Summary
Qui si descrivono le procedure sperimentali coinvolti in due fotoni di imaging di topo corteccia durante il comportamento in un ambiente di realtà virtuale.
Abstract
Negli ultimi anni, l'imaging a due fotoni è diventato uno strumento prezioso in neuroscienze, in quanto consente di misurazione cronica della attività delle cellule geneticamente identificati durante comportamento 1-6. Qui si descrivono metodi per eseguire due fotoni di imaging in topo corteccia mentre l'animale si sposta un ambiente di realtà virtuale. Ci concentriamo sugli aspetti delle procedure sperimentali che sono fondamentali per l'imaging in un animale si comporta in un ambiente virtuale illuminata. I problemi principali che sorgono in questa configurazione sperimentale che noi qui l'indirizzo sono: ridurre al minimo gli artefatti da movimento legati al cervello, riducendo al minimo perdite luce dal sistema di realtà virtuale di proiezione, e minimizzando laser indotto danni ai tessuti. Forniamo anche software di esempio per controllare l'ambiente di realtà virtuale e di fare il monitoraggio allievo. Con queste procedure e risorse dovrebbe essere possibile convertire un microscopio a due fotoni convenzionale per uso nel comportarsi topi.
Introduction
Due fotoni di imaging di indicatori di calcio (geneticamente codificate come GCaMP5 7 o R-GECO 8, o coloranti sintetici come OGB o Fluo4) è emersa come un potente metodo di misurazione dell'attività neuronale nel comportarsi topi 1-6. Esso consente la misurazione simultanea dell'attività di centinaia di cellule a potenziale risoluzione azione quasi unico, fino a circa 800 micron sotto la superficie del cervello 9,10. Inoltre, utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati (GECIS) attività neuronale può essere misurata cronicamente 5,11,12, e in tipi di cellule geneticamente definiti 13. Insieme, questi metodi forniscono un grado di risoluzione temporale e spaziale che aprono una moltitudine di nuove possibilità nello studio della computazione neuronale in vivo.
È necessario un intervento chirurgico per esporre ed etichettare il cervello del mouse per l'imaging. Le cellule trasfettate sono tipicamente utilizzando un vir adeno-associato ricombinante siamo Sistema (AAV) per la consegna GECI e una finestra cranica è impiantato sul sito di iniezione per ottenere l'accesso ottico al cervello. Una barra di testa è poi collegato al cranio per il fissaggio testa sotto il microscopio a due fotoni. La progettazione e l'attuazione di questi passaggi è fondamentale come la maggior parte dei problemi con l'imaging sveglio derivano da instabilità nella preparazione. Idealmente la procedura qui descritta dovrebbe consentire per l'imaging cronica fino a diversi mesi dopo l'intervento.
Per abilitare il comportamento guidato visivamente durante l'imaging a due fotoni, il mouse fisso testa si siede su un gonfiabile tapis roulant sferica, che si può utilizzare per navigare in un ambiente di realtà virtuale. Locomozione del mouse sul tapis roulant è accoppiato al movimento in un ambiente virtuale che viene visualizzata su uno schermo toroidale che circonda il 14,15 mouse. Variabili comportamentali come la locomozione, stimoli visivi, e la posizione della pupilla possono essere registrate 6.
t "> Descriviamo le procedure necessarie cronica due fotoni di imaging in topi esplorare un ambiente di realtà virtuale I punti fondamentali affrontate sono:. riduzione di artefatti di movimento, riduzione della perdita di luce, massimizzazione del numero di cellule registrate simultaneamente, e ridurre al minimo danni photo. Abbiamo anche fornito dettagli sulla configurazione del tapis roulant aria-di sostegno, il monitoraggio allievo, e l'ambiente di realtà virtuale. Le procedure qui descritte possono essere utilizzate per l'imaging popolazioni di cellule fluorescente nei topi fissati alla testa in una potenzialmente vasta gamma di paradigmi comportamentali .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sugli animali sono state approvate ed eseguite in conformità alle direttive del Dipartimento veterinario del Cantone di Basilea-Città.
1. Configurazione hardware e software
- Due fotoni configurazione microscopio a scansione:
- Utilizzare un laser infrarosso ad impulsi come fonte di illuminazione (larghezza di impulso <120 fsec).
