Summary
Hier beschrijven we de experimentele procedures betrokken bij twee-foton beeldvorming van de muis cortex tijdens gedrag in een virtual reality omgeving.
Abstract
In de afgelopen jaren, heeft twee-foton beeldvorming uitgegroeid tot een onmisbaar hulpmiddel in de neurowetenschappen, omdat het zorgt voor chronische meting van de activiteit van genetisch geïdentificeerde cellen tijdens gedrag 1-6. Hier beschrijven we methoden naar twee-foton beeldvorming uitvoeren muis cortex terwijl het dier navigeert een virtual reality omgeving. We richten ons op de aspecten van de experimentele procedures die essentieel zijn voor de beeldvorming in een gedragen dier in een helder verlichte virtuele omgeving zijn. De belangrijkste problemen die zich voordoen in deze experimentele opstelling die we hier adresgegevens zijn: het minimaliseren van de hersenen motion gerelateerde artefacten, het minimaliseren van licht lekken van de virtual reality projectiesysteem, en het minimaliseren van laser-induced weefselschade. We bieden ook sample software om de virtual reality omgeving controleren en leerling bijhouden doen. Met deze procedures en middelen moet het mogelijk zijn om een conventionele twee-foton microscoop voor gedragen te converteren in muizen.
Introduction
Twee-foton beeldvorming van calcium indicatoren (genetisch gecodeerd zoals GCaMP5 7 of R-GECO 8, of synthetische kleurstoffen zoals OGB of Fluo4) heeft zich ontpopt als een krachtige methode voor het meten van neuronale activiteit in gedragen muizen 1-6. Het maakt de gelijktijdige meting van de activiteit van honderden cellen bij bijna enkele actiepotentiaal resolutie tot ongeveer 800 urn onder het hersenoppervlak 9,10. Bovendien, met behulp van genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIS) neuronale activiteit kan worden gemeten chronisch 5,11,12, en genetische gedefinieerde celtypes 13. Samen bieden deze methodes een zekere mate van temporele en ruimtelijke resolutie die het openen van een veelheid aan nieuwe mogelijkheden in de studie van neuronale berekening in vivo.
Chirurgische ingreep noodzakelijk is om bloot te leggen en het etiket van de hersenen van muizen voor de beeldvorming. Cellen worden kenmerkend getransfecteerd met een recombinant adeno geassocieerde vir us (AAV) voor GECI levering en een craniale venster wordt ingeplant op de injectieplaats om optische toegang tot de hersenen te krijgen. Een hoofd balk wordt dan aan de schedel voor kop bevestiging kader van de twee-foton microscoop bevestigd. Het ontwerp en de uitvoering van deze stappen is van cruciaal belang, aangezien de meeste van de problemen met wakker beeldvorming ontstaan van instabiliteiten in de voorbereiding. Idealiter zou de hier beschreven procedure mogelijk maken chronische beeldvorming tot enkele maanden na de operatie.
Om visueel geleide gedrag tijdens twee-foton beeldvorming mogelijk te maken, de kop vaste muis zit op een lucht ondersteund sferische loopband, die zij kan gebruiken om een virtual reality omgeving te navigeren. Locomotion van de muis op de loopband is gekoppeld aan beweging in de virtuele omgeving die wordt weergegeven op een ringkern scherm rond de muis 14,15. Behavioral variabelen zoals motoriek, visuele stimulus, en leerling positie kan worden opgenomen 6.
t "> We beschrijven de bij chronische twee-foton beeldvorming in muizen verkennen van een virtual reality omgeving procedures De belangrijkste punten behandeld:. reductie van bewegingsartefacten, vermindering van licht lekken, maximalisatie van het aantal gelijktijdig opgenomen cellen en minimalisering van foto schade. We bieden ook informatie over het instellen van de lucht ondersteund loopband, pupil tracking, en de virtual reality omgeving. De hier beschreven procedures kan worden gebruikt voor het afbeelden van fluorescent gelabelde celpopulaties in het hoofd vast muizen in een potentieel breed scala van gedrags-paradigma .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de veterinaire afdeling van het kanton Basel-Stadt uitgevoerd.
1. Hardware-en software-installatie
- Twee-foton scanning microscoop setup:
- Gebruik een gepulste infrarode laser als lichtbron (pulsbreedte <120 FSEC).
