Summary
Aquí se describen los procedimientos experimentales que participan en dos fotones de imágenes de la corteza del ratón durante comportamiento en un entorno de realidad virtual.
Abstract
En los últimos años, dos fotones de imágenes se ha convertido en una herramienta muy valiosa en la neurociencia, ya que permite la medición de crónica de la actividad de las células identificadas genéticamente durante comportamiento 1-6. Aquí se describen los métodos para llevar a cabo de dos fotones en la corteza del ratón mientras el animal se desplaza un entorno de realidad virtual. Nos centramos en los aspectos de los procedimientos experimentales que son clave para obtener imágenes en un animal se comporta en un entorno virtual muy iluminada. Los principales problemas que se presentan en este montaje experimental que aquí la dirección estamos: minimizando los artefactos de movimiento relacionadas con el cerebro, reduciendo al mínimo la fuga de luz del sistema de proyección de realidad virtual, y minimizando el daño tisular inducida por láser. También proporcionamos software muestra para controlar el entorno de realidad virtual y de hacer el seguimiento de los alumnos. Con estos procedimientos y recursos debería ser posible convertir un microscopio de dos fotones convencional para su uso en comportarse ratones.
Introduction
Dos fotones de imágenes de los indicadores de calcio (genéticamente codificados como GCaMP5 7 o R-GECO 8, o colorantes sintéticos como OGB o Fluo4) ha emergido como un poderoso método para medir la actividad neuronal en ratones comportarse 1-6. Se permite la medición simultánea de la actividad de cientos de células en acción cerca de un solo potencial de resolución, de hasta aproximadamente 800 m por debajo de la superficie del cerebro 9,10. Por otra parte, el uso de indicadores de calcio codificados genéticamente (Gecis) la actividad neuronal se puede medir crónicamente 5,11,12, y en tipos de células genéticamente definidas 13. En conjunto, estos métodos proporcionan un grado de resolución temporal y espacial que abre una multitud de nuevas posibilidades en el estudio de la computación neuronal in vivo.
La intervención quirúrgica es necesaria para exponer y etiquetar el cerebro de un ratón para la imagen. Las células se transfectaron usando típicamente un Vir adeno-asociado recombinante nos sistema (AAV) para la entrega GECI y una ventana craneal se implanta en el sitio de la inyección para obtener acceso óptico al cerebro. Un bar de la cabeza se une entonces al cráneo para la fijación de la cabeza bajo el microscopio de dos fotones. El diseño y la implementación de estas medidas es fundamental ya que la mayoría de los problemas con las imágenes despierto surgen de la inestabilidad en la preparación. Idealmente, el procedimiento descrito aquí debe permitir para formación de imágenes crónica de hasta varios meses después de la cirugía.
Para habilitar el comportamiento guiado visualmente durante dos fotones de imágenes, el ratón fijo cabeza se sienta en una cinta de correr esférica aire apoyado, que puede utilizar para navegar por un entorno de realidad virtual. Locomoción del ratón en la cinta se acopla al movimiento en el entorno virtual que se muestra en una pantalla toroidal que rodea el 14,15 ratón. Variables de comportamiento, tales como locomoción, el estímulo visual, y la posición de la pupila se pueden grabar 6.
t "> Se describen los procedimientos involucrados en la crónica de dos fotones en ratones explorando un entorno de realidad virtual Los puntos clave abordados son:. reducción de artefactos de movimiento, la reducción de la fuga de luz, la maximización del número de células grabadas de forma simultánea, y la minimización de el daño por luz. También dio detalles sobre la configuración de la rueda de ardilla hinchable, el seguimiento de los alumnos, y el entorno de realidad virtual. Los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para obtener imágenes de las poblaciones de células marcadas con fluorescencia en ratones fijos en la cabeza en un potencialmente amplia variedad de paradigmas de comportamiento .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fueron aprobadas y realizadas de conformidad con las directrices del Departamento del Cantón de Basilea-Ciudad Veterinario Todos los procedimientos con animales.
1. Hardware y software de instalación
- Dos fotones configuración microscopio de barrido:
- Utilice un láser infrarrojo pulsante como una fuente de iluminación (ancho de pulso <120 fs).