- Utilizzare una testa di scansione composta da uno scanner di risonanza 8 o 12 kHz e un livello galvanometro. Nota: questo permette un frame rate di 40 o 60 Hz a 750 x 400 pixel. Un frame rate elevato è fondamentale per ridurre al minimo il movimento del cervello distorsione dell'immagine indotta. Inoltre, i risultati di scansione veloce di risonanza in un rendimento superiore del segnale e riduce photobleaching 16 e fototossicità.
- Utilizzare una velocità elevata z-stepper piezo-elettrico in sequenza le immagini intercalati tempo acquisiscono a più profondità. Nota: Questo è opzionale e utilizzato per aumentare la resa dei dati a scapito del frame rate.
- Utilizzare amblanker eccanico per ridurre l'esposizione laser al tessuto. Regolare la larghezza della blanker funzione dell'ampiezza dello scanner risonante Nota:. Causa della natura sinusoidale del percorso di scansione di uno scanner di risonanza, il raggio laser si muove invece lento nei punti di consegna di scansione. Per evitare danni del tessuto in questi punti di consegna in cui l'esposizione laser è maggiore, un blanker meccanico viene introdotto nel piano focale tra la scansione e lenti tubo che interrompe il fascio laser.
- Per l'acquisizione dei dati utilizzare un digitalizzatore ad alta velocità (800 MHz) in combinazione con una matrice di field-programmable gate (FPGA). Nota: I filtri passa-alto FPGA e cestini il segnale PMT in pixel. La combinazione del filtro passa-alto sul FPGA e il filtro passa-basso effetto il risultato amplificatore PMT in un filtro passa-banda centrato approssimativamente intorno alla frequenza di ripetizione del laser (80 MHz). Esempio di codice FPGA viene fornito come supplemento.
- Impostazione tapis roulant Air supportato basato sul disegno di Dombeck e colleghi 2
- Collegare il titolare palla per una linea di alimentazione dell'aria utilizzando un tubo di alimentazione di aria di almeno 10 mm di diametro interno. Massimizzare la sezione del bocchettone di rifornimento dell'aria portapalline e posizionare ampie quantità di tubazione tra l'alimentazione dell'aria principale e la porta pallina Nota:. Aumento sezione trasversale e una maggiore lunghezza del tubo di alimentazione dell'aria riduce la generazione di rumore.
- Mettere una pallina di polistirolo espanso (diametro 20 cm) in un supporto palla custom-designed e 3D-stampati.
- Se il paradigma comportamentale richiede solo avanti (e indietro) locomozione, limitare il movimento della sfera e la (pitch) asse orizzontale inserendo un perno (ad esempio un ago ipodermico G 19) sul lato della palla Nota:. Tipicamente animali si adattano alle l'installazione molto più veloce in questo paradigma di rotazione ridotta.
- Traccia movimento della palla con una o due mouse per computer otticiper rilevare il movimento intorno a due o tutti e tre gli assi, rispettivamente. Nota: I mouse per computer dovrebbe idealmente operare con un diodo ad infrarossi per almeno interferenze con il imaging.
- Impostazione ambiente di realtà virtuale
- Preparare l'ambiente di realtà virtuale. Nota: Un ambiente campione basato su Panda3D, un motore di gioco liberamente disponibile, è fornito come supplemento. Gli oggetti dell'ambiente virtuale vengono generati utilizzando Wings3D, un modellatore 3D open source. Il programma di esempio legge le informazioni di posizione su una scheda di acquisizione dati e questo si traduce in movimento in un ambiente virtuale. Il codice esegue la trasformazione non lineare necessaria per l'ambiente da proiettare su uno schermo toroidale. La costruzione dettagliata della schermata toroidale è stato descritto altrove 14,17.