- Gebruik een scan hoofd bestaat uit een 8 of 12 kHz resonantie scanner en een standaard galvanometer. Opmerking: Dit maakt frame rates van 40 of 60 Hz bij 750 x 400 pixels. Een hoge framerate is van cruciaal belang voor het minimaliseren van de hersenen beweging geïnduceerde beeldvervorming. Bovendien, snelle resonante scanresultaten in een hogere signaal rendement en vermindert fotobleken 16 en fototoxiciteit.
- Gebruik een Piëzo-elektrische hoge snelheid z-stepper te verwerven tijd interleaved beelden sequentieel op meerdere dieptes. Opmerking: Dit is optioneel en wordt gebruikt om gegevens opbrengst te verhogen ten koste van de framerate.
- Gebruik amechanische uitschakel laser blootstelling aan het weefsel verminderen. De breedte van de uitschakel afhankelijk van de amplitude van de resonante scanner. Opmerking: Door de sinusvormige aard van het scanpad van een resonante scanner, de laserstraal beweegt relatief traag aan het scan om te keren. Om beschadiging van het weefsel op deze ommekeer punten waar de blootstelling laser is het grootst te voorkomen, wordt een mechanische blanker geïntroduceerd in het brandvlak tussen de scan en de buis lenzen die de laserstraal stopt.
- Voor data-acquisitie gebruik van een hoge snelheid digitizer (800 MHz) in combinatie met een field-programmable gate array (FPGA). Opmerking: De FPGA high-pass filters en bakken de PMT-signaal in pixels. De combinatie van het hoogdoorlaatfilter van de FPGA en de effectieve laagdoorlaatfilter op de PMT versterker resulteren in een banddoorlaatfilter ruwweg gecentreerd rond de herhalingsfrequentie van de laser (80 MHz). Monster FPGA-code wordt geleverd als een aanvulling.
- Opblaasbare loopband setup gebaseerd op het ontwerp van Dombeck en collega's 2
- Sluit de bal houder om een luchttoevoer lijn met behulp van een luchttoevoer buis van minimaal 10 mm binnendiameter. Maximaliseren van de dwarsdoorsnede van de bal houder luchttoevoer inlaat en plaats ruime hoeveelheid slang tussen de belangrijkste luchttoevoer en de bal houder. Opmerking: Verhoogde doorsnede en toename van de lengte van de luchttoevoer buis vermindert ruis generatie.
- Plaats een piepschuim bal (20 cm diameter) in een op maat ontworpen en 3D-gedrukte bal houder.
- Als de gedragsmatige paradigma vereist alleen vooruit (en achteruit) motoriek, beperken beweging van de bal naar de horizontale (pitch) as door het invoegen van een pen (bv. een 19 G injectienaald) aan de kant van de bal. Opmerking: Typisch dieren zich aanpassen aan de installatie veel sneller in deze gereduceerde rotatie paradigma.
- Track beweging van de bal met behulp van een of twee optische computermuizendetecteren beweging rond twee of drie assen, respectievelijk. Opmerking: De computer muizen idealiter werken met een infrarood diode minste interferentie met de beeldvorming.
- Virtual reality omgeving setup
- Bereid de virtual reality omgeving. Opmerking: Een monster omgeving op basis van Panda3D, een vrij beschikbare game-engine, wordt geleverd als een aanvulling. De objecten van de virtuele omgeving worden gegenereerd met behulp van Wings3D, een open source 3D modeler. Het monster programma leest positie-informatie op een data-acquisitie kaart en vertaalt deze in beweging in de virtuele omgeving. De code voert ook de niet-lineaire transformatie die nodig zijn voor het milieu te worden geprojecteerd op een ringkern scherm. De gedetailleerde constructie van de ringkern scherm is elders 14,17 beschreven.
