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Chemistry

माइक्रोवेव की सहायता पाली के functionalization (इथाइलीन ग्लाइकॉल) और चैन Polymerizations और hydrogel संरचना में प्रयोग के लिए राल पेप्टाइड्स

Published: October 29, 2013 doi: 10.3791/50890
Automatic Translation
1, 2, 1,2,3
1Department of Biomedical Engineering, University of Rochester, 2Department of Chemical Engineering, University of Rochester, 3Center for Musculoskeletal Research, University of Rochester Medical Center

Summary

इस वीडियो श्रृंखला polymerizations और हाइड्रोजेल संश्लेषण को सक्षम करने, पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) methacrylate के लिए एक तेजी से, कुशल विधि समझाना होगा. यह इसी तरह, functionalization दक्षता का आकलन निवारण और उन्नत संशोधन के लिए सुझाव प्रदान करते हैं, और ठेठ हाइड्रोजेल लक्षण वर्णन तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए पेप्टाइड्स, विस्तार आम विश्लेषणात्मक तरीकों में methacrylamide functionalities पेश करने के लिए प्रदर्शन करेंगे.

Abstract

पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) (खूंटी) हाइड्रोजेल गठन में macromers का उपयोग करने के लिए मुख्य लाभ में से एक कृत्रिम चंचलता है. खूंटी आणविक भार और विन्यास की एक विशाल विविधता से आकर्षित करने की क्षमता (एआरएम संख्या, लंबाई हाथ, और शाखाओं में बंटी पैटर्न) हाइड्रोजेल संरचनाओं और यंग मापांक और जाल आकार सहित गुण, जिसके परिणामस्वरूप अधिक शोधकर्ताओं तंग नियंत्रण देता है. इस वीडियो पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) dimethacrylate (PEGDM) में खूंटी व्यापारियों methacrylate के लिए एक तेजी से, कुशल, विलायक मुक्त, माइक्रोवेव की सहायता विधि समझाना होगा. इस कृत्रिम विधि दवा वितरण और पुनर्योजी चिकित्सा में अनुप्रयोगों के लिए बहुत जरूरी शुरू सामग्री प्रदान करता है. यह अभिकर्मकों और विलायकों की छोटी मात्रा का उपयोग काफी तेजी से और सरल, साथ ही और अधिक किफायती और पर्यावरण के अनुकूल है के रूप में प्रदर्शन किया विधि पारंपरिक methacrylation तरीकों से बेहतर है. हम यह भी राल methacr के लिए इस तकनीक का एक अनुकूलन प्रदर्शन करेंगेपेप्टाइड्स के ylamide functionalization. इस पर राल विधि पेप्टाइड्स के एन टर्मिनस से पहले राल से deprotection और दरार को methacrylamide समूहों के साथ क्रियाशील होने के लिए अनुमति देता है. प्रतिक्रियाशील ओर समूह (लाइसिन की जैसे प्राथमिक amine, सेरीन का प्राथमिक शराब, threonine के माध्यमिक एल्कोहल, और tyrosine के फिनोल) के साथ अमीनो एसिड functionalization रोकने, संरक्षित जबकि इस पेप्टाइड्स के एन टर्मिनी को methacrylamide समूहों के चुनिंदा इसके लिए अनुमति देता है कई स्थलों पर. यह आलेख विस्तार होगा आम विश्लेषणात्मक तरीकों; functionalizations की क्षमता का आकलन करने के लिए (प्रोटॉन परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी (एच एनएमआर) और मैट्रिक्स उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री की लेजर desorption ionization समय (MALDI-TOF) असिस्टेड). आम नुकसान और समस्या निवारण के तरीकों का सुझाव दिया है आगे धुन macromer कार्यक्षमता के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो तकनीक और जिसके परिणामस्वरूप हाइड्रोजेल की इच्छा संशोधनों के रूप में संबोधित किया जाएगा भौतिक और रासायनिकगुण. विशेष ध्यान हाइड्रोजेल कठोरता और दवा रिहाई को नियंत्रित करने, जाल आकार को प्रभावित करने के लिए हाइड्रोजेल रचना को संशोधित करने के लिए भुगतान के साथ दवा वितरण और सेल सामग्री बातचीत के अध्ययन के लिए hydrogels के गठन के लिए संश्लेषित उत्पादों के उपयोग, प्रदर्शन किया जाएगा.

