Summary
Her beskriver vi de eksperimentelle prosedyrer involvert i to-foton avbildning av mus cortex under atferd i en virtuell virkelighet miljø.
Abstract
I de senere årene, har to-foton bildebehandling blitt et uvurderlig verktøy i nevrovitenskap, som gjør det mulig for kronisk måling av aktiviteten til genetisk identifiserte celler under atferd 1-6. Her beskriver vi metoder for å utføre to-foton bildebehandling i mus cortex mens dyret navigerer en virtuell virkelighet miljø. Vi fokuserer på de aspektene av de eksperimentelle prosedyrer som er nøkkelen til bildebehandling i en oppfører dyret i en sterkt opplyst virtuelt miljø. De viktigste problemene som oppstår i denne eksperimentelle oppsett som vi her adresse er: minimere hjernebevegelsesrelaterte gjenstander, minimere lys lekkasje fra den virtuelle virkeligheten projeksjonssystem, og minimere laser indusert vevsskade. Vi tilbyr også prøve programvare for å styre den virtuelle virkeligheten miljøet og å gjøre elev sporing. Med disse fremgangsmåter og ressurser bør det være mulig å konvertere en konvensjonell to-foton mikroskop for bruk i oppfører mus.
Introduction
To-foton avbildning av kalsium indikatorer (genetisk kodet som GCaMP5 7 eller R-GECO 8, eller syntetiske fargestoffer som OGB eller Fluo4) har dukket opp som en kraftig metode for å måle nerveaktiviteten i oppfører mus 1-6. Det muliggjør den samtidige måling av aktiviteten til flere hundre celler ved nær-enkeltaksjonspotensial-oppløsning, opp til om lag 800 mikrometer under hjernen overflaten 9,10. Dessuten, ved hjelp av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) neuronal aktivitet kan måles kronisk 5,11,12, og genetisk definerte celletyper 13.. Sammen utgjør disse metoder gir en grad av tidsmessig og romlig oppløsning som kan åpnes opp en rekke nye muligheter i studiet av neuronal beregning in vivo.
Kirurgiske inngrep er nødvendig for å avdekke og merke musen hjernen for bildebehandling. Cellene er vanligvis tilført ved hjelp av en rekombinant adeno-assosiert vir oss (AAV) system for Geci levering og et kranie vindu er implantert over injeksjonsstedet for å få optisk tilgang til hjernen. Et hode linje er da festet til skallen for hodefikseringen i henhold til to-foton mikroskop. Utformingen og gjennomføringen av disse trinnene er avgjørende som de fleste av problemene med våken bildebehandling oppstå ustabilitet i utarbeidelsen. Ideelt sett den fremgangsmåte som er beskrevet her bør tillate kronisk avbildning av inntil flere måneder etter operasjonen.
Slik aktiverer visuelt guidet oppførsel under to-foton bildebehandling, sitter hodet fast mus på en luft støttet sfærisk tredemølle, som den kan bruke til å navigere en virtuell virkelighet miljø. Locomotion av musen på tredemølle er koblet til bevegelse i det virtuelle miljøet som vises på en toroidal skjermen rundt muse 14,15. Behavioral variabler som bevegelse, visuell stimulans, og elev posisjon kan registreres seks.
t "> Vi beskriver prosedyrene involvert i kronisk to-foton bildebehandling i mus utforske en virtuell virkelighet miljø De viktigste punktene som tas opp er:. reduksjon av bevegelse gjenstander, reduksjon av lys lekkasje, maksimering av antall samtidig registrert celler, og minimering av bilde skade. Vi gir også informasjon om hvordan du setter opp den luft støttet tredemølle, elev sporing, og den virtuelle virkeligheten miljø. Prosedyrene som beskrives her kan brukes for å avbilde fluorescensmerkede cellepopulasjoner i hodet faste mus i et potensielt bredt spekter av atferds paradigmer .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble godkjent og gjennomført i samsvar med retningslinjene fra Veterinæravdelingen i Canton Basel-Stadt.