- Utilizzare proiettori LED o schermi di computer retroilluminati a LED per la visualizzazione di un ambiente virtuale. Integrare un circuito gatingCUIT per un veloce sfarfallio dei LED durante l'imaging. Nota: Un problema inerente a due fotoni di imaging durante la stimolazione visiva è perdita di luce proveniente dal sistema di stimolazione visiva, che può essere ridotto schermando l'obiettivo. Tuttavia, leggera perdita dal sistema di stimolazione visiva può essere completamente abolita sincronizzando l'emissione di luce del proiettore ai punti di consegna dello scanner di risonanza (quando i dati non vengono acquisiti), come si fa con arene LED utilizzati per la stimolazione visiva durante l'imaging in Drosophila 18. Ciò si traduce in un efficace alternanza alta velocità di stimolazione visiva e acquisizione dati (vedere la Figura 2). La frequenza di sfarfallio (24 kHz) è ordini di grandezza superiori alla soglia sfarfallio di fusione, dal quale sfarfallio non è più percepito dall'animale. Lo schema del circuito elettronico di questa modifica a un proiettore commerciale LED è mostrato in Figura 3.
- Cuccioloil monitoraggio
- Utilizzare una videocamera basata CMOS (30 fps) per il rilevamento di posizione della pupilla. Assicurarsi che la fotocamera non contiene un filtro di blocco infrarossi. Nota: L'allievo è visibile ad alto contrasto durante le registrazioni a causa della luce diffusa dal laser di eccitazione a due fotoni in uscita attraverso l'occhio. Posizione della pupilla e diametro viene estratto in tempo reale utilizzando software programmato personalizzato basato sul disegno di Sakatani e Isa 19.
2. Iniezione di calcio genetica Indicator e la finestra Implant
L'iniezione di un indicatore di calcio 20 e l'impianto della finestra cranica 21 vengono eseguiti come precedentemente descritto con le seguenti aggiunte:
- Iniettare il virus nella regione di interesse utilizzando una pipetta di iniezione vetro ripiena con soluzione virus e collegato ad un sistema di iniezione a pressione. Regolare la pressione in funzione della pipetta interna-diametro, tipicamente ca. 70-140 mbar, per iniettare circa 100 nl di soluzione virus nel corso di 1-2 min. Impulsi di iniezione basso volume erogato a bassa frequenza (0,05 sec impulsi a 2 Hz) dovrebbero essere utilizzati al fine di evitare overflow del virus lungo la pipetta durante l'iniezione. Nota: Al fine di controllare il volume di iniezione, la pipetta può essere marcato in piccola , lunghezze equidistanti (ad esempio 0,5 millimetri) sotto un microscopio stereo. Spostamento del menisco tra le marcature può quindi essere utilizzato per stimare il volume iniettato.
- Diversi iniezione settimane dopo ciò dovrebbe comportare un bolo di cellule densamente marcate con un diametro di circa 500 micron. Efficacia di espressione GECI nella regione di interesse dipende dalla scelta di GECI e combinazione promotore, così come il titolo infettivo e sierotipo di AAV ricombinante usato Nota:. Come esempio rappresentativo, iniezione di AAV2/1-EF1α-GCaMP5 con una tetta viraleer di 8 x 10 12 GC / ml nella corteccia visiva primaria del mouse comporta espressioni soddisfacente a circa due settimane dopo l'iniezione (Figura 1).
- La barra testa non deve ostacolare il campo visivo del mouse, ma deve essere sufficientemente rigido per consentire l'imaging stabile durante il comportamento. Ciò richiede in genere due punti di attacco su entrambi i lati della barra di testa (vedi figura 1). Per fissare saldamente la barra testa al cranio, assicurarsi di massimizzare e asciugare la zona del cranio esposto in cui sarà allegata la barra testa. Inoltre, utilizzando un bisturi o una siringa, graffiare il cranio per creare scanalature superficiali aumentando così la superficie di incollaggio. Coprire l'osso con tessuto adesivo cianoacrilato prima di fissare la barra testa con cemento dentale.
3. Procedura sperimentale
- Due o tre settimane dopo l'iniezione del virus, controllare la finestra di impianto craniale per chiarezza e di espressione in epiilluminazione a fluorescenza. Confini chiaramente visibili e ben definiti dei vasi sanguigni superficiali sono una buona indicazione che l'impianto finestra è adatto per l'imaging (vedere Figura 1).
- Misurare e regolare la potenza del laser ad un valore inferiore a 50 mW a campione.
- Accendere il flusso d'aria per il tapis roulant sferica.
