Summary
Her beskriver vi de eksperimentelle procedurer, der er involveret i to-foton-billeddannelse af muse cortex under opførsel i et virtual reality miljø.
Abstract
I de senere år har to-foton billeddannelse blevet et uvurderligt værktøj i neurovidenskab, da det giver mulighed for kronisk måling af aktiviteten af genetisk identificerede celler under adfærd 1-6. Her beskriver vi metoder til at udføre to-foton billeddannelse i mus cortex mens dyret navigerer et virtual reality miljø. Vi fokuserer på aspekter af de eksperimentelle procedurer, der er nøglen til billeddannelse i en opfører dyr i et klart oplyst virtuelt miljø. De vigtigste problemer, der opstår i denne forsøgsopstilling, at vi her adresse er: minimering hjernen motion relaterede artefakter, minimering lys lækage fra virtual reality projektion system og minimere laser vævsbeskadigelse. Vi leverer også prøve software til at styre virtual reality miljø og gøre elev tracking. Med disse procedurer og ressourcer bør det være muligt at konvertere en konventionel to-foton mikroskop til anvendelse i opfører mus.
Introduction
To-foton billeddannelse af calcium indikatorer (genetisk kodet ligesom GCaMP5 7 eller R-GECO 8 eller syntetiske farvestoffer som OGB eller Fluo4) er dukket op som en kraftfuld metode til måling af neuronal aktivitet i opfører mus 1-6. Det muliggør samtidig måling af aktiviteten af hundredvis af celler ved nær-enkelt virkningspotentiale opløsning, op til ca 800 um under hjernen overfladen 9,10. Desuden ved hjælp af genetisk indkodede calcium indikatorer (GECIs) kan måles, neuronal aktivitet kronisk 5,11,12, og i genetisk definerede celletyper 13.. Tilsammen udgør disse metoder giver en vis tidsmæssig og rumlig opløsning, der åbner op for en lang række nye muligheder i studiet af neuronal beregning in vivo.
Kirurgisk indgreb er nødvendigt for at afsløre og mærke musehjernen til billeddannelse. Celler er typisk transficeret under anvendelse af en rekombinant adeno-associeret vir (AAV) system til GECI levering og et kranie vindue os er implanteret over injektionsstedet for at få optisk adgang til hjernen. Et hoved bar derefter fastgjort til kraniet til hoved fiksering under to-foton mikroskop. Udformningen og gennemførelsen af disse trin er kritisk, da de fleste af problemerne med vågen billedbehandling opstår ustabilitet i præparatet. Ideelt den her beskrevne fremgangsmåde skal give mulighed for kronisk billeddannelse af op til flere måneder efter operationen.
For at aktivere visuelt guidet opførsel under to-foton billedbehandling, lederen fast musen sidder på en luft understøttet sfærisk løbebånd, som den kan bruge til at navigere en virtual reality miljø. Locomotion af musen på løbebåndet er koblet til bevægelse i det virtuelle miljø, der vises på en ringkerne skærm omgiver mus 14,15. Adfærdsmæssige variabler såsom bevægelse, visuel stimulus, og elev position kan optages 6.
t "> Vi beskriver involveret i kronisk to-foton billeddannelse i mus udforske et virtual reality miljø procedurer De vigtigste punkter behandles, er:. reduktion af bevægelsesartefakter, reduktion af lys lækage, maksimering af antallet af samtidigt optagede celler, og minimering af foto skader. Vi leverer også oplysninger om opsætning af luft-støttede løbebånd, elev tracking, og virtual reality miljø. De her beskrevne procedurer kan bruges til billeddannelse fluorescensmærkede cellepopulationer i hoved faste mus i en potentielt lang række adfærdsmæssige paradigmer .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle animalske procedurer blev godkendt og gennemført i overensstemmelse med retningslinjerne i Veterinary Department of Canton Basel-Stadt.
1.. Hardware og software Opsætning
- To-foton scanning mikroskop opsætning:
- Brug en pulseret infrarød laser som en belysningskilde (impulsbredde <120 fsec).