En. Hardware og Software Setup
- To-foton scanning mikroskop oppsett:
- Bruk en pulset infrarød laser som en belysningskilde (puls bredde <120 fsec).
- Bruk en skanning hode består av en 8 eller 12 kHz resonant skanner og en standard galvano. Merk: Dette gjør at bildefrekvens på 40 eller 60 Hz på 750 x 400 piksler. En høy bildefrekvens er kritisk for å minimere hjerne motion indusert bildeforvrengning. Videre rask resonans skanning resulterer i en høyere signal avkastning og reduserer fotobleking 16 og fototoksisitet.
- Bruk en Piezo-elektrisk høyhastighets z-stepper å sekvensielt hente tiden interfolierte bilder på flere dybder. Merk: Dette er valgfritt, og brukes til å øke data avkastning på bekostning av bildefrekvens.
- Bruk amechanical blanker å redusere lasereksponering til vevet. Juster bredden av blanker, avhengig av amplituden av den resonans scanner. Merk: På grunn av den sinusformede natur av skannebanen fra et resonant scanner, beveger laserstrålen forholdsvis langsom på skanne behandlingstid punkter. For å unngå skade av vevet på disse behandlingstid punkter hvor lasereksponering er størst, er en mekanisk Eren innføres i fokalplanet mellom scan-og t-linser som stopper laserstrålen.
- For datainnsamling bruke en høyhastighets digitaliserer (800 MHz) i kombinasjon med et felt-programmerbar gate array (FPGA) Merk:. FPGA high-pass filter og binger PMT signal inn piksler. Kombinasjonen av høy-pass-filter på FPGA og den effektive lavpassfilter på PMT forsterkeren resultere i et båndpassfilter sentrert omtrent rundt repetisjonsfrekvensen av laseren (80 MHz). Sample FPGA-kode er gitt som et supplement.
- Tredemølle oppsett Air-støttet basert på design av Dombeck og kolleger to
- Koble ballen holderen til en lufttilførsel linje ved hjelp av en luftslangen på minst 10 mm indre diameter. Maksimere tverrsnittet av luft-innløps-baller og plassere rikelig mengde rør mellom hovedlufttilførselen og ballen holderen. Merknad: Økt tverrsnitt og øker lengden av lufttilførselsslangen reduserer støygenerering.
- Plasser en polystyren skum ball (20 cm diameter) i en spesialdesignet og 3D-trykte ball holderen.
- Dersom atferds paradigmet krever bare fremover (og bakover) locomotion, begrense bevegelsen av ballen til den horisontale (pitch) aksen ved å sette inn en nål (f.eks en 19 G kanyle) på siden av ballen. Merk: Vanligvis dyr tilpasse seg oppsettet mye raskere i dette redusert rotasjon paradigmet.
- Spor ballens bevegelse ved hjelp av en eller to optiske muså oppdage bevegelse rundt to eller alle tre akser, henholdsvis. Merk: Datamaskinen mus bør ideelt sett opererer med en infrarød diode for minst interferens med bildebehandling.
- Setup Virtual reality miljø
- Klargjør virtuell virkelighet miljø. Merk: Et eksempel miljø basert på Panda3D, en fritt tilgjengelig spillmotor, er gitt som et supplement. Objektene av det virtuelle miljøet er generert ved hjelp av Wings3D, en åpen kildekode 3D modeler. Prøven programmet leser informasjon posisjon på en datainnsamling kort og oversetter dette til bevegelse i det virtuelle miljøet. Koden utfører også den ikke-lineære transformasjonen som er nødvendig for miljøet for å bli projisert på et toroidalt skjerm. Den detaljerte byggingen av toroidal skjermen har blitt beskrevet andre steder 14,17.
