Två-foton Kalcium Imaging i möss Navigera en Virtual Reality Miljö

Summary

Här beskriver vi de experimentella förfaranden som ingår i två-photon avbildning av musen cortex under uppförande i en virtuell verklighet miljö.

Abstract

Under de senaste åren har två-photon avbildning blivit ett ovärderligt verktyg i neurovetenskap, eftersom det gör det möjligt för kroniskt mäta aktiviteten av genetiskt identifierade celler under uppförande ^1-6. Här beskriver vi metoder för att utföra två-photon avbildning i musen cortex medan djuret navigerar en virtuell verklighet miljö. Vi fokuserar på de aspekter av de experimentella procedurer som är nyckeln till att avbildning i en beter djur i väl upplysta virtuell miljö. De viktigaste problem som uppstår i denna experimentuppställning som vi här adressen är: minimera hjärnrörelserelaterade artefakter, minimerar ljusläckage från den virtuella verkligheten projektionssystem, och minimera laser inducerad vävnadsskada. Vi ger också prov programvara för att styra den virtuella verkligheten miljön och att göra eleven spårning. Med dessa förfaranden och resurser bör det vara möjligt att konvertera en vanlig två-photon mikroskop för användning i beter möss.

Introduction

Två-foton avbildning av kalcium indikatorer (genetiskt kodade som GCaMP5 ⁷ eller R-GECO ^8, eller syntetiska färgämnen som OGB eller Fluo4) har vuxit fram som en kraftfull metod för att mäta nervaktivitet i beter möss ^1-6. Den möjliggör samtidig mätning av aktiviteten av hundratals celler vid nära enda aktionspotentialens upplösning, upp till ca 800 | im under hjärnans yta ^9,10. Dessutom, med hjälp av genetiskt kodade kalcium indikatorer (GECIs) nervaktivitet kan mätas kroniskt ^5,11,12, och i genetiskt definierade celltyper ^13. Tillsammans, dessa metoder ger en grad av tids-och rumsupplösning som öppnar upp en mängd nya möjligheter att studera neuronal beräkning in vivo.

Kirurgiska ingrepp är nödvändigt att avslöja och märka mushjärnan för avbildning. Celler är typiskt transfekteras med hjälp av en rekombinant adenoassocierat vir oss (AAV)-systemet för Geci leverans och en kraniell fönster är implanterat över injektionsstället för att få optisk tillgång till hjärnan. En huvudstången fästs sedan vid skallen för huvudet fixering under två-foton-mikroskop. Utformningen och genomförandet av dessa steg är viktigt eftersom de flesta av problemen med vaken avbildning uppstår instabilitet i beredningen. Helst det förfarande som beskrivs här bör möjliggöra för kronisk avbildning av upp till flera månader efter operationen.

För att aktivera visuellt styrd beteende under två-photon avbildning, sitter huvudet fast musen på en luft stöds sfärisk löpband, som den kan använda för att navigera en virtuell verklighet miljö. Locomotion av musen på löpbandet är kopplad till rörelse i den virtuella miljön som visas på en toroid skärm omger musen ^14,15. Beteendevariabler såsom förflyttning, visuell stimulans, och elevläge kan spelas in ^6.

t "> Vi beskriver de förfaranden som är involverade i kronisk två-photon avbildning i möss utforska en virtuell verklighet miljö De viktigaste punkterna som tas upp är:. minskning av rörelseartefakter, minskning av ljusläckage, maximering av antalet samtidigt inspelade celler, och minimering av fotoskador. Vi tillhandahåller även information om att installera luft-stöd löpband, elev spårning, och den virtuella verkligheten miljön. De förfaranden som beskrivs här kan användas för avbildning fluorescerande cellpopulationer i huvudet fast möss i ett potentiellt stort antal beteendeparadigm .

Protocol

Alla animaliska förfaranden godkändes och genomförs i enlighet med riktlinjerna i veterinäravdelningen vid Kanton Basel-Stadt.