- Brug en scanning hoved bestående af en 8 eller 12 kHz resonant scanner og en standard galvanometer Bemærk:. Dette muliggør frame rates på 40 eller 60 Hz til 750 x 400 pixels. En høj frame rate er afgørende for at minimere hjernens bevægelse fremkaldt billede forvrængning. Desuden hurtig resonans scanning resulterer i en højere signal udbytte og reducerer fotoblegning 16 og fototoksicitet.
- Brug en Piezo-elektriske højhastigheds z-stepper sekventielt hente klokkeslæt sammenflettede billeder på flere dybder Bemærk:. Dette er valgfrit, og bruges til at øge data udbytte på bekostning af frame rate.
- Brug amekaniske Blanker at reducere laser eksponering vævet. Justere bredden af Blanker afhængig af amplituden af den resonante scanner Bemærk:. Grund sinusformet karakter af scanningen vej af en resonant scanner laserstrålen bevæger sammenligneligt langsom scan vendepunkter. For at undgå skader på vævet ved disse vendepunkter, hvor laser eksponering er størst, er en mekanisk blanker indført i brændplanet mellem scanning og rør linser, der stopper laserstrålen.
- Til dataopsamling bruge en høj hastighed digitizer (800 MHz) i kombination med en Field-Programmable Gate-Array (FPGA) Bemærk:. FPGA high-pass filtre og beholdere PMT signalet i pixels. Kombinationen af high-pass filter på FPGA og effektiv lavpasfilter på PMT forstærker resulterer i et båndpasfilter centreret omtrent omkring gentagelseshastighed på laseren (80 MHz). Prøve FPGA koden leveres som et supplement.
- Air-støttede løbebånd setup baseret på design af Dombeck og kolleger 2
- Slut bolden holder til en luftforsyning linje ved hjælp af en lufttilførselsrør på mindst 10 mm indvendig diameter. Maksimer tværsnit af bolden holder lufttilførsel indløb og placere rigelig mængde af slangen mellem hovedlufttilførslen og bolden holder Bemærk:. Øget tværsnit og øget længde af luftforsyningsslange reducerer støj generation.
- Placer en polystyrenskum bold (20 cm diameter) i et specialdesignet og 3D-printet kugle holder.
- Hvis adfærdsmæssige paradigme kræver kun fremad (og bagud) bevægelse, begrænse bevægelse af bolden til vandret (tonehøjde) akse ved at indsætte en stift (fx en 19 G kanyle) på siden af bolden Note:. Typisk dyr at tilpasse sig opsætningen meget hurtigere i denne reducerede rotation paradigme.
- Spor bevægelse af bolden ved hjælp én eller to optiske computermustil at opdage bevægelse omkring to eller alle tre akser, henholdsvis Bemærk:. De computermus bør ideelt operere med en infrarød diode til mindst interferens med billeddannelse.
- Setup virtual reality miljø
- Forbered virtual reality miljø Bemærk:. En prøve miljø baseret på Panda3D, en frit tilgængelig spilmotor, der er tilvejebragt som et supplement. Objekter af det virtuelle miljø er genereret ved hjælp Wings3D, et open source 3D-modelbygger. Prøven programmet læser position oplysninger om et datafangst kortet og oversætter dette i bevægelse i det virtuelle miljø. Koden også udfører den ikke-lineære transformation er nødvendig for miljøet, som skal projiceres på en ringkerne skærm. Den detaljerede konstruktion af ringkerne skærmen er blevet beskrevet andetsteds 14,17.