- Bruk LED-projektorer eller LED-belysning dataskjermer for å vise det virtuelle miljøet. Integrer et gating CIRcuit for rask flimring av lampene under avbildning. Merk: Et iboende problem i to-foton avbildning under visuell stimulering er lett lekkasje som stammer fra visuell stimulering system, som kan reduseres ved å skjerme målet. Men, kan lys lekkasje fra visuell stimulering systemet være fullt avskaffet ved å synkron lyseffekten av projektoren til behandlingstid poeng av resonant scanner (når data ikke anskaffes), som er gjort med LED arenaer som brukes for visuell stimulering under bildebehandling i Drosophila 18. Dette resulterer i en effektiv høy hastighet veksling av visuell stimulering og datainnsamling (se figur 2). Denne flimring frekvens (24 kHz) er størrelsesordener over flimmerfusjons terskel, over hvilken flimring ikke lenger oppfattes av dyret. Det elektroniske kretsskjemaet for denne modifikasjon av en kommersiell LED projektor er vist i figur 3..
- Pupil sporing
- Bruk en CMOS-baserte videokameraet (30 fps) for elev posisjon sporing. Pass på at kameraet ikke inneholder en infrarød blokkering filter Merk:. Eleven er synlig ved høy kontrast under opptak på grunn av strølys fra de to-foton eksitasjon laser spennende gjennom øyet. Elev posisjon og diameter er hentet i sanntid ved hjelp av spesialprogrammert programvare basert på design av Sakatani og Isa 19.
2. Injeksjon av Genetic Kalsium Indicator og Window Implant
Injeksjon av en kalsiumindikator 20 og implantering av kraniale vinduet 21 er utført som tidligere beskrevet med de følgende tilsetninger:
- Injiser virus inn i området av interesse ved å bruke et glass-injeksjon pipette fylt igjen med virus-oppløsning og er koblet til en trykkinnsprøytning. Juster trykk avhengig av pipetten indrediameter, typisk ca. 70 til 140 mbar, for å injisere omtrent 100 nl av virusløsningen i løpet av 1-2 min. Lav volum injeksjon pulser som leveres ved lav frekvens (0,05 sek pulser på 2 Hz) skal brukes for å hindre overløp av viruset langs pipette under injeksjon. Merk: For å overvåke injeksjonsvolum, kan pipetten merkes ved små , jevnt fordelt lengder (f.eks 0,5 mm) under en stereo mikroskop. Forskyvning av menisken mellom markeringene kan deretter brukes til å estimere den injiserte volum.
- Flere uker etter injeksjon dette bør resultere i en bolus av tett merkede celler med en diameter på omkring 500 mikrometer. Effekten av Geci ekspresjon i regionen av interesse, avhenger av valget av Geci og promoter kombinasjon, så vel som den smittsomme titer og serotype av rekombinant AAV som brukes Obs. Som et representativt eksempel, med injeksjon av AAV2/1-EF1α-GCaMP5 en viral puppeh av 8 x 10 12 GC / ml til primære visuelle cortex med musen resulterer i tilfredsstillende uttrykk på ca to uker etter injeksjonen (figur 1).
- Hodet bar bør ikke hindre det visuelle feltet på mus, men bør være stiv nok til å muliggjøre stabil avbildning under oppførsel. Dette krever vanligvis to festepunkter på hver side av hodet linjen (se figur 1). Til fast feste hodet bar til skallen, sørg for å maksimere og tørk området utsatt skallen der hodet bar skal festes. I tillegg, ved bruk av en skalpell eller en sprøyte, riper i skallen for å lage overflatespor, hvilket øker overflatearealet til liming. Dekk bein med cyanoacrylate vev limet før du fester hodet bar med dental sement.
Tre. Eksperimentell prosedyre
- To til tre uker etter virus injeksjon, sjekk kranie vindu implantat for klarhet og til uttrykk under epifluorescens belysning. Godt synlig og skarpt definerte grensene for overfladiske blodkar er en god indikasjon på at vinduet implantatet er egnet for avbildning (se figur 1).
- Mål og justere lasereffekt til en verdi under 50 mW ved prøven.
- Slå på luftstrømmen til sfærisk tredemølle.