- Utilice una exploración de cabeza compuesto por un escáner de resonancia 8 o 12 kHz y un nivel galvanómetro Nota:. Esto permite velocidades de fotogramas de 40 o 60 Hz a 750 x 400 píxeles. Una alta tasa de cuadros es fundamental para minimizar el movimiento del cerebro distorsión de la imagen inducida. Por otra parte, los resultados de escaneo rápido resonantes en un rendimiento de señal más alta y reduce fotoblanqueo 16 y fototoxicidad.
- Utilice una velocidad alta Z-paso a paso piezoeléctrico secuencialmente tiempo adquirir imágenes intercaladas en múltiples profundidades Nota:. Esto es opcional y se utiliza para aumentar el rendimiento de datos a costa de la velocidad de fotogramas.
- Utilice amsupresor ecánico para reducir la exposición al láser al tejido. Ajuste de la anchura de la supresor dependiendo de la amplitud de la escáner resonante Nota:. Debido a la naturaleza sinusoidal de la trayectoria de exploración de un escáner de resonancia, el haz de láser se mueve comparativamente lenta en los puntos de respuesta de exploración. Para prevenir el daño del tejido en estos puntos de entrega en donde la exposición al láser es más grande, un supresor de mecánica se introduce en el plano focal entre la exploración y lentes de tubo que detiene el haz de láser.
- Para la adquisición de datos utilizar un digitalizador de alta velocidad (800 MHz) en combinación con un arreglo de compuertas programables en campo (FPGA) Nota:. Los filtros de paso alto FPGA y cubos de la señal de PMT en píxeles. La combinación del filtro de paso alto en el FPGA y el filtro de paso bajo eficaz en el resultado amplificador de PMT en un filtro de paso de banda de aproximadamente centrada alrededor de la frecuencia de repetición del láser (80 MHz). Código FPGA ejemplo se proporciona como un suplemento.
- Configuración de la rueda de ardilla hinchable basado en el diseño de Dombeck y colegas 2
- Conectar el soporte de la bola a una línea de suministro de aire usando un tubo de suministro de aire de al menos 10 mm de diámetro interior. Maximizar la sección transversal de la entrada de suministro de aire soporte de bola y colocar amplia cantidad de tubo entre el suministro de aire principal y el soporte de la bola Nota:. Aumento de la sección transversal y el aumento de longitud de la tubería de suministro de aire reduce la generación de ruido.
- Colocar una bola de espuma de poliestireno (20 cm de diámetro) en un soporte de bola de diseño personalizado e impreso-3D.
- Si el paradigma de comportamiento requiere solamente hacia delante (o hacia atrás) la locomoción, restringir el movimiento de la bola para el eje horizontal (pitch) mediante la inserción de un pasador (por ejemplo, una aguja hipodérmica 19 G) en el lado de la bola Nota:. Normalmente los animales se adaptan a la configuración mucho más rápido en este paradigma de rotación reducida.
- Seguir el movimiento de la pelota, usando uno o dos ratones de ordenador ópticopara detectar el movimiento en torno a dos o de los tres ejes, respectivamente Nota:. Los ratones de ordenador idealmente deben operar con un diodo de infrarrojos para la menor interferencia con la imagen.
- Configuración del entorno de realidad virtual
- Prepare el entorno de realidad virtual Nota:. Un entorno de ejemplo basado en Panda3D, un motor de juego de libre acceso, se proporciona como un suplemento. Los objetos del entorno virtual se generan utilizando Wings3D, un modelador 3D de código abierto. El programa de ejemplo lee la información de posición en una tarjeta de adquisición de datos y esto se traduce en movimiento en el entorno virtual. El código también realiza la transformación no lineal necesario para el medio ambiente que se proyecta sobre una pantalla toroidal. La construcción detallada de la pantalla toroidal se ha descrito en otra parte 14,17.