1. Hårdvara och mjukvara Setup

1. Två-foton scanning mikroskop inställning:
   1. Använd en pulsad infraröd laser som en belysningskälla (pulsbredd <120 fsec).
   2. Använd en skanningshuvud som består av en 8 eller 12 kHz resonans scanner och en vanlig galvanometer. Notera: Detta gör att bildhastigheter på 40 eller 60 Hz på 750 x 400 bildpunkter. En hög bildhastighet är avgörande för att minimera hjärn rörelse inducerade bildförvrängning. Dessutom snabb resonans skanning i en högre signalutbyte och minskar fotoblekning ¹⁶ och fototoxicitet.
   3. Använd ett Piezo-elektriska höghastighets z-steg att sekventiellt förvärva tidsinterfolierade bilder på flera djup Notera:. Detta är valfritt och används för att öka data avkastning på bekostnad av bildhastigheten.
   4. Använd amechanical blanker att minska laserexponering av vävnaden. Justera bredden på blankern beroende på amplituden hos den resonans scanner Anm. På grund av den sinusformade typen av avsökningsbanan hos en resonans scanner, laserstrålen rör sig jämförelsevis långsamt vid skanningsvändpunkter. För att undvika skador på vävnaden vid dessa vändning punkter där laserexponering är störst, är en mekanisk blanker införs i fokalplanet mellan skann och röret linser som slutar laserstrålen.
   5. För datainsamling använder en höghastighets digitizer (800 MHz) i kombination med ett fält-Programmable Gate Array (FPGA) Anmärkning:. FPGA högpassfilter och lådor PMT signalen i pixlar. Kombinationen av högpassfiltret på FPGA och det effektiva lågpassfilter på PMT förstärkaren resulterar i ett bandpassfilter centrerat ungefär runt repetitionshastigheten hos lasern (80 MHz). Prov FPGA-kod tillhandahålls som ett komplement.
2. Luft-stöd löpband inställning bygger på design av Dombeck och kollegor ²
   1. Anslut kulhållaren till en lufttillförselledning med användning av en lufttillförselröret av minst 10 mm innerdiameter. Maximera tvärsnitt av bollhållaren lufttillförseln inlopp och placera riklig mängd slang mellan huvudlufttillförseln och bollhållaren. Anm: Ökad tvärsnitt och ökad längd av lufttillförseln slangen minskar buller generation.
   2. Placera en polystyrenskum boll (20 cm i diameter) i ett skräddarsytt och 3D-tryckt bollhållaren.
   3. Om beteende paradigmet kräver bara framåt (och bakåt) locomotion, begränsa rörelse av bollen mot horisontalplanet (pitch) axeln genom att sätta in ett stift (t.ex. en 19 G injektionsnål) på sidan av bollen Anm. Typiskt djur anpassar sig till installationen mycket snabbare i detta reducerade rotations paradigm.
   4. Spår förflyttning av bollen genom att använda en eller två optiska datormössatt detektera rörelse runt två eller alla tre axlarna, respektive Anm. Datorn möss bör helst arbeta med en infraröd diod för minst interferens med avbildning.
3. Virtuell verklighet miljö inställning
   1. Förbered virtuell verklighet miljö Anm. Ett prov miljö baserad på Panda3D, en fritt tillgänglig spelmotor, tillhandahålls som ett komplement. Ändamålen med den virtuella miljön genereras med användning wings3d, ett open source 3D modellerare. Provet Programmet läser positionsinformation på ett datainsamlingskort och översätter detta till en rörelse i den virtuella miljön. Koden utför även den olinjära omvandlingen nödvändig för miljön som skall projiceras på en toroidformad skärm. Den detaljerade konstruktionen av toroid skärmen har beskrivits på annan plats ^14,17.
   2. Använd LED-projektorer eller LED-bakgrundsbelyst datorskärmar för visning av den virtuella miljön. Integrera en grind circuit för snabb flimmer av lamporna under avbildning. Notera: Ett inneboende problem i två-foton-avbildning under visuell stimulans är ljus läcka som härrör från den visuella stimuleringssystem, som kan reduceras genom att skydda målet. Däremot kan lätt läcka från visuell stimulans systemet helt avskaffas genom att synkronisera den ljuseffekt av projektorn till handläggningspunkter resonans scannern (när data inte förvärvas), som sker med LED-arenor som används för visuell stimulans under avbildning i Drosophila ^18. Detta resulterar i en effektiv höghastighets växlingen av visuell stimulans och datainsamling (se figur 2). Den flimrande frekvens (24 kHz) är tiopotenser över tröskel flimmer fusion, över vilken flimmer inte längre uppfattas av djuret. Den elektroniska kretsdiagram av denna modifikation till en kommersiell LED projektor visas i figur 3.
4. Pupil spårning
   1. Använd en CMOS-baserad videokamera (30 fps) för elevläge spårning. Se till att kameran inte innehåller en IR-blockerande filter Anm. Eleven är synlig på hög kontrast under inspelningarna på grund av ströljus från tvåfotonexcitering laser spännande genom ögat. Elev position och diameter utvinns i realtid med hjälp av specialprogrammerad mjukvara baserad på design av Sakatani och Isa ^19.

