Summary
ここでは、仮想現実環境での動作中のマウス皮質の2光子イメージングに関わる実験手順について説明します。
Abstract
それは行動1-6中に遺伝的に特定された細胞の活性の慢性的測定を可能にするように、近年では、2光子イメージングは、神経科学の非常に貴重なツールとなっています。ここでは、動物は仮想現実環境をナビゲートするときにマウスの皮質における二光子イメージングを実行するための方法を記載している。私たちは、明るく照らされた仮想環境内で動作して、動物におけるイメージングの鍵と実験手順の側面に焦点を当てる。我々はここでアドレスされ、この実験で発生する主要な問題：、脳の運動関連する成果物を最小限にするバーチャルリアリティ投影システムからの光漏れを最小限に抑え、レーザー誘導される組織の損傷を最小限に抑えることができます。また、仮想現実環境を制御し、瞳孔追跡を行うためにサンプルソフトウェアを提供しています。これらの手順とリソースを使えば、マウスを行動する際に使用するため、従来の2光子顕微鏡を変換することが可能でなければなりません。
Introduction
（遺伝子GCaMP5 7またはR-GECO 8、又はOGB又はFLUO4など合成染料のような符号化された）カルシウム指示薬の2光子イメージングは、マウス1-6挙動におけるニューロン活性を測定する強力な方法として登場した。それは、脳表面9,10の下約800ミクロンまでのほぼ単一の活動電位解像度での細胞の何百もの活性の同時測定を可能にします。さらに、遺伝的にコードされたカルシウム指示薬（GECIs）を用いたニューロンの活動は、慢性的に5,11,12を測定することができ、遺伝学的に定義された細胞型における13。一緒に、これらの方法は、生体内での神経計算の研究に新たな可能性の多くを開く時間的および空間分解能の程度を提供する。
外科的介入は、イメージングのためのマウス脳を露出させ、標識する必要がある。細胞は、通常、組換えアデノ随伴VIRを使用してトランスフェクトする GECI送達および頭蓋窓のためのボランティア（AAV）系は、脳への光学的アクセスを得るために注射部位上に移植される。ヘッドバーは、次いで、二光子顕微鏡下で、ヘッド固定用の頭蓋骨に取り付けられている。目を覚ましイメージングに関する問題のほとんどは準備中の不安定性に起因するとして、これらのステップの設計と実装は非常に重要です。理想的には、ここで説明する手順は、手術後数ヶ月までの慢性的なイメージングを可能にする必要があります。
2光子イメージングの際に視覚的に導かれた動作を有効にするには、ヘッド固定マウスが空気に座って、それが仮想現実環境をナビゲートするために使用できる球状のトレッドミルを、サポートしていました。トレッドミル上でのマウスの移動は、マウス14,15を囲むトロイダル画面上に表示される仮想環境内の動きに連結されている。このような運動、視覚刺激、及び瞳位置などの行動変数が06を記録することができる。
tは ">我々は仮想現実環境を探索したマウスの慢性2光子イメージングに関わる手順を説明し対処さのキーポイントは次のとおりです。運動アーチファクトの低減、光漏れの低減、同時に記録する細胞の数の最大化、および最小化光損傷。また、空気がサポートしているトレッドミル、瞳孔の追跡、および仮想現実環境の設定について詳しく説明します。ここで説明する手順は行動パラダイムの可能性のある多種多様なヘッドを固定したマウスにおいて、蛍光標識された細胞集団を画像化するために使用することができます。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
全ての動物手順は、認可されカントンバーゼルシュタットの獣医学科のガイドラインに従って実施した。
1。ハードウェアおよびソフトウェアのセットアップ
- 二光子顕微鏡のセットアップ：
- 照明光源（パルス幅<120フェムト秒）のようなパルス状の赤外線レーザーを使用してください。
- 8または12 kHzの共振スキャナおよび標準の検流計で構成されるスキャンヘッドを使用してください：これは750×400ピクセルで40または60Hzのフレームレートを可能にします。高フレームレートは、画像の歪みを誘発した脳の動きを最小限に抑えるために重要である。より高い信号の収率でさらに高速な共振スキャン結果および16および光毒性を退色低減します。
- 複数の深さで取得時間インタリーブ画像を順次ピエゾ電気高速のzステッパを使用注：これは、任意のフレームレートを犠牲にしてデータの収率を増加させるために使用される。
- AMを使用組織へのレーザー露光を減らすためechanicalブランカ。共振スキャナの振幅に応じて、ブランカの幅を調整注：原因レゾナントスキャナのスキャン·パスの正弦波特性により、レーザービームは、スキャン方向転換点での比較的遅い移動します。レーザー露光が最大であるこれらのターンアラウンド点における組織の損傷を防止するために、機械的なブランカは、レーザビーム走査を停止し、チューブレンズの焦点面との間に導入される。