- Per il fissaggio testa sotto il microscopio, brevemente anestetizzare l'animale con isoflurano per ridurre lo stress. Posto l'animale in un contenitore anestesia isoflurano e attendere che le fermate degli animali in movimento (circa 10 sec). Rimuovere l'animale e subito la testa fissarlo sotto il microscopio.
- Posizionare il sistema di visualizzazione più vicino possibile all'animale per consentire ancora per l'accesso agli animali. Il contatto visivo meno l'animale ha con lo sperimentatore, il meno stressato l'animale sarà durante la fase iniziale dell'esperimento.
- Assicurarsi che la finestra di protesi cranica è libero di polvere e sporcizia. Pulire con acquase necessario.
- Applicare il gel trasparente ultrasuoni come mezzo di immersione tra la finestra cranica e l'obiettivo di acqua-immersion. Questo risolve i problemi di lenta degradazione dell'immagine dovuta all'evaporazione di acqua o perdite e riduce la necessità di montare un cono sulla barra testa di trattenere l'acqua. Nota: Centrifugare il gel prima dell'uso per rimuovere tutte le bolle d'aria, e fare attenzione a non creare l'aria bolle durante l'applicazione del gel. Le bolle d'aria possono ridurre notevolmente la qualità dell'immagine.
- Avvolgere un pezzo di nastro adesivo nero attorno al bar oggettiva e la testa per la schermatura della luce.
- Spostare l'arena ambiente virtuale nella sua posizione definitiva e regolare la telecamera per il monitoraggio degli alunni.
- Impostare la blanker laser per abbinare l'ampiezza di scansione utilizzata durante l'esperimento.
- Avviare la registrazione dei dati.
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Representative Results
La qualità dell'immagine in due fotoni Imaging di calcio di popolazioni di cellule marcate con un GECI dipende in gran parte la qualità della finestra protesi cranica. Due settimane dopo l'iniezione del virus della finestra del cranio devono essere ispezionati per chiarezza. Non ci dovrebbe essere tessuto di granulazione o ricrescita ossea visibile (Figura 1A). Inoltre, il modello dei vasi sanguigni superficiali rimanga invariato e confini del sistema vascolare deve essere nettamente definito. Allo stesso tempo, espressione GECI può anche essere controllato. Boli di cellule marcate devono essere chiaramente visibili sotto un microscopio a epifluorescenza (Figura 1B).
Idealmente la preparazione è sufficiente tale che le distorsioni delle immagini a due fotoni indotti dalla locomozione del mouse non sono visibili nell'immagine after registration telaio (Figura 2) stabile. Il percorso di scansione dello scanner risonante è sinusoidale con conseguente distorsione dell'immagine non lineare. Durante il tupunti di dati rnaround non sono acquisiti a causa immagine Allungamento in questa parte del percorso di scansione. Se la sorgente luminosa del sistema di stimolazione visiva, qui i LED del proiettore, è temporizzata correttamente ai punti di consegna, perdita di luce dovrebbe essere evidente solo durante questo tempo (Figura 2). La frequenza sfarfallio della sorgente luminosa deve essere il doppio della frequenza di scansione. Chiave per fare questo lavoro sono la rapida ascesa e tempi dei LED e l'elettronica di controllo (Figura 3) caduta.