2. Injektion av genetisk kalcium indikator och Fönster Implant

Insprutningen av en kalciumindikator ²⁰ och implantation av den kraniala fönstret ²¹ utförs såsom beskrivits tidigare med följande tillägg:

1. Injicera viruset in i regionen av intresse med användning av en glas injektionspipetten återfylls med viruslösningen och ansluten till en tryckinsprutningssystemet. Justera trycket beroende på pipetten innerdiameter, typiskt ca. 70-140 mbar, att injicera ca 100 nl av viruslösningen under loppet av 1-2 min. Låg volym insprutningspulser som avges vid låg frekvens (0.05 sek pulser vid 2 Hz) bör användas för att undvika spill av viruset längs pipetten under injektion Anm. För att övervaka injektionsvolym, kan pipetten markeras med små , jämnt fördelade längder (t.ex. 0,5 mm) under ett stereomikroskop. Förskjutning av menisken mellan markeringarna kan sedan användas för att uppskatta den injicerade volymen.
2. Flera veckor efter injektion detta bör resultera i en bolus av tätt märkta celler med en diameter av ca 500 | im. Effektivitet av Geci expression i regionen av intresse beror på valet av Geci och promotor kombination, liksom den infektiösa titern och serotyp av den rekombinanta AAV användas Obs. Som ett representativt exempel, injektion av AAV2/1-EF1α-GCaMP5 med en viral titer av 8 x 10 ¹² GC / ml i primära syncentrum för en mus ger tillfredsställande uttryck på cirka två veckor efter injektion (Figur 1).
3. Huvudet bar bör inte hindra synfältet av musen, men bör vara tillräckligt styv för att möjliggöra en stabil avbildning under uppförande. Detta kräver typiskt två fästpunkter på vardera sidan av huvudstången (se figur 1). För att ordentligt fästa huvudstången till skallen, se till att maximera och torka området exponerade skallen där huvudet bar kommer att bifogas. Dessutom, med användning av en skalpell eller en spruta, repa skallen för att skapa ytliga spåren därigenom öka ytarean för limning. Täck benet med cyanoakrylat vävnadsadhesiv innan monteringen huvudet bar med tandcement.

3. Experimentellt förfarande

1. Två till tre veckor efter virusinjektion, kontrollerar hjärnfönster implantat för klarhet och uttryck inom epifluorescens belysning. Klart synlig och skarpt definierade gränser ytliga blodkärl är en bra indikation på att fönstret implantatet är lämpligt för avbildning (se figur 1).
2. Mät och justera lasereffekt till ett värde under 50 mW vid provet.
3. Slå på luftflödet till den sfäriska löpband.
4. För huvudet fixering under mikroskop, kort söva djuret med isofluran för att minska stress. Placera djuret i en isoflurananestesi behållare och vänta tills djuret slutar röra sig (ca 10 sek). Ta bort djuret och omedelbart huvudet fixa det under mikroskop.
5. Placera den visuella displaysystemet så nära som möjligt för djuret att fortfarande medge tillgång till djuret. Den mindre visuell kontakt djuret har med försöksledaren, den mindre stressade djuret kommer att vara under den inledande fasen av försöket.
6. Se till att den kraniala fönstret implantatet är fri från damm och smuts. Rengör med vattenom nödvändigt.
7. Applicera klart ultraljud gel som nedsänkning mediet mellan kraniala fönstret och vattenimmersionsobjektiv. Detta löser problemen med långsam bildförsämring på grund av vatten avdunstning eller läckage och minskar behovet att montera en kon på huvudet bar att hålla vatten Anm. Centrifugera gelen före användning för att ta bort alla luftbubblor, och se till att inte skapa någon luft bubblor under applicering av gelen. Luftbubblor kan försämra bildkvaliteten.
8. Linda en bit svart tejp runt målet och huvudet bar för ljusavskärmning.
9. Flytta den virtuella miljön arenan till sin slutliga position och justerar videokameran för elev spårning.
10. Ställ lasern blankern anpassat till avsöknings amplitud används under experimentet.
11. Börja spela in data.