- FPGAハイパスフィルタと画素にPMT信号をビン：データ収集のためのメモフィールド·プログラマブル·ゲート·アレイ（FPGA）と組み合わせた高速デジタイザ（800 MHz）を使用する。バンドパスフィルタにおけるPMT増幅結果FPGA上で効果的なローパスフィルター上のハイパスフィルタの組み合わせは、概ねレーザ（80メガヘルツ）の繰り返し率を中心。サンプルFPGAコードは、サプリメントとして提供される。
- Dombeckや同僚の設計に基づいて、空気がサポートしているトレッドミルのセットアップ2
- 少なくとも10mm、内径の空気供給管を用いて空気供給ラインにボールホルダーを接続する。ボールホルダ空気供給口の断面積を最大にし、主空気供給とボールホルダーとの間にチューブの十分な量を配置注増加断面および空気供給管の長さの増加は、ノイズの発生を低減する。
- カスタム設計と3D印刷のボールホルダーに発泡スチロールのボール（直径20cm）を配置します。
- 行動パラダイムにおいて、前方向（および逆方向）移動が必要な場合は、ボールの側面にピン（ 例えば 19gの皮下注射針）を挿入して横（ピッチ）軸とボールの動きを制限注意：一般的に動物はに適応この減速回転パラダイムにおけるより迅速にセットアップ。
- 1つまたは2つのコンピューターの光学式マウスを用いて、ボールの軌道運動それぞれ、2または3つの軸を中心に動きを検出することに注意してください：コンピュータのマウスは、理想的に画像化した少なくとも干渉赤外線ダイオードで動作する必要があります。
- 仮想現実環境のセットアップ
- 仮想現実環境を準備します（注）。Panda3D、自由に利用できるゲームエンジンに基づいてサンプル環境を、サプリメントとして提供されています。仮想環境のオブジェクトはWings3D、オープンソースの3Dモデラーを使用して生成されます。サンプルプログラムは、データ取得カードの位置情報を読み取り、仮想環境での移動にこれを変換する。コードは、トロイダルスクリーンに投影される環境に必要な非線形変換を実行します。トロイダル型スクリーンの詳細な構造は他14,17について説明した。
- 仮想環境を表示するためのLEDプロジェクターやLEDバックライトコンピュータの画面を使用してください。ゲーティングCIRを統合撮影時のLEDの迅速なちらつきのためCUIT 注：視覚刺激中2光子イメージングに内在する問題は、客観的に遮蔽することによって低減することができ、視覚的刺激システム、から発生する光漏れです。しかし、視覚刺激システムからの光漏れを完全に撮像中に視覚的な刺激のために使用されるLEDアリーナで行われているように、（データが取得されていない）、共振スキャナのターンアラウンドポイントにプロジェクターの光出力を同期させることにより廃止することができますショウジョウバエ 18。これは、視覚刺激およびデータ収集の有効高速交番（ 図2参照）をもたらす。フリッカ周波数（24 kHzの）は、ちらつきがもはや動物によって知覚されていない上に、フリッカー値以上の桁である。商用LEDプロジェクタに本変形例の電子回路図を図3に示す。
- 子犬ILの追跡
- 瞳位置追跡のためのCMOSベースのビデオカメラ（30 FPS）を使用します。カメラは赤外線カットフィルタが含まれていないことを確認してください。瞳孔は目を通って出る二光子励起レーザーからの迷光による録音時に高コントラストで表示されます。瞳位置および直径は、Sakataniとアイサ19の設計に基づいて、カスタムプログラムソフトウェアを用いてリアルタイムに抽出する。
2。遺伝的カルシウムインジケータとウィンドウインプラントの注入
以前に以下の追加で説明したようにカルシウム指示薬20と頭蓋窓21の注入の注入が実行されます。
- ウイルス溶液を充填し、圧力注入システムに接続されたガラス注入ピペットを用いて関心領域内にウイルスを注射する。ピペットに応じて圧力を調整インナー直径、通常は約70〜140ミリバール、1〜2分間かけてウイルス溶液約100 NLを注入する。低周波数で供給低容量噴射パルス（2 Hzで0.05秒パルス）が注射中にピペット沿っウイルスのオーバーフローを防止するために使用されるべき注：注入量を監視するために、ピペットは、小さなにマークすることができる均等立体顕微鏡下での長さ（ 例えば 、0.5ミリメートル）離間されている。マーキング間のメニスカスの変位は次いで、注入量を推定するために使用することができる。
- 数週間注射後は、これは約500μmの直径が密集標識された細胞の塊を生じるはずである。関心領域におけるGECI式の有効性GECIの選択とプロモーターの組み合わせだけでなく、使用される組換えAAVの感染力価および血清型に依存します（注）。とAAV2/1-EF1α-GCaMP5の代表例として、射出ウイルスTIT満足な表情でのマウスの結果の一次視覚野に8×10 12 GC / mlとERは約2週間は、注射（ 図1）を投稿してください。