- Utilice proyectores LED o pantallas de ordenador con retroiluminación LED para mostrar el entorno virtual. Integrar una cir gatingCUIT para el parpadeo rápido de los LEDs durante la exploración Nota:. Un problema inherente en dos fotones de imágenes durante la estimulación visual es fuga de luz procedente del sistema de estimulación visual, que puede reducirse mediante el blindaje del objetivo. Sin embargo, la fuga de luz del sistema de estimulación visual puede ser completamente abolida mediante la sincronización de la salida de luz del proyector a los puntos de entrega del escáner de resonancia (cuando los datos no son adquiridos), como se hace con arenas LED utilizados para la estimulación visual durante la exploración en 18 de Drosophila. Esto resulta en una alternancia de alta velocidad efectiva de estimulación visual y adquisición de datos (véase la Figura 2). La frecuencia de parpadeo (24 kHz) es órdenes de magnitud por encima del umbral de fusión de parpadeo, por encima del cual el parpadeo ya no se percibe por el animal. El diagrama del circuito electrónico de esta modificación a un proyector LED comercial se muestra en la Figura 3.
- Cachorroil seguimiento
- Utilice una cámara de vídeo basado en CMOS (30 fps) para el seguimiento de posición de la pupila. Asegúrese de que la cámara no contiene un filtro de bloqueo de infrarrojos Nota:. La pupila es visible en alto contraste durante las grabaciones debido a la luz difusa procedente del láser de excitación de dos fotones que sale a través del ojo. Posición de la pupila y el diámetro se extrae en tiempo real mediante un software personalizado programado basado en el diseño de Sakatani e Isa 19.
2. La inyección de indicador de calcio Genética y Ventana de Implantes
La inyección de un indicador de calcio 20 y la implantación de la ventana craneal 21 se realizó como se describió anteriormente con las siguientes adiciones:
- Inyectar el virus en la región de interés usando una pipeta de inyección de vidrio se rellenó con solución de virus y conectado a un sistema de inyección a presión. Ajustar la presión en función de la pipeta interna-de diámetro, típicamente aprox. 70-140 mbar, para inyectar aproximadamente 100 nl de solución de virus en el transcurso de 1-2 min. Pulsos de inyección de bajo volumen entregado a baja frecuencia (0,05 pulsos segundos a 2 Hz) deben ser utilizados con el fin de evitar el desbordamiento del virus a lo largo de la pipeta durante la inyección Nota:. Con el fin de controlar el volumen de inyección, la pipeta puede estar marcado en pequeña , longitudes iguales de tiempo (por ejemplo, 0,5 mm) bajo un microscopio estereoscópico. El desplazamiento del menisco entre las marcas puede ser utilizado para estimar el volumen inyectado.
- Varias semanas después de la inyección de esto debería resultar en un bolo de células densamente marcados con un diámetro de aproximadamente 500 micras. La eficacia de expresión GECI en la región de interés depende de la elección de la combinación promotor GECI y, así como el título infeccioso y el serotipo de AAV recombinante utilizado Nota:. Como un ejemplo representativo, la inyección de AAV2/1-EF1α-GCaMP5 con una teta viraler de 8 x 10 12 GC / ml en la corteza visual primaria de un ratón produce la expresión satisfactoria en aproximadamente dos semanas después de la inyección (Figura 1).
- La barra de la cabeza no debe obstruir el campo visual del ratón, pero debe ser lo suficientemente rígido para permitir la formación de imagen estable durante comportamiento. Esto normalmente requiere dos puntos de unión en ambos lados de la barra de la cabeza (ver Figura 1). Para sujetar firmemente la barra de la cabeza en el cráneo, asegúrese de maximizar y seque el área del cráneo expuesta donde se colocará la barra de cabeza. Además, el uso de un bisturí o una jeringa, rayar el cráneo para crear ranuras superficiales, aumentando así el área de superficie para el encolado. Cubrir el hueso con tejido adhesivo cianoacrilato antes de colocar la barra de la cabeza con cemento dental.
3. Procedimiento experimental
- Dos o tres semanas después de la inyección de virus, compruebe la ventana implante craneal para la claridad y la expresión bajo epiiluminación de fluorescencia. Límites claramente visibles y claramente definidas de los vasos sanguíneos superficiales son una buena indicación de que el implante ventana es adecuado para la formación de imágenes (véase la Figura 1).
- Medir y ajustar la potencia del láser a un valor por debajo de 50 mW a la muestra.
- Encienda el flujo de aire a la rueda de ardilla esférica.