- Gebruik LED projectoren of LED backlit beeldschermen voor de weergave van de virtuele omgeving. Integreer een gating circuit voor het snel knipperen van de LED's tijdens de beeldvorming. Opmerking: Een inherent probleem in twee-foton beeldvorming tijdens visuele stimulatie is licht rook afkomstig van het visuele stimulatie systeem, die kan worden verminderd door het afschermen van de doelstelling. Echter, licht lekken van de visuele stimulatie systeem volledig worden afgeschaft door het synchroniseren van de lichtopbrengst van de projector om de ommekeer punten van de resonante scanner (wanneer gegevens niet worden verworven), zoals wordt gedaan met LED-arena gebruikt voor visuele stimulatie tijdens de beeldvorming in Drosophila 18. Dit resulteert in een effectieve snelle afwisseling van visuele stimulatie en data acquisitie (zie figuur 2). De flikkering frequentie (24 kHz) is ordes van grootte hoger dan de flikkering fusie drempel, waarboven het trillen wordt niet langer gezien door het dier. De elektronische schema van deze wijziging een commerciële LED projector getoond in figuur 3.
- Jongenil volgen
- Gebruik een CMOS-gebaseerde video-camera (30 fps) voor pupilpositie tracking. Zorg ervoor dat de camera een infrarood blocking filter bevat. Opmerking: De leerling is zichtbaar bij hoge contrast tijdens opnames als gevolg van strooilicht van de twee-foton excitatie laser verlaten door het oog. Pupilpositie en diameter wordt geëxtraheerd in real time met speciaal geprogrammeerde software gebaseerd op het ontwerp van Sakatani en Isa 19.
2. Injectie van Genetische Calcium Indicator en Window Implant
De injectie van een calcium indicator 20 en de implantatie van de craniale venster 21 worden uitgevoerd zoals eerder beschreven met de volgende toevoegingen:
- Injecteer het virus in het gebied van belang met een glazen injectiepipet opgevuld met virusoplossing en op een druk injectiesysteem. Stel de druk afhankelijk van de pipet binnen-diameter, typisch ongeveer. 70-140 mbar tot ongeveer 100 nl van virusoplossing injecteren in de loop van 1-2 minuten. Laag Volume injectie pulsen bij lage frequentie (0,05 seconden pulsen bij 2 Hz) worden gebruikt om overloop van het virus aan de pipet tijdens injectie te voorkomen. Opmerking: Om het injectievolume bewaken, kan de pipet op kleine gemarkeerd , gelijkmatig verdeeld lengtes (bv. 0,5 mm) onder een stereo microscoop. Verplaatsing van de meniscus tussen de markeringen kan dan gebruikt worden om het geïnjecteerde volume te schatten.
- Enkele weken na injectie moet dit leiden tot een bolus van dicht gemerkte cellen met een diameter van ongeveer 500 urn. Werkzaamheid van GECI expressie in het interessegebied afhankelijk van de keuze van GECI en promotor combinatie, en de infectieuze titer en serotype van het recombinante AAV gebruikt. Opmerking: Als een representatief voorbeeld injectie van AAV2/1-EF1α-GCaMP5 met een virale titer of 8 x 10 12 GC / ml in primaire visuele cortex van muis leidt bevredigende expressie ongeveer twee weken na de injectie (Figuur 1).
- Het hoofd balk moet niet het gezichtsveld van de muis belemmeren, maar stijf genoeg om te zorgen voor een stabiele beeldvorming tijdens gedrag zou moeten zijn. Dit vereist meestal twee bevestigingspunten aan weerszijden van de kopboom (zie figuur 1). Om het hoofd bar aan de schedel goed vast, zorg ervoor om te maximaliseren en droog het gebied van de blootgestelde schedel waar de hoofd bar zal worden gehecht. Bovendien, met behulp van een scalpel of een spuit, krassen op de schedel om oppervlakkige groeven waardoor het oppervlak toenemende lijmen creëren. Bedek het bot met cyanoacrylaat weefselhechtmiddel voordat u het hoofd bar met tandheelkundige cement.
3. Experimentele procedure
- Twee tot drie weken na virus injectie, controleer dan de craniale venster implantaat voor duidelijkheid en expressie onder epifluorescentie verlichting. Duidelijk zichtbaar en scherp gedefinieerde grenzen van oppervlakkige bloedvaten een goede indicatie dat het raam implantaat geschikt is voor beeldvorming (zie figuur 1).
- Meet en pas laservermogen tot een waarde onder 50 mW bij het monster.
- Zet de luchtstroom naar de bolvormige loopband.
- Voor hoofd fixatie onder de microscoop, kort verdoven het dier met isofluraan om stress te verminderen. Plaats het dier in een isofluraananesthesie container en wacht tot het dier stopt met bewegen (ongeveer 10 sec). Haal het dier onmiddellijk hoofd repareren onder de microscoop.