Introduction

पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) (खूंटी) हाइड्रोजेल पुनर्योजी चिकित्सा और दवा वितरण अनुप्रयोगों 1-3 में इस्तेमाल आम biomaterials हैं. इन hydrogels अन्य biomaterials से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं. खूंटी हाइड्रोजेल जैसे उनके प्राकृतिक biomaterial समकक्षों 1 की तुलना में लोच और गिरावट की दर के मापांक के रूप में इंजीनियरिंग गुणों पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री की पेशकश, सिंथेटिक हैं. वे कृत्रिम रूप से प्राप्त कर रहे हैं के रूप में, खूंटी स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न सामग्री 4 बनाम काफी कम बैच को बैच परिवर्तनशीलता है. खूंटी के रासायनिक संरचना के कारण, इन हाइड्रोजेल अत्यधिक हाइड्रोफिलिक प्रोटीन सोखना के लिए प्रतिरोधी है, और 3 biocompatible रहे हैं. प्रोटीन सोखना के लिए यह प्रतिरोध खूंटी हाइड्रोजेल विशिष्ट जैविक या रासायनिक कारकों (ड्रग्स, biomolecules, सेल आसंजन पेप्टाइड्स, आदि) और विशिष्ट भूमिकाओं इन वास्तविक पूछताछ और अध्ययन करने के लिए शोधकर्ताओं को सक्षम करने, एक 'खाली स्लेट' के रूप में कार्य करने की अनुमति देता हैरुपए सेल और / या ऊतक व्यवहार को नियंत्रित करने में खेलते हैं.

चित्रा 1
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चित्रा 1:.... पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) (खूंटी) आर्किटेक्चर एक साथ एक hexaglycerol कोर डी) 8 हाथ खूंटी के साथ एक pentaerythritol कोर सी 8) हाथ खूंटी के साथ एक) रैखिक खूंटी बी) 4 हाथ खूंटी के उदाहरण कोर tripentaerythritol. n खूंटी की संख्या प्रत्येक हाथ पर दोहराता है. प्रत्येक दोहराने इसलिए, 44 जी / मोल के एक आणविक वजन n है समग्र आणविक वजन और संरचना / बांह # से गणना की जा सकती.

खूंटी व्यापारियों आर्किटेक्चर और आणविक वजन की एक किस्म के साथ उपलब्ध हैं (चित्रा 1 ). वास्तुकला एआरएम (#) अलग और खूंटी के इथाइलीन ग्लाइकॉल दोहराता (एन) इन macromers से गठित हाइड्रोजेल नेटवर्क के गुणों को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. असंशोधित खूंटी polymerizations, पूर्व हाइड्रोजेल नेटवर्क के गठन के लिए खूंटी हाइड्रोजेल, के लिए सबसे अधिक कार्यरत crosslinking रणनीति के माध्यम से सहसंयोजक crosslinking की सुविधा के लिए एक वैकल्पिक कार्यशीलता के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए जो टर्मिनल हाइड्रॉक्सिल समूहों में शामिल है. Polymerization और नेटवर्क crosslinking (acrylate, methacrylate, vinyl ईथर, norbornene, आदि) की सुविधा के लिए खूंटी macromers में शामिल किया जा सकता है, जो रासायनिक समूहों की एक किस्म है. कदम और चेन वृद्धि (या दो, मिश्रित मोड का मिश्रण): crosslinking की सुविधा के लिए उपलब्ध टर्मिनल functionalities की विविधता के बावजूद, polymerization हो सकता है जिसके द्वारा केवल दो यांत्रिकी हैं.

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चित्रा 2:.. क्षेत्रों और इस तरह के छोरों, unreacted व्यापारियों, और स्थायी उलझनों के रूप में वृद्धि नेटवर्क nonidealities crosslinking घने पाली (methacrylate) युक्त विषम नेटवर्क में सैद्धांतिक हाइड्रोजेल नेटवर्क योजनाबद्ध ए) पारंपरिक श्रृंखला विकास polymerization परिणाम बी) कदम से विकास polymerization के परिणामों में काफी अधिक सजातीय नेटवर्क संरचनाओं (पैमाने पर नहीं).

चेन विकास polymerization के माध्यम crosslink functionalities जो एक अतिरिक्त crosslinker की उपस्थिति की आवश्यकता नहीं है. हालांकि, चेन polymerized हाइड्रोजेल घने crosslinking क्षेत्रों (2A चित्रा) 1 युक्त विषम नेटवर्क संरचनाओं का निर्माण. इसके विपरीत, कदम दर वृद्धि polymerization requi मेंखूंटी macromers के टर्मिनल कार्य समूहों के साथ प्रतिक्रियाशील है जो एक crosslinker या सह मोनोमर का उपयोग रेस. खूंटी पर टर्मिनल कार्य समूहों केवल crosslinker के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं और crosslinker केवल खूंटी पर टर्मिनल कार्य समूहों के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, यह अधिक से अधिक नेटवर्क संरचना एकरूपता (चित्रा 2 बी) में यह परिणाम है 1. कदम विकास polymerizations भी आम तौर पर घुलनशील, अनिगमित macromers 1 की वजह से प्रतिरक्षा / भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के लिए unreacted व्यापारियों और संभावित की मात्रा कम, कार्य समूहों की उच्च रूपांतरण के लिए नेतृत्व. मिश्रित मोड polymerization के तरीकों में भी (चेन विकास) स्वयं प्रतिक्रिया और एक crosslinker (सौतेली विकास) के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं कि दोनों macromers के उपयोग के माध्यम से दोनों कदम और चेन विकास polymerization कि गठबंधन विकसित किया गया है. यह प्रत्येक polymerization तंत्र की विशेषताओं के साथ हाइड्रोजेल का उत्पादन है, और अधिक जटिल, विविध नेटवर्क संरचनाओं का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या तो सेकदम या अकेले 1 चेन विकास नेटवर्क.