- Brug LED-projektorer eller LED-baggrundsbelyst computerskærme til visning af virtuelt miljø. Integrer en gating cirkreds til hurtig flimren lysdioder under billedbehandling Bemærk:. Et iboende problem i to-foton-billeddannelse under visuel stimulation er lys lækage stammer fra visuel stimulation system, som kan reduceres ved at beskytte mål. Dog kan lys lækage fra det visuelle stimulation systemet være fuldt afskaffet ved at synkronisere lyseffekten på projektoren til turnaround punkter i den resonante scanner (når data ikke er anskaffet), som er gjort med LED-arenaer, der anvendes til visuel stimulation under billedbehandling i Drosophila 18. Dette resulterer i en effektiv højhastigheds vekslen af visuel stimulering og dataopsamling (se figur 2). Den flimrende frekvens (24 kHz) er størrelsesordener over tærsklen flimmer fusion, over hvilken flimrende ikke længere opfattes af dyret. Den elektroniske kredsløbsdiagram af denne ændring til en kommerciel LED projektor er vist i figur 3..
- Pupil sporing
- Brug en CMOS-baseret video kamera (30 fps) for elev position tracking. Sørg for, at kameraet ikke indeholder en infrarød blokeringsfilter Bemærk:. Eleven er synlig ved høj kontrast under optagelserne på grund af falsk lys fra to-foton excitation laser ud gennem øjet. Elev position og diameter er udvundet i realtid ved hjælp af custom-programmerede software baseret på design af Sakatani og Isa 19..
2. Injektion af Genetisk Calcium Indikator og Window Implant
Indsprøjtning af en calcium-indikator 20 og implantation af kranie vindue 21 er udført som tidligere beskrevet med følgende tilføjelser:
- Injicer virus i området af interesse ved hjælp af et glas injektion pipette tilbagefyldt med virus-opløsning og forbundet til et tryk indsprøjtningssystemet. Justere trykket afhængigt af pipetten indrediameter, typisk ca. 70-140 mbar, at injicere cirka 100 nl af virus løsning i løbet af 1-2 min. Lav volumen injektion afgivne pulser ved lav frekvens (0,05 sek pulser ved 2 Hz) bør anvendes for at forhindre overløb af virus langs pipetten under injektion Bemærk:. For at overvåge injektionsvolumen kan pipetten blive markeret på små , jævnt fordelte længder (fx 0,5 mm) under et stereo mikroskop. Fortrængning af menisken mellem markeringerne kan derefter anvendes til at estimere det injicerede volumen.
- Adskillige uger efter injektion bør dette resultere i en bolus af tæt mærkede celler med en diameter på cirka 500 um. Effekt af GECI udtryk i regionen af interesse afhænger af valget af GECI og promotor kombination, samt den smittefarlige titer og serotype af det rekombinante AAV anvendte Bemærk:. Som et repræsentativt eksempel, injektion af AAV2/1-EF1α-GCaMP5 med en viral titis på 8 x 10 12 GC / ml i den primære visuelle cortex af en mus resulterer i tilfredsstillende ekspression på cirka to uger efter injektion (figur 1).
- Hovedet bar bør ikke hindre synsfeltet af musen, men bør være stift nok til at tillade stabil billeddannelse under adfærd. Dette kræver typisk to fastgørelsespunkter på hver side af hovedet bar (se figur 1). Til fast vedhæfte hovedet bar til kraniet, så sørg for at maksimere og tørre området af udsatte kraniet hvor hovedet bar vil blive knyttet. Derudover bruger en skalpel eller en sprøjte, ridse kraniet for at skabe overfladiske riller og derved øge overfladearealet til limning. Dæk knoglen med cyanoacrylat vævsklæbemiddel før du sætter hovedet bar med dental cement.
3. Forsøgsmetoden
- To til tre uger efter virus indsprøjtning, tjek kranie vindue implantat til klarhed og udtryk under epifluorescensbelysning. Klart synlige og skarpt definerede grænser for overfladiske blodkar er en god indikation af, at vinduet implantat er velegnet til billeddannelse (se figur 1).
- Mål og justere laser strøm til en værdi på under 50 mW ved prøven.
- Tænd for luftstrømmen til sfæriske løbebånd.
- For hoved fiksering under mikroskop, kortvarigt bedøver dyret med isofluran at reducere stress. Placer dyret i en isofluran anæstesi beholder og vente, indtil dyret ikke bevæger sig (ca. 10 sek.) Fjern dyret og umiddelbart hoved ordne det under mikroskop.