Representative Results

Bildkvaliteten i två-foton kalcium avbildning av cellpopulationer märkta med en Geci beror till stor del på kvaliteten på den kraniala fönstret implantatet. Två veckor efter virusinjektion i hjärn fönster ska kontrolleras för tydlighet. Det bör inte vara granulationsvävnad eller benåterväxt synlig (Figur 1A). Dessutom är mönstret av ytliga blodkärl bör förbli oförändrade, och gränserna för den kärlsystemet bör vara skarpt definierade. Samtidigt kan också kontrolleras Geci uttryck. Boli av märkta celler ska vara klart synliga under en epifluorescensmikroskop (Figur 1B).

Helst beredningen är tillräckligt stabil så att snedvridning av de två foton bilder som framkallas av förflyttning av musen är inte synliga i bilden efter ramen registrering (Figur 2). Skannings väg resonans scannern är sinusformad vilket resulterar i icke-linjär bildförvrängning. Under turnaround datapunkter inte förvärvat på grund av bild sträckning i denna del av avsökningsbanan. Om ljuskällan för visuell stimulans systemet, här lamporna i projektorn, korrekt är klockat till handläggningspunkterna, bör ljus läcka endast vara uppenbart under denna tid (figur 2). Den fladdrande frekvensen hos ljuskällan måste vara två gånger avsökningsfrekvensen. Nyckeln till att göra detta arbete är den snabba uppgång och fall tider av lysdioderna och styrning elektronik (Figur 3).

Figur 1. Toppvy av en kranial fönster i ett huvud fast mus två veckor efter operationen. (A) Den huvudstången är optimerad i vikt och form för att öka stabiliteten för beteende under imaging experiment och samtidigt minska bördan för djuret. Than huvudet bar är tillverkad av aluminium och har en tjocklek på 1 mm. Skala bar är 5 mm. (B) epifluorescens bild av GCaMP5 uttryck efter fyra injektioner (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) på cirka 80 nl. Injektionsdjupet är ca 400 | im. Scale bar är 1 mm. (C) Schema av huvudstången. Alla mått i mm. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Förbättrad signal till brus genom att reducera ljusläckage. LED ljuskälla i projektorn i den virtuella verkligheten miljö synkroniseras till resonans scannern för att slå på endast under genomsökningen handläggningstider när data inte registreras (Orange BOxes). Laser blanker togs bort från mikroskopet för detta exempel för att illustrera effekten av ljusläckage till följd av visuell stimulans. Bilden (genomsnitt 8 sekunder av data) togs i mus syncentrum transfekterade med AAV2/1-EF1α-GCaMP5. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. Kretsschema över elektroniken som används för att blinka en konventionell LED-projektor. Grindkretsen drivs av en TTL-ingång för att synkronisera snabb flimmer med resonansscanner. C1: kondensator 1nF, D1, D2: dioder 1N4148, INV1: Inverter HEF40106 (1 av 6 används), LED1 - LED av projektor, R1: motstånd 47 Ω, R2: motstånd 2.2 kQ, R3: resistor 100 Ω, T1, T5, T6, T7: transistorer IF9321, T2: transistor BC846, T3: transistor BC170, T4: transistor BC856. Observera att denna krets måste upprepas för alla tre färgkanalerna (röd, grön, blå) från projektorn. Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Nyckeln till framgång för beteende två-foton-avbildning är stabiliteten av beredningen på två sätt:

1. Under dagarna efter fönster implantation, kan inflammatoriska reaktioner i vävnaden leder till förbättring av bildandet av granulationsvävnad och brosk som kommer att försvåra eller till och med förhindra avbildning.
2. Under experimentet hjärnan måste vara tillräckligt stabil för att förhindra rörelseartefakter förvränger neural aktivitet relaterad fluorescenssignal.