खूंटी functionalize और हाइड्रोजेल गठन की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो कार्य समूहों के ढेर सारे हैं, methacrylates और norbornenes क्रमशः सबसे आम चेन और कदम विकास polymerization moieties की कुछ कर रहे हैं. इन functionalities के दोनों नेटवर्क polymerization से अधिक उत्कृष्ट spatiotemporal नियंत्रण प्रदान करते हैं, और कोशिकाओं encapsulate करने के लिए इस्तेमाल करते हैं, तो इन नेटवर्कों उच्च समग्र सेल survivability 5-7 का समर्थन है. श्रृंखला polymerization के माध्यम से functionalized खूंटी (PEGDM) Crosslink dimethacrylate और acrylate-,-methacrylate, या इसी तरह क्रियाशील biomolecules 5,6 साथ सह polymerization के माध्यम से biomolecules या अन्य कारकों का समावेश के लिए अनुमति देता है. PEGDM हाइड्रोजेल ऐसे acrylate क्रियाशील खूंटी (PEGDA) के रूप में वैकल्पिक चेन विकास polymerization प्रणालियों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ है. पारंपरिक तरीकों का उपयोग, PEGDA PEGDM से अधिक तेजी से संश्लेषित किया जा सकता है, होwever, माइक्रोवेव की सहायता संश्लेषण का उपयोग कर, PEGDM संश्लेषण भी अधिक कुशल है. PEGDA अक्सर रात भर 8 या 24 घंटे 9 प्रतिक्रियाओं में संश्लेषित है, लेकिन यह भी ऊंचा तापमान 10 से कम चार घंटे में संश्लेषित किया जा सकता है. PEGDM भी परंपरागत रूप से कुछ तरीकों 4 दिन से 12 प्रतिक्रिया समय देने के साथ रातोंरात 11 प्रतिक्रिया द्वारा या 24 घंटे 5 संश्लेषित है. यहाँ का प्रदर्शन माइक्रोवेव की सहायता विधि का प्रयोग, PEGDM एक 5 मिनट की प्रतिक्रिया में उत्पादन किया जा सकता है. PEGDM PEGDA 13 की तुलना में धीमी प्रतिक्रिया कैनेटीक्स है, PEGDM के लिए crosslinking प्रतिक्रिया मिनट में होने वाली है, अभी भी तेजी से है, और इस तरह की संभावना बढ़ रही है, methacrylate समूह समाधान में कार्यात्मक समूह एकत्रीकरण बढ़ जाती है की वृद्धि हुई hydrophobicity रूप PEGDA से अधिक macromer रूपांतरण प्राप्त होता है कट्टरपंथी हस्तांतरण और methacrylate रूपांतरण 14. PEGDM हाइड्रोजेल भी वृद्धि हुई सेलुलर व्यवहार्यता और विकास के रूप में के साथ जुड़े रहे हैंकारण कट्टरपंथी एकाग्रता और 14 वर्तमान unreacted macromers कम कर देता है जो किसी भी समय, पर प्रतिक्रिया की दर में कमी की संभावना PEGDA हाइड्रोजेल, की तुलना में. इस तरह के कदम से विकास polymerization के माध्यम norbornene-क्रियाशील खूंटी (PEGN) फार्म हाइड्रोजेल का उपयोग करने वालों, और PEGN के उपयोग और अधिक से अधिक दो कार्य समूहों की एक औसत होते हैं कि एक crosslinker की आवश्यकता के रूप में thiol-ene polymerizations. Thiyl कण सिस्टीन अमीनो एसिड functionalities 7 के साथ पेप्टाइड्स के सुगम समावेश के लिए अनुमति norbornene कार्बन कार्बन डबल बांड, बहु thiol युक्त crosslinkers सामान्यतः PEGN हाइड्रोजेल crosslink करने के लिए उपयोग किया जाता है, के साथ प्रतिक्रिया के बाद. कदम से विकास polymerization के माध्यम से प्रतिक्रिया है, जो कई अन्य chemistries जबकि वहाँ (जैसे thiol-acrylate 15 और thiol-Vinyl sulfone 16 के रूप में माइकल के अलावा प्रतिक्रियाओं, ऐसे alkyne-azide 17 आदि के रूप में प्रतिक्रियाओं "क्लिक"), thiol-norbornene हाइड्रोजेल हैं बहुत ही सामान्य, तनाव रूप सेnorbornene अंगूठी काफी प्रतिक्रिया की दर बढ़ जाती है और norbornene डबल बांड के दौर से गुजर श्रृंखला polymerization 7 का मौका कम हो जाती है.