- Para fijar la cabeza bajo el microscopio, anestesiar brevemente el animal con isoflurano para reducir el estrés. Colocar el animal en un recipiente de anestesia con isoflurano y esperar hasta que las paradas de animales en movimiento (aproximadamente 10 segundos). Retire el animal e inmediatamente la cabeza fijarlo en el microscopio.
- Coloque el sistema de presentación visual lo más cerca posible al animal a todavía permitir el acceso al animal. El contacto visual a menos que el animal tiene con el experimentador, menos estresado el animal será durante la fase inicial del experimento.
- Asegúrese de que la ventana de implante craneal está libre de polvo y suciedad. Limpie con aguasi es necesario.
- Aplicar gel de ultrasonido claro como medio de inmersión entre la ventana craneal y objetivo de inmersión en agua. Esto resuelve los problemas de degradación de la imagen lento debido a la evaporación de agua o fugas y elimina la necesidad de montar un cono en la barra de la cabeza para contener el agua Nota:. Centrífuga el gel antes de su uso para eliminar todas las burbujas de aire, y tener cuidado de no crear ningún aire burbujas durante la aplicación del gel. Las burbujas de aire pueden afectar seriamente la calidad de imagen.
- Envuelva un pedazo de cinta negro alrededor de la barra de objetivo y la cabeza de protección de la luz.
- Mueva el entorno de arena virtual a su posición final y ajustar la cámara de vídeo para el seguimiento de los alumnos.
- Ajuste el supresor de láser para que coincida con la amplitud de exploración utilizado durante el experimento.
- Inicie la grabación de datos.
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Representative Results
La calidad de imagen en imágenes de calcio de dos fotones de las poblaciones de células marcadas con un GECI depende en gran medida de la calidad de la ventana de implante craneal. Dos semanas después de la inyección del virus de la ventana del cráneo deben ser inspeccionados para mayor claridad. No debe haber ningún tejido de granulación o recrecimiento del hueso visible (Figura 1A). Por otra parte, el patrón de los vasos sanguíneos superficiales debe permanecer sin cambios y los límites de la vasculatura debe ser claramente definido. Al mismo tiempo, la expresión GECI también se puede comprobar. Boli de células marcadas deben ser claramente visibles bajo un microscopio de epifluorescencia (Figura 1B).
Idealmente, la preparación es suficiente de tal manera que las distorsiones de las imágenes de dos fotones inducidos por la locomoción del ratón no son visibles en la imagen después de Registrarse marco (Figura 2) estable. La trayectoria de exploración del escáner de resonancia es sinusoidal que resulta en distorsión de la imagen no lineal. Durante la mapuntos de datos rnaround no se adquieren debido a la imagen que se extiende en esta parte de la trayectoria de exploración. Si la fuente de luz del sistema de estimulación visual, en este caso los indicadores LED del proyector, se mide el tiempo correctamente a los puntos de entrega, fuga de luz sólo debe ser evidente durante este tiempo (Figura 2). La frecuencia de parpadeo de la fuente de luz tiene que ser el doble de la frecuencia de barrido. La clave para hacer este trabajo son el aumento rápido y tiempos de los LEDs y el control de la electrónica (Figura 3) caen.
Figura 1. Vista superior de una ventana craneal en una cabeza fija del ratón dos semanas después de la cirugía. (A) La barra de cabeza se optimiza en peso y la forma para aumentar la estabilidad de comportamiento durante los experimentos de imagen, mientras que la reducción de carga para el animal. Tse dirigen bar está hecho de aluminio y tiene un espesor de 1 mm. La barra de escala es de 5 mm. Imagen de epifluorescencia de expresión GCaMP5 después de cuatro inyecciones (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) de aproximadamente 80 nl (B). La profundidad de la inyección es de aproximadamente 400 micras. La barra de escala es de 1 mm. (C) Esquemas de la barra de la cabeza. Todas las medidas en mm. Haz click aquí para ver la imagen más grande.