- ヘッドバーは、マウスの視野を妨げないはずですが、行動の間に安定したイメージングを可能にするのに十分に剛性でなければなりません。これは、典型的には、（ 図1を参照）ヘッドバーの両側に2つの結合点を必要とする。しっかりと頭蓋骨にヘッドバーを取り付けるには、ヘッドバーが付いてしまいますさらさ頭蓋骨の面積を最大化し、乾燥させることを確認してください。さらに、メスまたはシリンジを使用し、それによって接着する表面積を増加浅溝を作成するために頭蓋骨を傷つける。歯科用セメントでヘッドバーを取り付ける前に、シアノアクリレート組織接着剤で骨をカバーしています。
3。実験手順
- ウイルス注射後2〜3週間、エピの下で明確さと表現のための頭蓋窓インプラントをチェック蛍光照明。表在血管の明瞭かつはっきりと定義された境界は、窓インプラント（ 図1参照） を撮像するのに適していることをよく示している。
- 測定したサンプルで50 mWの低い値にレーザーパワーを調整します。
- 球形トレッドミルへの気流をオンにします。
- 顕微鏡下で、ヘッド固定のために、簡単にストレスを減少させるためにイソフルランで動物を麻酔する。イソフルラン麻酔容器に動物を配置し、動物が（約10秒）を移動させる停止するまで待ちます。動物を取り外し、すぐに頭を顕微鏡下でそれを修正する。
- まだ動物へのアクセスを可能にするために、動物にできるだけ近いビジュアル·ディスプレイ·システムを配置します。少ない視認動物実験で、少ない動物は、実験の最初の段階の間になります強調している。
- 頭蓋窓のインプラントは埃や汚れのないことを確認します。水できれいに必要に応じて。
- 頭蓋窓と水浸対物レンズの間に液浸媒体として明確な超音波ゲルを適用します。これは、水の蒸発や漏れが遅い画像劣化の問題を解決し、水を保持するためにヘッドバーにコーンをマウントする必要性を軽減する注：遠心の使用前のゲルは、すべての気泡を除去し、空気を作成しないように注意するゲルの適用中に気泡。気泡が厳しく、画質を劣化させる可能性がある。
- 遮光のための客観的かつヘッドバーの周囲に黒いテープの一部を包む。
- その最終的な位置に仮想環境アリーナを移動し、瞳孔追跡のためのビデオカメラを調整します。
- 実験中に使用される走査振幅に合わせてレーザーブランカを設定します。
- データの記録を開始。
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Representative Results
GECIで標識された細胞集団の二光子カルシウムイメージングの画質が大きく頭蓋窓インプラントの品質に依存する。ウイルス注射の頭蓋窓を次の二週間は、明確にするために点検してください。何肉芽組織や骨の再成長見えた（ 図1A）があってはならない。また、表在血管のパターンが変更されないままべきであり、血管系の境界がはっきりと定義されるべきである。同時に、GECIの発現も確認することができます。標識された細胞の丸薬は、エピ蛍光顕微鏡（ 図1B）の下ではっきりと見えるはずです。
理想的には、製剤は、十分なマウスの運動によって誘導される二光子画像の歪みは、フレームの登録（ 図2）後の画像で見えないように安定である。レゾナントスキャナの走査経路は非線形画像歪が生じる正弦波である。 TU中にデータが原因でスキャン経路のこの部分の延伸イメージに取得されていない点をrnaround。視覚的な刺激システム、プロジェクターの現在のLEDの光源は、正しくターンアラウンドポイントにタイムアウトした場合には、光漏れは今回だけ（ 図2）の間には明らかなはずである。光源のちらつき周波数が倍走査周波数である必要があります。この作業を行うための鍵は、高速の立上りとLEDの立ち下がり時間、電子機器（ 図3）を制御している。
図1。2週間、手術後のマウスの固定の頭の中で頭蓋窓の上から見た図。動物の負担を軽減しつつ（A）は、ヘッドバーは、画像化実験の間、動作の安定性を高めるために重量や形状に最適化される。 T彼はバーはアルミニウムから作られ、1mmの厚さを有する向かう。スケールバーは5mmである。（B）約80 NLの4回の注射（AAV2/1-EF1α-GCaMP5）後GCaMP5式の落射蛍光画像。注入深さは約400μmである。スケールバーは1mmである。ヘッドバーの（C）の回路図。 MMですべての測定。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。光漏れを低減することにより、ノイズに信号を改善する。仮想現実環境のプロジェクターのLED光源は、データが記録されていない場合にのみ、スキャンの所要期間中にオンするように、共振スキャナに同期している（オレンジBOXES）。