हाइड्रोजेल गठन की सुविधा के लिए methacrylate, norbornene, या वैकल्पिक functionalization के बीच निर्णय काफी हद तक दृष्टिकोण पर आधारित है. उदाहरण के लिए, चेन विकास polymerized PEGDM नेटवर्क के रूप में अच्छी तरह से प्रदर्शन किया एक ऊतक इंजीनियर periosteum 18,19 के विकास में सेल स्थानीयकरण को नियंत्रित करने के लिए अनुकूल किया गया है. कदम विकास polymerized खूंटी नेटवर्क की वजह से thiol (सिस्टीन) पेप्टाइड्स युक्त का उपयोग एंजाइम सब्सट्रेट दृश्यों का समावेश की आसानी के लिए, enzymatically उत्तरदायी हाइड्रोजेल गिरावट की सुविधा के लिए पेप्टाइड दृश्यों का समावेश के लिए बेहतर अनुकूल हैं और functionalized macromers 20 norbornene. अनुसंधान प्रश्न सबसे अच्छा कदम विकास hydrogels के उपयोग के द्वारा संबोधित किया जाएगा, फेयरबैंक्स एट अल. Norbor का विस्तृत विवरण प्रदान करता हैखूंटी 7 नेने functionalization रणनीति. इस पत्र में विस्तार होगा कैसे खूंटी और पेप्टाइड दृश्यों (खूंटी के लिए एक methacrylate साथ, और पेप्टाइड्स के लिए एक methacrylamide) क्रियाशील श्रृंखला polymerization प्रतिक्रियाओं के लिए किया जा सकता है.

परंपरागत रूप से, PEGDM dichloromethane में methacryloyl क्लोराइड और triethylamine के साथ खूंटी प्रतिक्रिया द्वारा निर्मित है. प्रतिक्रिया निस्पंदन, Diethyl ईथर में वर्षा, और संग्रह से पहले 4 दिनों से 12 प्रतिक्रिया समय का विस्तार कुछ तरीकों के साथ कमरे के तापमान रातोंरात 11 या 24 घंटे 5 के लिए प्रगति के लिए अनुमति दी है. इस दृष्टिकोण के कई रूपों मौजूद हैं, सब, समय लेने वाली हैं रासायनिक संश्लेषण उपकरण का एक बड़ा सरणी की आवश्यकता होती है, और वे उच्च शुद्धता अभिकर्मकों और विलायक की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा का उपयोग शामिल है, के रूप में पर्यावरण के अनुकूल नहीं हैं. इन सीमाओं को नाकाम करने के लिए, लिन गिब्सन एट अल. ते साथ खूंटी functionalize करने के लिए एक माइक्रोवेव की सहायता, विलायक मुक्त विधि विकसित rminal methacrylate समूह (चित्रा 3) 12. इस प्रतिक्रिया में, खूंटी के टर्मिनल शराब समूह एक carboxyl के लिए फार्म methacrylic एनहाइड्राइड की कार्बोनिल परमाणुओं में से एक के साथ प्रतिक्रिया. यह एक पक्ष उत्पाद के रूप में methacrylic एसिड के साथ, PEGDM उत्पाद उत्पन्न करता है. इस संश्लेषण कम प्रतिक्रिया समय और विलायक मुक्त संश्लेषण तरीकों 21 सहित माइक्रोवेव संश्लेषण की विशेषता फायदे के कई गया है. माइक्रोवेव संश्लेषण यह काफी तेजी से होता है, जैसा कि पहले चर्चा के तरीकों के लिए बेहतर है कम व्यापक संश्लेषण उपकरण (जैसे कांच के बने पदार्थ, प्रतिक्रिया प्लेटों) की आवश्यकता है, और विलायकों केवल उत्पाद शुद्धि / संग्रह और नहीं के लिए के लिए आवश्यक हैं के रूप में कम समग्र अभिकर्मक और विलायक मात्रा का उपयोग करता है संश्लेषण, इसे और अधिक किफायती और पर्यावरण के अनुकूल बना रही है.

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चित्रा 3:.. Functionalization schematics ए) पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) के गठन, पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) methacrylate बी) यह वही विधि पेप्टाइड दृश्यों के एन टर्मिनस functionalize करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निर्माण करने के लिए 10x दाढ़ अतिरिक्त methacrylic एनहाइड्राइड के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है एक functionalized पेप्टाइड methacrylamide. पूर्व राल से पेप्टाइड cleaving करने के लिए इस प्रक्रिया का प्रदर्शन करके, एन टर्मिनस के चुनिंदा functionalization अमीनो एसिड पक्ष समूहों संरक्षित रहने के रूप में किया जा सकता है. N: खूंटी की संख्या (2 के लिए, क्रमश: = 45.5, 227 और 455 N 10, और 20 केडीए रैखिक खूंटी प्रयुक्त) macromer में दोहराता है. R1 आर.एन. को: अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखला. PGN को PG1: समूहों की रक्षा पक्ष श्रृंखला. TFA: trifluoroacetic एसिड. टिप्स: triisopropylsilane. DODT: 3,6-dioxa-1, 8-octanedithiol. एच 2 ओ: पानी.

