentais 3,4,6,22. No entanto, é interessante notar que a cabeça de fixação inerentemente constrange comportamento e locomoção em uma esteira esférica é, em muitos aspectos não equiparáveis a locomoção desenfreada ou o comportamento normal.
No futuro, a força da abordagem de realidade virtual de imagem descrito aqui provavelmente será a combinação de imagens de cálcio com estimulação optogenetic alvejado durante comportamento. Com isso, seria possível manipular as células pré-sinápticas opticamente e imagem as suas metas pós-sinápticos enquanto monitora as mudanças comportamentais resultantes. Além disso, como indicadores de cálcio se difundem livremente no cell, também será possível medir a atividade seletivamente em compartimentos subcelulares durante comportamento. Devido ao movimento induzido movimento do cérebro, tais gravações têm sido limitados pela dificuldade de obter gravações estáveis.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Friedrich Miescher de Pesquisa Biomédica, a Sociedade Max Planck, e do Programa Científico Fronteiras Humanas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
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