- Anbring det visuelle display systemet så tæt som muligt på dyret stadig mulighed for adgang til dyret. Jo mindre visuel kontakt dyret har med forsøgslederen, jo mindre stresset dyret vil være i den indledende fase af forsøget.
- Sørg kranie vindue implantatet er fri for støv og snavs. Rengør med vandhvis nødvendigt.
- Påfør klar ultralyd gel som immersionsmedium mellem kranie vindue og vand-fordybelse mål. Dette løser problemer med langsom billede nedbrydning på grund af vand fordampning eller lækage og mindsker behovet for at montere en kegle på hovedet bar for at holde vand Note:. Centrifuger gelen før brug for at fjerne alle luftbobler, og passe på ikke at skabe nogen luft bobler under påføring af gelen. Luftbobler kan alvorligt forringe billedkvaliteten.
- Wrap et stykke sort tape omkring målet og hoved bar for let afskærmning.
- Flyt det virtuelle miljø arena til sin endelige position og justere video kamera til elev sporing.
- Indstil laser Blanker at matche scanningen amplitude anvendes under forsøget.
- Start optagelse af data.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Billedkvaliteten i to-foton calcium imaging af cellepopulationer mærket med en GECI i høj grad afhænger af kvaliteten af det kranie vindue implantat. To uger efter virus indsprøjtning kranie vindue bør inspiceres for klarhed. Der bør ikke være granulationsvæv eller fornyet knoglevækst synlig (figur 1A). Desuden bør mønsteret af overfladiske blodkar forbliver uændret, og grænserne for vaskulaturen bør skarpt defineret. Samtidig kan GECI udtryk også kontrolleres. Boli mærkede celler skal være klart synlig under et epifluorescensmikroskop (figur 1B).
Ideelt præparatet er stabilt nok til, at forvridninger af de to-foton billeder fremkaldt ved bevægelse af musen er ikke synlige i billedet efter rammen registrering (figur 2). Scanningen sti resonante scanner er sinusformet resulterer i ikke-lineær forvrængning af billedet. Under turnaround point data ikke erhverves på grund af billedet strækker sig i denne del af scanningen sti. Hvis lyskilden af det visuelle stimulation systemet, her lysdioder projektor, er timet korrekt til vendepunkter, bør lys lækage kun være synlige i denne periode (Figur 2). Flimrende frekvens af lyskilden skal være det dobbelte af den scanning frekvens. Nøglen til at gøre dette arbejde er den hurtige stigning og falder tidspunkter af lysdioder og kontrollerende elektronik (Figur 3).
Figur 1. Ovenfra af et kranie vindue i et hoved fast mus to uger efter operationen. (A) Hovedet bar optimeres i vægt og form for at øge stabiliteten for adfærd under billeddannelse eksperimenter samtidig reducere byrden på dyret. Than hovedet bar er fremstillet af aluminium og har en tykkelse på 1 mm. Målestokken er 5 mm. (B) epifluorescence billede af GCaMP5 udtryk efter fire injektioner (AAV2/1-EF1α-GCaMP5) på ca 80 nl. Injektionen dybde er cirka 400 um. Målestokken er 1 mm. (C) Skematisk af hovedet bar. Alle mål i mm. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Forbedring signal til støj ved at reducere lys lækage. LED lyskilde i projektoren for virtual reality miljø er synkroniseret med den resonante scanner til at tænde kun under scanningen turnaround perioder, hvor dataene ikke er optaget (orange Boxes). Laseren Blanker blev fjernet fra mikroskopet for dette eksempel for at illustrere virkningen af det lys lækage som følge af visuel stimulation. Billedet (gennemsnit på 8 sekunder af data) blev taget i mus visuelle cortex transficeret med AAV2/1-EF1α-GCaMP5. Klik her for at se større billede.