माइक्रोवेव की सहायता methacrylation विधि हाल ही में पॉलिमर और polymeric नेटवर्क की एक किस्म में पेप्टाइड समावेश की सुविधा के लिए methacrylamide समूह (3B चित्रा) के साथ पेप्टाइड्स के एन टर्मिनस functionalize करने के लिए हमारे समूह द्वारा रूपांतरित किया गया है. इस प्रतिक्रिया में, पेप्टाइड एन टर्मिनस के प्राथमिक amine एक एमाइड के लिए फार्म methacrylic एनहाइड्राइड पर कार्बोनिल परमाणु के साथ प्रतिक्रिया करता है. यह एक पक्ष उत्पाद के रूप में उत्पादित methacrylic एसिड के साथ, methacrylamide functionalized पेप्टाइड उत्पन्न करता है. पेप्टाइड दृश्यों के एन टर्मिनस functionalize करने के लिए इस प्रक्रिया का उपयोग करते हैं, तो यह प्रतिक्रियाशील पक्ष श्रृंखला (प्राथमिक AMINES (लाइसिन), एल्कोहल (सेरीन, threonine), और फिनॉल (tyrosine)) युक्त एमिनो एसिड functionalization दौरान रक्षा कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है, और रक्षा समूह केवल methacrylamide समावेश के बाद चिपके रहते हैं.

यह लेख इन microw के दोनों प्रदर्शन करेंगेPEGDM synthesize और पर राल पेप्टाइड दृश्यों functionalize, आम नुकसान पर प्रकाश डाला और समस्या निवारण के तरीकों का सुझाव करने के तरीकों एवेन्यू की सहायता की. इस अनुच्छेद में, आमतौर पर उत्पाद functionalization का आकलन करने के लिए नियोजित विश्लेषणात्मक रसायन तकनीक प्रदर्शन करने के तरीकों विस्तृत किया जाएगा, और अधिक उन्नत संशोधनों के प्रदर्शन के लिए सुझावों और संसाधनों के लिए दिया जाएगा. विशिष्ट परिणाम, हाइड्रोजेल नेटवर्क फार्म को संश्लेषित PEGDM का उपयोग कर एक मॉडल दवा की रिहाई को नियंत्रित करने के लिए गठित हाइड्रोजेल का शोषण, और सेल हाइड्रोजेल बातचीत की सुविधा के लिए functionalized पेप्टाइड्स रोजगार शामिल हैं, जो प्रदर्शन किया जाएगा. विशेष रूप से ध्यान हाइड्रोजेल जाल आकार निस्र्पक और हाइड्रोजेल रचना बारी में ऐसी कठोरता और दवा रिलीज प्रोफाइल के रूप में थोक सामग्री के गुणों को नियंत्रित करता है जो इस अंतर्निहित भौतिक संपत्ति, को प्रभावित करने के लिए देखते जा सकता है कि कैसे पर चर्चा करने के लिए भुगतान किया जाएगा.