Figura 2. Mejorar la relación señal a ruido mediante la reducción de fugas de luz. La fuente de luz LED en el proyector del entorno de realidad virtual se sincroniza con el escáner de resonancia para activar sólo durante los períodos de entrega de escaneo cuando no se registran datos (bo naranjaequis). El supresor de láser fue retirado del microscopio para este ejemplo para ilustrar el efecto de la fuga de luz causada por la estimulación visual. La imagen (promedio de 8 seg de datos) fue tomada en la corteza visual del ratón transfectadas con AAV2/1-EF1α-GCaMP5. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
Figura 3. Diagrama de circuito de la electrónica utilizada para parpadear un LED proyector convencional. El circuito de puerta es accionado por una entrada de TTL para sincronizar el parpadeo rápido con el escáner resonante. C1: capacitor 1nF; D1, D2: diodos 1N4148; INV1: Inversor HEF40106 (1 de 6 utiliza); LED1 - LED del proyector; R1: resistencia de 47 Ω; R2: resistencia de 2,2 kW; R3: resistor 100 Ω; T1, T5, T6, T7: transistores IF9321; T2: Transistor BC846; T3: transistores FC170; T4: BC856 transistor. Tenga en cuenta que este circuito tiene que ser repetido en los tres canales de color (rojo, verde, azul) del proyector. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
La clave para el éxito de comportamiento de formación de imágenes de dos fotones es la estabilidad de la preparación de dos maneras:
- En el transcurso de la implantación ventana días post, respuestas inflamatorias del tejido pueden conducir a la mejora de la formación de tejido de granulación y el cartílago que dificultar o incluso impedir formación de imágenes.
- Durante el experimento, el cerebro tiene que ser lo suficientemente estable para evitar los artefactos de movimiento corrompa la señal de fluorescencia actividad relacionada neural.
Para mantener la respuesta inmune inflamatoria al mínimo la cirugía de implantación ventana del cráneo debe llevarse a cabo lo más rápidamente posible y en directo el daño al cerebro que debe evitarse a toda costa. De suma importancia es para asegurar que la ventana implante craneal permanece hermética para toda la duración del experimento para evitar la inflamación.
Para reducir al mínimo el movimiento del cerebro artefactos de imágenes relacionadas con cuidar de no dañar oeliminar la duramadre durante la cirugía. Restante de la locomoción inducida por el movimiento del cerebro se puede corregir para cuando el movimiento se limita al plano paralelo al plano de la imagen (el plano X / Y). La desviación estándar máxima tolerable de movimiento en x / y es aproximadamente 5 micras. Para el movimiento a lo largo del eje z de este valor es aproximadamente 1 m, de tal manera que la medida del movimiento es menor que el límite de resolución del microscopio.
La baja velocidad del escáner de resonancia en los puntos de ruta de entrega de exploración puede conducir a daño tisular inducida por láser. Para evitar esto, el láser puede ser bloqueada en los plazos de entrega utilizando un supresor en el telescopio de exploración. Si este supresor esté ajustado correctamente y la potencia media del láser en el marco del objetivo se mantiene por debajo de 50 mW, formación de imágenes es posible durante largos períodos de tiempo más de varios días sin causar ningún daño láser visible. Un método alternativo para una supresión mecánica del láser es el uso de una célula Pockels rápido para reducir la potencia del láser en el turnarouNDS. Este método sin embargo tiene la desventaja de que Pockels células típicamente introducen distorsiones indeseables de haz.
La aptitud de los roedores de cabeza fija para navegar entornos virtuales ha permitido a las poblaciones crónicamente de imagen de las células en la corteza de los ratones que realizan una amplia gama de tareas conductuales 3,4,6,22. Sin embargo, vale la pena señalar que la cabeza de fijación limita intrínsecamente el comportamiento y la locomoción en una caminadora esférica es de muchas formas no asimilables a la locomoción sin restricciones o comportamiento normal.
En el futuro, la fuerza del enfoque de formación de imágenes de realidad virtual descrito aquí será probablemente la combinación de imágenes de calcio con la estimulación optogenético específica durante comportamiento. Con esto, sería posible manipular ópticamente células presinápticas y la imagen de sus metas post-sinápticos, mientras que el seguimiento de los cambios de comportamiento resultantes. Además, como indicadores de calcio se difunden libremente en el CELL, también será posible medir la actividad selectiva en compartimentos subcelulares durante comportamiento. Debido al movimiento inducido por el movimiento del cerebro, tales grabaciones se han visto limitados por la dificultad de obtener grabaciones estables.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Friedrich Miescher para la Investigación Biomédica, la Sociedad Max Planck y el Programa Científico Fronteras Humanos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
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