- For hodefiksering under mikroskopet, kort bedøve dyret med isofluran for å redusere stress. Plasser dyret inn i en isoflurananestesi container og vente til dyret slutter å bevege seg (ca. 10 sek). Ta dyret og umiddelbart hodet fikse det under mikroskopet.
- Plasser visuelt visningssystem så nært som mulig for dyret å fortsatt tillate tilgang til dyret. Jo mindre visuell kontakt dyret har med eksperimentator, jo mindre stresset dyret vil være under den innledende fasen av forsøket.
- Kontroller at kranie vindu implantatet er fri for støv og skitt. Rengjør med vannhvis det er nødvendig.
- Påfør klar ultralyd gel som nedsenking medium mellom kranie vinduet og vann-nedsenking objektiv. Dette løser problemene med treg bildeforringelse på grunn av vann fordampning eller lekkasje og reduserer behovet for å montere en kjegle på hodet bar til å holde vann. Merk: Sentrifuger gel før bruk for å fjerne alle luftbobler, og tar seg ikke å skape noe luft bobler under påføring av gelen. Luftbobler kan sterkt forringe bildekvaliteten.
- Vikle et stykke svart tape rundt målet og hodet bar for lys skjerming.
- Flytt det virtuelle miljøet arena til sin endelige posisjon og juster videokamera for elev sporing.
- Sett laser blanker som passer til skanning amplitude benyttet under forsøket.
- Start opptaket data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bildekvaliteten i to-foton kalsium avbildning av cellepopulasjoner som er merket med en Geci avhenger i stor grad av kvaliteten på den kraniale vindus implantatet. To uker etter virus injeksjon kranie vinduet skal inspiseres for klarhet. Det bør ikke være granulasjonsvev eller bein gjenvekst synlig (figur 1A). Videre bør mønsteret av overfladiske blodkar forbli uendret og grensene for blodkar må skarpt definert. På samme tid, kan Geci uttrykk også kontrolleres. Boli av merket celler skal være godt synlig under en epifluorescence mikroskop (Figur 1B).
Ideelt preparatet er stabilt nok slik at forvrengninger av de to-foton-bilder indusert av bevegelse av musen ikke er synlig i bildet etter at rammen registrering (figur 2). Skanningen banen til resonant skanneren er sinusformet som resulterer i ikke-lineære bildeforvrengning. Under turnaround poeng data er ikke ervervet grunn til bildet strekkes i denne delen av skanningen banen. Hvis lyskilden av visuell stimulering system, her lysdiodene av projektoren, er riktig timet til omslaget poeng, bør lys lekkasjen bare være tydelig i løpet av denne tiden (figur 2). Denne flimring frekvensen av lyskilden må være dobbelt så stor skanne frekvens. Nøkkelen til å gjøre dette arbeidet er rask vekst og fall tider av lysdioder og kontrollere elektronikk (figur 3).
Figur 1. Ovenfra et kranie vindu i et hode fast mus to uker etter operasjonen. (A) Et hodelinjen er optimalisert i vekt og form for å øke stabiliteten for oppførsel under avbildnings eksperimenter, og samtidig redusere belastningen på dyret. THan drar bar er laget av aluminium og har en tykkelse på 1 mm. Scale bar er 5 mm. (B) epifluorescence bilde av GCaMP5 uttrykk etter fire injeksjoner (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) på ca 80 nl. Injeksjonen dybde er ca 400 mikrometer. Scale bar er 1 mm. (C) Skjematisk av hodet bar. Alle mål i mm. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Forbedre signal til støy ved å redusere lys lekkasjen. LED lyskilde i projektoren av den virtuelle virkeligheten miljøet er synkronisert til resonant skanneren for å slå på bare under skanne behandlingstid perioder når data ikke er registrert (oransje Boxes). Laseren Eren ble fjernet fra mikroskopet for dette eksempel for å illustrere virkningen av lys lekkasje som følge av visuell stimulering. Bildet (gjennomsnitt på 8 sek av data) ble tatt i mus visuell cortex tilført med AAV2/1-EF1α-GCaMP5. Klikk her for å se større bilde.