Protocol

1. PEGDM की माइक्रोवेव की सहायता संश्लेषण

  1. पानी के साथ प्रदूषण को रोकने के लिए, पूर्व ड्राई सभी कांच के बने पदार्थ 1 घंटे के लिए एक ओवन (> 60 डिग्री सेल्सियस) में इस्तेमाल किया जा रहा है.
    नोट: आवश्यक कांच के बने पदार्थ शामिल हैं: दो 100 मिलीलीटर बीकर, एक 250 मिलीलीटर बीकर, 3 spatulas, एक 250 मिलीलीटर BUCHNER फ्लास्क, एक 7 सेमी BUCHNER कीप, एक 10 सेमी घड़ी का शीशा.
  2. बाद में, एक बीकर में डालने के लिये एक घड़ी का शीशा साथ बीकर को कवर, और बर्फ से भरा एक recrystallization डिश में बीकर रखकर कदम 1.6 में प्रदर्शन वर्षा के लिए पूर्व सर्द 100-150 एमएल निर्जल Diethyl ईथर (74.12 छ / mol). एक रासायनिक धूआं हुड में माइक्रोवेव और vortexer ले जाएँ.
    नोट: Diethyl ईथर भी एक रासायनिक फ्रीजर में बीकर रखकर prechilled किया जा सकता है. एक फ्रीजर में द्रुतशीतन द्वारा हासिल की कम Diethyl ईथर तापमान दर और वर्षा की दक्षता में वृद्धि होगी.
  3. एक छोटे से तौलना नाव में, molecu की पाली की 5 ग्राम (इथाइलीन ग्लाइकॉल) (खूंटी) वज़नअपनी पसंद (1,000-100,000 दा) के LAR वजन.
    1. अगर मौजूद है, जगमगाहट शीशी का ढक्कन से प्लास्टिक के टुकड़े को हटा दें. शीशी धड़ा, और हुड में समीकरण 1 प्रति शीशी (एमए, 154.16 छ / mol) में methacrylic एनहाइड्राइड की 10 दाढ़ अतिरिक्त बांटना. जगमगाहट शीशी को खूंटी जोड़ें.
      1 समीकरण (1)
      जहां समीकरण 1.1 जी में खूंटी के द्रव्यमान है, समीकरण 1.2 छ / mol में खूंटी के आणविक भार है, समीकरण 1.3 खूंटी पर टर्मिनल OH समूहों की संख्या है, और समीकरण 1.4 molecu हैछ / mol में एमए की LAR वजन.
  4. शिथिल जगमगाहट शीशी पर टोपी मोड़. अधिकतम शक्ति पर 5 मिनट के लिए माइक्रोवेव सेट करें. गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने पहने हुए, माइक्रोवेव से हर 30 सेकंड शीशी निकालें.
    1. पूरी तरह से 30 सेकंड के लिए टोपी और भंवर कस लें. समाधान पूर्ण 5 मिनट के लिए microwaved दिया गया है जब तक दोहराएँ. टोपी के कारण खुर के लिए प्रक्रिया के दौरान जगह की आवश्यकता हो सकती है.
  5. टोपी ढीला के साथ, कमरे के तापमान को PEGDM शांत करते हैं. Dichloromethane (डीसीएम, 84.93 छ / mol) की एक छोटी राशि (10-15 मिलीग्राम) में PEGDM भंग.
    नोट: यह PEGDM कारण अवशिष्ट गर्मी को डीसीएम (एक संदिग्ध कैसरजन) के उबलते को रोकने के लिए, काफी (~ 5 मिनट) पिछले डीसीएम अलावा शांत करने के लिए अनुमति दी जा सिफारिश की है. PEGDM एक रंग का उपयोग छोटी मात्रा में टूट गया और विघटन में सहायता करने के लिए vortexed किया जा सकता है.
  6. 20 मिनट के लिए 10x अतिरिक्त ठंडा Diethyl ईथर में PEGDM वेग.
    नोट: यह अनुसूचित जाति के लिए आवश्यक हो सकता हैकम आणविक भार खूंटे (2500 दा) वेग क्रिस्टल गठन आरंभ करने के लिए एक रंग के साथ बीकर पक्ष रेचेट, लेकिन, 1000 दा नीचे एक आणविक वजन के साथ खूंटी scratching के बावजूद वेग नहीं होगा.
  7. एक BUCHNER कीप और कुप्पी का प्रयोग, वैक्यूम निस्पंदन द्वारा PEGDM इकट्ठा. इस PEGDM को पानी सोखना को बढ़ावा देंगे के रूप में, सूखापन को पूरा करने के लिए फ़िल्टर न करें.
    नोट: प्रयोग में विशिष्ट निर्वात प्रणाली के लिए, एक वैक्यूम जाल निस्पंदन सेटअप और विलायक वाष्पकणों से क्षति से वैक्यूम पंप की रक्षा के लिए वैक्यूम स्रोत के बीच रखा जा सकता है यदि आवश्यक है.
  8. वेंटिलेशन के लिए टोपी के माध्यम से छेदा एक बड़े गेज सुई के साथ एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए फ़िल्टर PEGDM स्थानांतरण. सुखाने के लिए एक निर्वात चैम्बर में रातोंरात स्टोर.
  9. डीसीएम और reprecipitate में redissolve PEGDM unreacted एमए दूर करने के लिए एक अंतिम कदम के रूप में (कदम 1.5-1.7 के रूप में). कदम 1.8 में के रूप में फिर से सूखी.

2. PEGDM functionalization की विशेषता

  1. विलायक के रूप में deuterated क्लोरोफॉर्म (120.38 छ / mol) का उपयोग करना, 1 एच एनएमआर के लिए नमूने तैयार करते हैं. विलायक (≈ 1.0 एमएल) की एक छोटी राशि के साथ एक जगमगाहट शीशी में PEGDM (≈ 10 मिलीग्राम) का एक छोटा सा नमूना रखें. लक्ष्य एकाग्रता 10 मिलीग्राम / एमएल है.
    1. नमूना भंग हो जाने के बाद, एक साफ एनएमआर ट्यूब को हस्तांतरण. नमूना एनएमआर ट्यूब के नीचे 4-5 सेमी भरना चाहिए.
  2. प्रोटॉन एनएमआर स्पेक्ट्रा लीजिए. हमारे आंकड़े एक 400 मेगाहर्ट्ज स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर इकट्ठा किया जाता है. पर्याप्त डेटा संकल्प प्राप्त करने के लिए कम से कम 64 स्कैन के लिए कमरे के तापमान पर नमूने चलाएँ.
  3. एनएमआर विश्लेषण (चित्रा 4) PEGDM functionalization कम से कम 90% है इंगित करता है, तो methacrylation प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए. एमए की जन unfunctionalized खूंटी की कम राशि के लिए खाते में करने के लिए इस्तेमाल समायोजित करें.