Figur 3. Kredsløbsdiagram af elektronik anvendes til at blinke et konventionelt LED projektor. Gating kredsløb drives af et TTL-indgang til at synkronisere hurtigt flimmer med resonant scanner. C1: kondensator 1nF, D1, D2: dioder 1N4148, INV1: Inverter HEF40106 (1 af 6 benyttes) LED1 - LED af projektor, R1: modstand 47 Ω, R2: modstanden 2.2 kohm, R3: resistor 100 Ω, T1, T5, T6, T7: transistorer IF9321, T2: transistor BC846, T3: transistor BC170, T4: transistor BC856. Bemærk at dette kredsløb skal gentages for alle tre farvekanaler (rød, grøn, blå) i projektoren. Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøglen til succes for adfærdsmæssige to-foton imaging er stabiliteten af præparatet på to måder:
- I løbet af dage efter vindue implantation kan inflammatoriske reaktioner i vævet føre til en forbedring af dannelsen af granulationsvæv og brusk, som vil hæmme eller endog forhindre billeddannelse.
- Under eksperimentet har hjernen at være stabil nok til at forhindre bevægelsesartefakter fra korrumperende neurale aktivitet relateret fluorescens signal.
For at holde svar på et minimum kranie vindue implantering skal udføres så hurtigt som muligt og direkte skader på hjernen inflammatoriske immun bør undgås for enhver pris. Af afgørende betydning er at sikre, kranie vindue implantat forbliver lufttæt for hele varigheden af eksperimentet for at forhindre inflammation.
For at minimere hjerne bevægelse relateret billeddannelse artefakter passe på ikke at beskadige ellerFjern dura mater under operationen. Resterende bevægelse induceret hjerne bevægelse kan korrigeres for, når bevægelse er begrænset til et plan parallelt med afbildningsplanet (X / Y-planet). Den maksimale tolerable standardafvigelse af bevægelse i x / y er omtrent 5 um. For bevægelse langs z-aksen denne værdi er omkring 1 um, således at omfanget af bevægelsen er mindre end den opløsning grænse for mikroskopet.
Den lave hastighed resonant scanner på scan sti vendepunkter kan føre til laser vævsbeskadigelse. For at forhindre dette, kan laseren blokeres omvendingerne hjælp af en blanker i scanningen teleskop. Hvis dette Blanker er indstillet korrekt og gennemsnitlig lasereffekt under målet holdes under 50 mW, billedbehandling er muligt for længere perioder over flere dage uden at forårsage nogen synlig laser skader. En alternativ fremgangsmåde til en mekanisk blanking af laseren er at bruge en hurtig Pockets celle at reducere laserenergi på turnarouNDS. Denne fremgangsmåde har imidlertid den ulempe, at pockels celler typisk indfører uønskede beam forvridninger.
Egnethed hoved fast gnavere til at navigere virtuelle miljøer har gjort det muligt at kronisk billede populationer af celler i cortex af mus, der udfører en bred vifte af adfærdsmæssige opgaver 3,4,6,22. Det er dog værd at bemærke, at hoved-fiksering i sagens natur begrænser adfærd og bevægelse på en sfærisk løbebånd er på mange måder ikke svarer til uhæmmet bevægelse eller normal adfærd.