Fig. 3. Kretsdiagram av elektronikken som brukes til å flimre en konvensjonell LED projektor. Denne portstyringskretsen drives av en TTL-inngang for å synkronisere hurtig flimring med resonans skanneren. C1: kondensator 1nF, D1, D2: dioder 1N4148; INV1: Inverter HEF40106 (1 av 6 brukt); LED1 - LED-beamer, R1: resistor 47 Ω, R2: resistor 2,2 k; R3: resistor 100 Ω, T1, T5, T6, T7: transistorer IF9321, T2: transistor BC846, T3: transistor BC170, T4: transistor BC856. Merk at denne kretsen må gjentas for alle tre fargekanalene (rød, grønn, blå) av projektoren. Klikk her for å se større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøkkelen til suksess for atferds to-foton avbildning er stabiliteten av preparatet på to måter:
- I løpet av dager etter implantasjon vinduet, kan inflammatoriske reaksjoner i vevet føre til økning av dannelsen av granulasjonsvev og brusk som vil hemme eller hindre avbildning.
- Under eksperimentet har hjernen til å være stabil nok til å hindre bevegelsesfeil fra ødelegge nevral aktivitet relatert fluorescens-signal.
For å holde den inflammatoriske immunresponsen til et minimum kranie vindu implantasjon kirurgi bør utføres så raskt som mulig og direkte skade på hjernen bør unngås for enhver pris. Av største betydning er å sikre at den kraniale vinduet implantatet forblir lufttett for hele varigheten av forsøket for å hindre betennelse.
For å minimere hjerne bevegelse relatert bildebehandling gjenstander ta vare for ikke å skade ellerfjerne dura mater under operasjonen. Gjenværende bevegelse indusert hjerne bevegelse kan korrigeres for ved bevegelse er begrenset til plan parallelt med bildeplanet (x / y-plan). Den maksimale tolerable standardavvik av bevegelse i x / y er omtrent 5 mikrometer. For bevegelse langs z-aksen denne verdien er omtrent 1 mikrometer, slik at omfanget av bevegelsen er mindre enn oppløsning grenseverdi av mikroskopet den.
Den lave hastighet av den resonans skanneren på skannebanen behandlingstid punkter kan føre til laser indusert vevsskade. For å forhindre dette, kan laser være blokkert på snuoperasjoner bruker en blanker i skanne teleskop. Hvis denne blanker er riktig innstilt og gjennomsnittlig laser makt under målet holdes under 50 mW, er bildebehandling mulig for lengre perioder over flere dager uten å forårsake noen synlige laserskader. En alternativ metode for en mekanisk blanking av laseren, er å bruke en rask Pockels-cellen for å redusere lasereffekt ved den turnarouNDS. Denne metoden har imidlertid den ulempen at Pockels celler vanligvis introdusere uønskede stråle forvrengninger.
Aptitude av hodet fast gnagere å navigere virtuelle miljøer har gjort det mulig å kronisk bilde populasjoner av celler i cortex av mus som utfører et bredt spekter av atferds oppgaver 3,4,6,22. Det er imidlertid verdt å merke seg at head-fiksering iboende begrensninger atferd og bevegelse på en sfærisk tredemølle er på mange måter ikke er likeverdige uhemmet bevegelse eller normal atferd.
I fremtiden vil styrke den virtuelle virkeligheten bildebehandling tilnærming beskrevet her trolig være en kombinasjon av kalsium bildebehandling med målrettet optogenetic stimulering under oppførsel. Med dette vil det være mulig å manipulere optisk presynaptiske celler og bilde deres post-synaptiske mål samtidig å overvåke de resulterende forandringer i oppførselen. I tillegg, som kalsium indikatorer fritt diffundere inne i cell, vil det også være mulig å måle aktiviteten selektivt i subcellulære rom under oppførsel. På grunn av bevegelsen indusert hjerne bevegelse, har slike opptak vært begrenset av hvor vanskelig å få stabile opptak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Max Planck Society, og Human Frontiers Science Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