För att hålla den inflammatoriska immunsvar till ett minimum hjärnfönster implantationskirurgi bör genomföras så snabbt som möjligt och direkta skador på hjärnan bör undvikas till varje pris. Av största vikt är att se till att den kraniala fönstret implantatet blir otät för hela den tid av experiment för att förhindra inflammation.

För att minimera hjärn rörelse relaterade imaging artefakter till att inte skada elleravlägsna dura mäter under operationen. Kvar locomotion inducerad hjärnrörelse kan korrigeras för när rörelse är begränsad till plan parallellt med bildplanet (x / y-planet). Den maximala tolerabla standardavvikelse för rörelse i x / y är ungefär 5 um. För rörelse utmed z-axeln detta värde är ungefär 1 ^ m, så att omfattningen av förflyttningen är mindre än upplösningen gränsen för mikroskop.

Den låga hastigheten hos resonansskanner vid avsökningsbanan loppspunkter kan leda till laser-inducerad vävnadsskada. För att förhindra detta kan laserblockeras vid vändningarna använder ett blanker i avsöknings teleskop. Om detta blanker är rätt inställd och genomsnittlig lasereffekt under målet hålls under 50 mW, kan avbildning för längre perioder under flera dagar utan att orsaka någon synlig laserskada. En alternativ metod till en mekanisk stansning av lasern är att använda en snabb Pockels-cell för att minska lasereffekten vid turnarounds. Denna metod har dock nackdelen att Pockels celler införa vanligtvis oönskade balk snedvridningar.

Den fallenhet för huvud fasta gnagare för att navigera virtuella miljöer har gjort det möjligt för kroniskt bild populationer av celler i hjärnbarken av möss som utför en rad olika beteendemässiga uppgifter ^3,4,6,22. Det är dock värt att notera att huvud-fixering i sig begränsar beteende och förflyttning på en sfärisk löpband är på många sätt som inte motsvarar ohämmad rörelseförmåga eller normalt beteende.

I framtiden kommer styrkan i den virtuella synsätt verkligheten avbildning beskrivs här sannolikt en kombination av kalcium avbildning med riktad optogenetic stimulans under uppförande. Med detta skulle det vara möjligt att optiskt manipulera presynaptiska celler och bild deras postsynaptiska mål samtidigt som övervakar de resulterande beteendeförändringar. Dessutom, som kalcium indikatorer fritt diffundera inom cell, kommer det också att vara möjligt att mäta aktiviteten selektivt i subcellulära fack under uppförande. På grund av rörelse inducerade hjärn rörelse har sådana inspelningar begränsats av svårigheten att erhålla stabila inspelningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cover slips (diameter = 3-5 mm)	Menzel		window implant
InSight DeepSee laser	Spectra-Physics		microscope
12 kHz Resonance scanner	Cambridge Technology	G1-003-30026	microscope
Galvometer	Cambridge Technology	G6215H	microscope
Digitizer	National Instruments	NI 5772	microscope
FPGA	National Instruments	PXIe 7965R	microscope
Acquisition card	National Instruments	PCIe 6363	microscope
Emission filter 525/50	Semrock	FF03-525/50-25	microscope
Piezo-electric z-drive	Physikinstrumente	P-726.1CD	microscope
Controller for Piezo-electric drive	Physikinstrumente	E665 LVPZT	microscope
Objective 16X, 0.8NA	Nikon	CFI75	microscope
Current amplifier	Femto	DHPCA-100	microscope
Photomultiplier tube	Hamamatsu		microscope
USB Camera without IR filter	ImagingSource	DMK22BUC03	pupil tracking
Objective 50 mm	ImagingSource	M5018-MP	pupil tracking
Macro adapter rings	ImagingSource	LAexSet	pupil tracking
Optical computer mouse	Logitech	G500	motion tracking
Styrofoam ball 20 cm	e.g. idee-shop.de	08797.00.15	virtual environment
LED projector	Samsung	SP-F10M	virtual environment
Acquisition card	National Instruments	NI 6009	virtual environment
Panda3D game engine		www.panda3d.org	virtual environment
Numpy library for Python		www.scipy.org	virtual environment
Scipy library for Python		www.scipy.org	virtual environment
NI-DAQmx driver	National Instruments	www.ni.com	virtual environment
Ultrasound gel	Dahlhausen	5701.0342.10	imaging