नोट: PEGDM में क्रियाशील खूंटी का प्रतिशत मनाया से गणना की जा सकती है: टर्मिनल methacr की सैद्धांतिक अनुपातylate प्रोटॉन (क, ख और ग) केंद्रीय खूंटी प्रोटॉन (घ) (चित्रा 4) के लिए. रेखीय खूंटी के लिए, केंद्रीय खूंटी प्रोटॉन की सैद्धांतिक संख्या समीकरण 2 से गणना की है:

2 समीकरण (2)
जहां समीकरण 2.1 आणविक छ / mol में खूंटी के वजन और है समीकरण 2.2 एक एकल खूंटी दोहराने (44 जी / मोल) की आणविक भार है. Nonlinear खूंटी के लिए, इस समीकरण विशिष्ट शाखाओं संरचना (चित्रा 1) को प्रतिबिंबित करने के लिए संशोधित किया जाना चाहिए. प्रतिशत functionalization तो समीकरण 3 का उपयोग कर की गणना की जा सकती है:
3 समीकरण (3)
जहां समीकरण 3.1 methacrylate प्रोटॉन चोटियों के तहत मनाया क्षेत्र (एक, δ = 1.94 पीपीएम, बी और सी, δ = 5.57 और 6.12 पीपीएम) है, और समीकरण 3.3 methacrylate प्रोटॉन की सैद्धांतिक संख्या (एक = 3 * है समीकरण 1.3 , बी = 1 * समीकरण 1.3 और ग = 1 * समीकरण 1.3 - रेखीय खूंटी के लिए क्रमश: 6, 2 और 2). प्रतिशत functionalization गणना चोटियों क, ख का उपयोग कर प्रदर्शन किया और सी अलग है, और फिर averag किया जाना चाहिएएक समग्र प्रतिशत functionalization प्राप्त करने के लिए एड.

नोट: पर्याप्त functionalized PEGDM तो (पानी के खिलाफ, पानी में) dialyzed और अवशिष्ट methacrylic एनहाइड्राइड और methacrylic एसिड को दूर करने के लिए lyophilization द्वारा एकत्र किया जा सकता है. अंतिम उत्पाद साइट्रिक एसिड या विटामिन सी के रूप में अवरोध करनेवाला की एक छोटी राशि (0.01% wt) के साथ मिलाया जाता है और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर desiccant के साथ रखा जाए. अंतिम PEGDM उत्पाद खेतान और Burdick 22 से जौव लेख में विस्तृत रूप में, हाइड्रोजेल का उत्पादन किया जा सकता है.

3. पर राल पेप्टाइड्स के माइक्रोवेव की सहायता functionalization

नोट: हमारी पेप्टाइड्स यूवी निगरानी के साथ एक स्वचालित पेप्टाइड सिंथेसाइज़र का उपयोग कर, Fmoc-Gly-वैंग राल का उपयोग संश्लेषित रहे हैं, और एन methylpyrrolidone (एन एम पी, 99.1 छ / mol) में 0.2 एम अमीनो एसिड समाधान. 5% piperazine dimethylformamide में (86.1 छ / mol) (DMF, 73.1 छ / mol) deprotection के लिए प्रयोग किया जाता है, 0.5 एम ओ benzotriazole एन, एन, एन, 'n' tetramethyl-uronium-hexaflDMF में uoro फॉस्फेट (HBTU, 379.3 छ / mol) उत्प्रेरक के रूप में प्रयोग किया जाता है, और एन एम पी में 2 एम diisopropylethylamine (DIEA, 129.3 छ / mol) उत्प्रेरक आधार के रूप में प्रयोग किया जाता है. पेप्टाइड्स भी एक वाणिज्यिक पेप्टाइड आपूर्तिकर्ता से प्राप्त किया जा सकता है. वाणिज्यिक स्रोतों का उपयोग करते समय मानक है, क्योंकि यह पेप्टाइड्स अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखला नहीं बल्कि पूरी तरह से cleaved से बरकरार समूहों की रक्षा करने के साथ पर राल खरीद रहे हैं कि महत्वपूर्ण है.

नोट: यह प्रतिक्रियाशील पक्ष श्रृंखला के साथ किसी भी अमीनो एसिड कि methacrylamide functionalization केवल अनुक्रम के एन टर्मिनस के प्राथमिक amine पर होता है यह सुनिश्चित करने के लिए संरक्षित कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. एमिनो प्रतिक्रियाशील पक्ष समूहों के साथ एसिड होता है, और ठेठ रक्षा समूहों के लिए 1 टेबल देखें. रक्षा समूहों के साथ अमीनो एसिड nonprotected अमीनो एसिड के रूप में एक ही तरीके से पेप्टाइड संश्लेषण के दौरान अनुक्रम में शामिल किया है, और एक ही अमीनो एसिड सप्लायरों से अक्सर उपलब्ध हैं.