- Plaats de visuele weergave systeem zo dicht mogelijk bij het dier nog steeds de mogelijkheid om toegang tot het dier. Hoe minder visueel contact met het dier de experimentator, hoe minder stress zal het dier tijdens de beginfase van het experiment.
- Zorg ervoor dat de craniale venster implantaat is vrij van stof en vuil. Schoon met waterindien nodig.
- Solliciteer duidelijk ultrasound gel als onderdompeling medium tussen de craniale raam en water-immersie objectief. Dit lost de problemen van langzame verslechtering van het beeld als gevolg van water verdamping of lekkage en vermindert de noodzaak om een kegel te monteren op het hoofd bar om water vast te houden. Opmerking: Centrifuge de gel vóór gebruik om alle luchtbellen te verwijderen, en verzorgen alle lucht te creëren bellen tijdens het aanbrengen van de gel. Luchtbellen ernstig verminderen beeldkwaliteit.
- Wikkel een stukje zwarte tape rond het doel en de hoofd bar voor lichte afscherming.
- Verplaats de virtuele omgeving arena om zijn definitieve positie en pas de videocamera voor pupil tracking.
- Stel de laser uitschakel de scan amplitude tijdens het experiment passen.
- Start de opname van gegevens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De beeldkwaliteit twee-foton calcium beeldvorming van celpopulaties gelabeld met een GECI grotendeels afhankelijk van de kwaliteit van de craniale venster implantaat. Twee weken na virus injectie de craniale venster moet worden gecontroleerd voor de duidelijkheid. Er mag geen granulatieweefsel of bot hergroei zichtbaar (Figuur 1A) zijn. Bovendien moet het patroon van oppervlakkige bloedvaten behouden en grenzen van de vasculatuur dienen nauwkeurig gedefinieerd. Tegelijkertijd kan GECI expressie worden gecontroleerd. Boli van gelabelde cellen moeten duidelijk zichtbaar zijn onder een epifluorescentiemicroscoop (Figuur 1B).
Idealiter het preparaat stabiel genoeg zodanig dat verstoring van de twee-foton beelden geïnduceerd door locomotie van de muis zijn niet zichtbaar in het beeld na aanmelding raam (figuur 2). De scan pad van de resonante scanner is sinusvormige resulteert in niet-lineaire beeldvervorming. Tijdens de turnaround punten gegevens worden niet verworven als gevolg van uitrekken zich in dit deel van de scan pad. Als de lichtbron van de visuele stimulatie systeem, hier de LED's van de projector, wordt juist op tijd om de ommekeer punten, moet licht lek pas duidelijk worden tijdens deze periode (figuur 2). Het flikkeren frequentie van de lichtbron moet tweemaal de scan frequentie. Sleutel tot het maken van dit werk zijn de snelle opkomst en daaltijden van de LEDs en sturende elektronica (figuur 3).
Figuur 1. Bovenaanzicht van een craniale venster in een vaste kop muis twee weken na de operatie. (A) Het hoofd bar geoptimaliseerd gewicht en vorm stabiliteit gedrag tijdens beeldvorming experimenten verhogen, terwijl het verminderen van druk op het dier. Thij hoofd staaf is gemaakt van aluminium en heeft een dikte van 1 mm. Schaal bar is 5 mm. Epifluorescentie beeld van GCaMP5 expressie na vier injecties (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) van ongeveer 80 nl (B). De injectiediepte ongeveer 400 urn. Schaal bar is 1 mm. (C) Schema's van het hoofd bar. Alle maten in mm. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 2. Verbetering van signaal-ruis door het verminderen van licht lekken. De LED-lichtbron in de projector van de virtual reality omgeving wordt gesynchroniseerd met de resonante scanner om alleen tijdens de scan periodes ommekeer wanneer gegevens niet worden opgenomen (oranje bo schakelenxes). De laser uitschakel werd de microscoop voor dit voorbeeld verwijderd om het effect van licht lek tengevolge van visuele stimulatie illustreren. Het beeld (gemiddeld 8 sec van gegevens) werd genomen in de muis visuele cortex getransfecteerd met AAV2/1-EF1α-GCaMP5. Klik hier voor grotere afbeelding.