I fremtiden vil styrken af den virtuelle virkelighed imaging tilgang beskrives her sandsynligvis være kombinationen af calcium imaging med målrettet optogenetic stimulation under opførsel. Med dette ville det være muligt at optisk manipulere præsynaptiske celler og billedfiler deres postsynaptiske mål under overvågning af de resulterende adfærdsændringer. Hertil kommer, calcium indikatorer frit diffundere i cell, vil det også være muligt at måle aktivitet selektivt i subcellulære rum under adfærd. På grund af bevægelse induceret hjernen bevægelse, har sådanne optagelser blevet begrænset af vanskeligheden ved at opnå stabile optagelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Friedrich Miescher Institut for biomedicinsk forskning, Max Planck Society, og Human Frontier Science Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips (diameter = 3-5 mm) | Menzel | window implant | |
| InSight DeepSee laser | Spectra-Physics | microscope | |
| 12 kHz Resonance scanner | Cambridge Technology | G1-003-30026 | microscope |
| Galvometer | Cambridge Technology | G6215H | microscope |
| Digitizer | National Instruments | NI 5772 | microscope |
| FPGA | National Instruments | PXIe 7965R | microscope |
| Acquisition card | National Instruments | PCIe 6363 | microscope |
| Emission filter 525/50 | Semrock | FF03-525/50-25 | microscope |
| Piezo-electric z-drive | Physikinstrumente | P-726.1CD | microscope |
| Controller for Piezo-electric drive | Physikinstrumente | E665 LVPZT | microscope |
| Objective 16X, 0.8NA | Nikon | CFI75 | microscope |
| Current amplifier | Femto | DHPCA-100 | microscope |
| Photomultiplier tube | Hamamatsu | microscope | |
| USB Camera without IR filter | ImagingSource | DMK22BUC03 | pupil tracking |
| Objective 50 mm | ImagingSource | M5018-MP | pupil tracking |
| Macro adapter rings | ImagingSource | LAexSet | pupil tracking |
| Optical computer mouse | Logitech | G500 | motion tracking |
| Styrofoam ball 20 cm | e.g. idee-shop.de | 08797.00.15 | virtual environment |
| LED projector | Samsung | SP-F10M | virtual environment |
| Acquisition card | National Instruments | NI 6009 | virtual environment |
| Panda3D game engine | www.panda3d.org | virtual environment | |
| Numpy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| Scipy library for Python | www.scipy.org | virtual environment | |
| NI-DAQmx driver | National Instruments | www.ni.com | virtual environment |
| Ultrasound gel | Dahlhausen | 5701.0342.10 | imaging |
References
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A Miniature Head-Mounted Two-Photon MicroscopeHigh-Resolution Brain Imaging in Freely Moving Animals. Neuron. 31 (6), 903-912 (2001).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13 (11), 1433-1440 (2010).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7395), 62-68 (2012).
- Huber, D., Gutnisky, D. A. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Keller, G. B., Bonhoeffer, T., Hübener, M. Sensorimotor mismatch signals in primary visual cortex of the behaving mouse. Neuron. 74 (5), 809-815 (2012).
- Akerboom, J., Chen, T. -W. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. J. Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Zhao, Y., Araki, S. An expanded palette of genetically encoded Ca2+ indicators. Science. 333 (6051), 1888-1891 (2011).
- Mittmann, W., Wallace, D. J. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nat. Neurosci. 14 (8), 1089-1893 (2011).
- Katona, G., Szalay, G. Fast two-photon in vivo imaging with three-dimensional random-access scanning in large tissue volumes. Nat. Methods. 9 (2), 201-208 (2012).
- Mank, M., Santos, A. F. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nat. Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Margolis, D. J., Lütcke, H. Reorganization of cortical population activity imaged throughout long-term sensory deprivation. Nat. Neurosci. 15 (11), 1539-1546 (2012).
- Zariwala, H. A., Borghuis, B. G. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. J. Neurosci. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).
- Hölscher, C., Schnee, A., Dahmen, H., Setia, L., Mallot, H. A. Rats are able to navigate in virtual environments. J. Exp. Biol. 208, 561-5519 (2005).
- Borlinghaus, R. T. MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching). Microsc. Res. Tech. 69 (9), 689-692 (2006).
- Reiff, D. F., Plett, J., Mank, M., Griesbeck, O., Borst, A. Virtual Reality for Mice, mousevr.blogspot.com. Nat. Neurosci. 13, 973-978 (2010).
- Sakatani, T., Isa, T. Quantitative analysis of spontaneous saccade-like rapid eye movements in C57BL/6 mice. Neurosci. Res. 58, 324-331 (2007).
- Golshani, P., Portera-Cailliau, C. In vivo 2-photon calcium imaging in layer 2/3 of mice. J. Vis. Exp. (13), (2008).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Schmidt-Hieber, C., Häusser, M. Cellular mechanisms of spatial navigation in the medial entorhinal cortex. Nat. Neurosci. 16 (3), 325-331 (2013).