レーザブランカは、視覚刺激に起因する光漏れの影響を説明するために、この例の顕微鏡から除去した。画像（データの8秒の平均）はAAV2/1-EF1α-GCaMP5でトランスフェクションしたマウス視覚野で撮影されました。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3の電子機器の回路図は、従来のLEDプロジェクタちらつきするために使用される。ゲーティング回路が共振スキャナを用いた高速ちらつきを同期するためにTTL入力によって駆動される。 C1：コンデンサを1nF、D1、D2：ダイオード1N4148; INV1：インバータHEF40106（6の1が使用される）; LED1 - ビーマーのLEDが、R1：抵抗47Ω、R2：抵抗2.2kΩの、R 3：再sistor 100Ω、T1、T5、T6、T7：トランジスタIF9321、T2：トランジスタBC846; T3：トランジスタBC170; T4：トランジスタBC856。プロジェクターの（赤、緑、青）この回路は、すべての3つのカラーチャンネルごとに繰り返さなければならないことに注意してください。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
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Discussion
行動2光子イメージングの成功の鍵は、二つの方法で製剤の安定性です。
- ウィンドウ移植後日間にわたって、組織の炎症反応は、妨げたり、画像化を防ぐことができます肉芽組織や軟骨の形成の向上につながることができます。
- 実験中に脳が神経活動に関連する蛍光シグナルを破損からモーションアーチファクトを防ぐのに十分安定していなければならない。
最小限に炎症性免疫応答を維持するために頭蓋窓注入手術は、脳への可能性と直接的な被害はすべてのコストで避けなければならないほど迅速に行われるべきである。最も重要頭蓋窓のインプラントが炎症を防ぐために、実験の全期間のための気密のままであることを保証することである。
脳の動きを最小限にするために関連するイメージング·アーティファクトが損傷しないように注意して取るか手術中に硬膜を除去します。残りの運動によって引き起こされた脳の運動は、動きが撮像面に平行な面（x / y平面）に限定されているときに補正することができる。 X / Yの動きの最大許容標準偏差はおよそ5μmである。 z軸に沿った動きのために、この値は、移動の程度は、顕微鏡の解像限界よりも小さくなるように、略1μmである。
キャンパスターンアラウンドポイントで共鳴スキャナの低速は、レーザー誘起組織損傷につながることができます。これを防止するために、レーザ走査望遠鏡でブランカを使用してターンアラウンドで遮断することができる。このブランカが正しく設定され、対物下平均レーザパワーは50mWで以下に維持される場合、画像化は、任意の可視レーザ損傷を引き起こすことなく、複数日にわたる長期間ことが可能である。レーザの機械的ブランキングする別の方法は、turnarouでレーザパワーを減少させるために、高速ポッケルスセルを使用することであるNDS。しかしながら、この方法は、細胞が典型的に望ましくないビームの歪みを導入するポッケルスという欠点がある。
仮想環境をナビゲートするヘッド固定げっ歯類の適性により、行動タスク3,4,6,22の広い範囲を実行し、マウスの大脳皮質内の細胞の画像集団を慢性的にできるようになりました。しかし、それは頭の固定は、本質的に球状のトレッドミルでの行動や運動を制約することに注意することは価値があることは気ままな運動か、通常の動作と同じ多くの方法ではないです。
将来的には、ここで説明した仮想現実イメージングアプローチの強さは、おそらく行動中にターゲットを絞ったoptogenetic刺激によるカルシウムイメージングの組み合わせになります。これを用いると、結果として得られる行動の変化を監視しながら、光学的にシナプス前細胞と画像そのシナプス後のターゲットを操作することも可能であろう。また、カルシウム指示薬として自由CEL内に拡散lで、それはまた、行動中に細胞内コンパートメントにおいて選択的活性を測定することが可能となる。移動による誘発される脳の運動に、そのような記録は、安定した録画を得ることが困難で制限されています。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、生物医学研究のためのフリードリッヒミーシャー研究所、マックスプランク協会、およびヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
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