Figura 1. Vista dall'alto di una finestra cranica in una testa fissa topo due settimane dopo l'intervento chirurgico. (A) La barra testa è ottimizzato in peso e forma per aumentare la stabilità del comportamento durante gli esperimenti di imaging, riducendo onere per l'animale. Tegli testa barra è in alluminio e ha uno spessore di 1 mm. Barra della scala è di 5 mm. (B) Epifluorescenza immagine di espressione GCaMP5 dopo quattro iniezioni (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) di circa 80 nl. La profondità di iniezione è di circa 400 micron. Barra della scala è di 1 mm. (C) Schema della barra testa. Tutte le misure in mm. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Migliorare segnale-rumore riducendo perdita di luce. La sorgente luminosa a LED nel proiettore della realtà virtuale è sincronizzato allo scanner di risonanza per accendere solo durante i periodi di consegna scansione quando i dati non sono registrati (bo arancioneXES). Il soppressore laser è stato rimosso dal microscopio per questo esempio per illustrare l'effetto di perdita di luce risultante dalla stimolazione visiva. L'immagine (media di 8 sec di dati) è stata scattata nel topo corteccia visiva transfettate con AAV2/1-EF1α-GCaMP5. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Schema dell'elettronica utilizzata per sfarfallare un proiettore convenzionale LED. Il circuito gating è guidato da un ingresso TTL per sincronizzare sfarfallio veloce con lo scanner risonante. C1: condensatore 1nF, D1, D2: diodi 1N4148; INV1: Inverter HEF40106 (1 di 6 utilizzati); LED1 - LED del proiettore; R1: resistenza da 47 Ω, R2: resistenza da 2,2 kΩ; R3: restenza 100 Ω, T1, T5, T6, T7: transistor IF9321; T2: transistor BC846; T3: transistor BC170; T4: transistor BC856. Si noti che questo circuito deve essere ripetuto per tutti e tre i canali di colore (rosso, verde, blu) del proiettore. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
La chiave del successo di comportamentale due fotoni di imaging è la stabilità della preparazione in due modi:
- Nel corso della finestra giorni dopo l'impianto, risposte infiammatorie del tessuto possono portare al miglioramento della formazione di tessuto di granulazione e la cartilagine che ostacolare o addirittura impedire imaging.
- Durante l'esperimento il cervello deve essere abbastanza stabile per evitare artefatti da movimento di danneggiare segnale di fluorescenza attività relativa neurale.
Per mantenere la risposta immunitaria infiammatoria al minimo l'intervento finestra cranica impianto deve essere effettuata il più rapidamente possibile e diretto danni al cervello dovrebbe essere assolutamente evitata. Di fondamentale importanza è la garanzia che la finestra di impianto cranica rimane chiuso ermeticamente per tutta la durata dell'esperimento per prevenire l'infiammazione.
Per ridurre al minimo il movimento del cervello manufatti immagini relative prendono cura di non danneggiare orimuovere la dura madre durante l'intervento. Restante locomozione movimento cervello indotta può essere corretta per quando il movimento è limitato al piano parallelo al piano dell'immagine (il piano X / Y). La deviazione standard massimo tollerabile di movimento in x / y è di circa 5 micron. Per il movimento lungo l'asse z questo valore è di circa 1 micron, tale che l'ampiezza del movimento è inferiore al limite di risoluzione del microscopio.
La bassa velocità dello scanner risonante nei punti di percorso di consegna di scansione può portare a laser indotta danno tissutale. Per evitare ciò, il laser può essere bloccata in risanamenti utilizzando un blanker nel telescopio scansione. Se questo blanker è impostata correttamente e potenza media del laser nell'ambito dell'obiettivo è mantenuto inferiore a 50 MW, l'imaging è possibile per lunghi periodi di tempo in più giorni, senza causare alcun danno laser visibili. Un metodo alternativo per un tranciatura meccanica del laser è quello di utilizzare una cella veloce Pockels per ridurre la potenza del laser al turnarounds. Questo metodo presenta però lo svantaggio che Pockels cellule tipicamente introducono distorsioni fascio indesiderabili.
L'attitudine di testa fissa roditori per navigare ambienti virtuali ha reso possibile cronicamente popolazioni di immagini di cellule nella corteccia di topi che svolgono un'ampia gamma di compiti comportamentali 3,4,6,22. Tuttavia, vale la pena di notare che la testa di fissazione vincola intrinsecamente comportamento e locomozione su un tapis roulant sferico è in molti modi, non equivalenti a locomozione sfrenato o un comportamento normale.
In futuro, la forza dell'approccio realtà immagini virtuali qui descritto sarà probabilmente la combinazione di calcium imaging con stimolazione optogenetic mirato durante il comportamento. Con questo sarebbe possibile manipolare otticamente cellule presinaptiche e immagine loro obiettivi post-sinaptici durante il monitoraggio dei cambiamenti comportamentali derivano. Inoltre, come indicatori calcio diffondono liberamente nel cell, sarà anche possibile misurare l'attività selettivamente in compartimenti subcellulari durante il comportamento. A causa di movimento indotto movimento cervello, tali registrazioni sono state limitate dalla difficoltà di ottenere registrazioni stabili.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, la Max Planck Society, e la Scienza del programma Human Frontiers.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
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