Figuur 3. Schema van de elektronica die een conventionele LED projector flikkeren. De poortschakeling is gestuurd door een TTL ingang snel flikkeren synchroniseren met de resonante scanner. C1: condensator 1nF, D1, D2: diodes 1N4148; INV1: Inverter HEF40106 (1 van 6 gebruikt); LED1 - LED van de beamer; R1: weerstand 47 Ω, R2: weerstand 2,2 kOhm; R3: resistor 100 Ω; T1, T5, T6, T7: transistors IF9321; T2: transistor BC846; T3: transistor BC170; T4: transistor BC856. Merk op dat dit circuit moet worden herhaald voor alle drie de kleurkanalen (rood, groen, blauw) van de projector. Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De sleutel tot het succes van gedrags twee-foton beeldvorming is de stabiliteit van het preparaat op twee manieren:
- In de loop van de dagen na de implantatie venster, kan ontstekingsreacties van het weefsel leiden tot verbetering van de vorming van granulatieweefsel en kraakbeen dat zal belemmeren of zelfs beeldvorming te voorkomen.
- Tijdens het experiment de hersenen stabiel genoeg om te voorkomen bewegingsartefacten van beschadiging neurale activiteit met betrekking fluorescentiesignaal is.
Om de inflammatoire immuunrespons tot een minimum de craniale venster implantatiechirurgie moet zo snel mogelijk en directe schade aan de hersenen worden uitgevoerd houden moet worden vermeden ten koste van alles. Van het grootste belang is dat de craniale venster implantaat blijft luchtdichte voor de gehele duur van het experiment met ontsteking voorkomen.
Om hersenen beweging te minimaliseren gerelateerd beeldvormingsartefacten zorg niet te beschadigen of teverwijder de dura mater tijdens de operatie. Resterende motoriek geïnduceerde hersenen beweging kan worden gecorrigeerd wanneer er beweging wordt beperkt tot het vlak evenwijdig aan het beeldvlak (de x / y-vlak). De maximaal toelaatbare standaarddeviatie van beweging in x / y is ongeveer 5 micrometer. Voor beweging langs de z-as is deze waarde ongeveer 1 urn, zodat de omvang van de beweging kleiner is dan de resolutiegrens van de microscoop.
De lage snelheid van de resonante scanner bij de scanpad ommekeer punten kan leiden tot lasergeïnduceerde weefselschade. Om dit te voorkomen, kan de laser worden geblokkeerd op de turnarounds met behulp van een blanker in de scan telescoop. Indien uitschakel correct is ingesteld en de gemiddelde laservermogen onder doelstelling wordt onder 50 mW gehouden, weergave kan voor langere tijd over meerdere dagen zonder enige zichtbare laserstraal beschadigingen. Een alternatieve methode om een mechanische blanking van de laser om een snelle Pockels cel om laservermogen te verminderen bij de turnarounds. Deze werkwijze heeft echter het nadeel dat Pockels cellen typisch ongewenste bundel vervormingen.
De aanleg van vaste kop knaagdieren om virtuele omgevingen te navigeren heeft het mogelijk gemaakt om de afbeelding populaties van cellen chronisch in cortex van muizen het uitvoeren van een breed scala aan gedrags-taken 3,4,6,22. Het is echter de moeite waard op te merken dat het hoofd-fixatie inherent dwingt gedrag en motoriek op een bolvormige loopband is in veel opzichten niet gelijk aan ongebreidelde motoriek of normaal gedrag.
In de toekomst zal de sterkte van de virtual reality imaging benadering hier beschreven waarschijnlijk de combinatie van calcium beeldvorming met gerichte optogenetic stimulatie tijdens gedrag. Hiermee zou het mogelijk zijn om optisch manipuleren presynaptische cellen en het imago van hun post-synaptische doelstellingen terwijl het toezicht op de daaruit voortvloeiende gedragsveranderingen. Bovendien, calcium indicatoren vrij in de cel diffunderenIk zal het ook mogelijk zijn om de activiteit selectief meten subcellulaire compartimenten tijdens gedrag. Door beweging geïnduceerde hersenen beweging, zijn dergelijke opnamen beperkt door de moeilijkheid om stabiele opnamen verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Friedrich Miescher Instituut voor Biomedisch Onderzoek, het Max Planck Society, en het Human Frontier Science Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