एमिनो एसिड रिएक्टिव समूह समूह की रक्षा
लाइसिन प्राथमिक Amine tert-butyloxycarbonyl (बीओसी)
सेरीन प्राथमिक शराब tert-butyl (TBU)
Threonine माध्यमिक शराब TBU
Tyrosine फिनोल TBU

तालिका 1: रिएक्टिव अमीनो एसिड और ठेठ रक्षा समूहों.

  1. मानक ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण का उपयोग कर पेप्टाइड्स synthesize, और उपयोग के लिए तैयार है जब तक DMF में 4 डिग्री सेल्सियस पर राल पर दुकान.
  2. फिल्टर पेपर और 250 मिलीलीटर कुप्पी के साथ एक 7 सेमी BUCHNER कीप का प्रयोग, निस्पंदन माध्यम DMF से पेप्टाइड राल इकट्ठा.
  3. वर्तमान जगमगाहट शीशी का ढक्कन से प्लास्टिक टुकड़ा निकालते हैं. जगमगाहट शीशी राल स्थानांतरण. एक डिस्पोजेबल विंदुक का प्रयोग, जगमगाहट शीशी में राल कवर करने के लिए अभी पर्याप्त एमए जोड़ें.
  4. शिथिल जगमगाहट शीशी पर टोपी जगह. अधिकतम शक्ति पर 3 मिनट के लिए माइक्रोवेव सेट करें. गर्मी प्रतिरोधी दस्ताने पहने हुए, माइक्रोवेव से हर 15-20 सेकंड शीशी निकालें.
    1. पूरी तरह से 15 सेकंड के लिए टोपी और भंवर कस लें. समाधान फू के लिए microwaved दिया गया है जब तक दोहराएँ3 मिनट करूँगा.
  5. टोपी ढीला के साथ, कमरे के तापमान को पेप्टाइड समाधान शांत करते हैं. DMF की एक छोटी राशि और फिल्टर पेपर और कुप्पी के साथ एक BUCHNER कीप का प्रयोग, शीशी से पेप्टाइड राल इकट्ठा.
  6. एक ताजा जगमगाहट शीशी पेप्टाइड रेसिन ट्रांस्फर और पेप्टाइड फोड़ना और deprotect.
    1. 0.25 राल की mmol के अनुसार, हम, (टिप्स, 158.36 छ / mol) 0.5 मिलीलीटर triisopropylsilane से प्रत्येक के साथ 18.5 मिलीलीटर trifluoroacetic एसिड (TFA, 114.02 छ / mol) की एक दरार कॉकटेल का उपयोग कर, रोटेशन के साथ एक 2 घंटा कमरे के तापमान प्रतिक्रिया का उपयोग 3,6-Dioxa-1, 8-octanedithiol (DODT, 182.30 छ / mol) और विआयनीकृत पानी (18.02 छ / mol).
      नोट: इस कॉकटेल सबसे पेप्टाइड्स के लिए पर्याप्त है, लेकिन 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-Sulfonyl (सामान्यतः arginine पक्ष श्रृंखला की रक्षा के लिए प्रयोग किया जाता) (PBF) की रक्षा की अमीनो एसिड deprotect नहीं होगा. अनुक्रम किसी भी PBF की रक्षा समूह होता है, TFA के 0.5 मिलीलीटर 0.5 मिलीलीटर thioanisole (124 साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए.20 छ / mol) और दरार समय 4 घंटे के लिए बढ़ा.
      नोट: दरार कॉकटेल में एक बादल, क्रिस्टलीय पदार्थ रूपों, पेप्टाइड संभावना समाधान और दरार कॉकटेल की मात्रा के बाहर दुर्घटनाग्रस्त है तो दोगुनी की जानी चाहिए.
  7. घड़ी का शीशा साथ कवर एक बीकर में बर्फ पर 400 एमएल निर्जल Diethyl ईथर शांत रहो.
  8. 10x अतिरिक्त Diethyl ईथर में पेप्टाइड वेग, और चार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के बीच समान रूप से समाधान विभाजित करते हैं. पेप्टाइड एकत्र करने के लिए 10 मिनट के लिए 3200 XG पर अपकेंद्रित्र.
    1. ईथर बंद छानना, और ताजा Diethyl ईथर दो 50 मीटर शंक्वाकार ट्यूबों के बीच विभाजित 100 मिलीलीटर में पेप्टाइड resuspend. 4 ईथर washes के एक कुल के लिए दो बार ताजा ईथर के 50 एमएल में resuspending, centrifugation प्रक्रिया को दोहराएं.
      नोट: यह दरार कॉकटेल में प्रयुक्त रसायनों को हटा और ठोस पेप्टाइड से समूहों की रक्षा cleaved.
  9. पिछले centrifugation कदम के बाद, अपशिष्ट एट छाननाउसे और शून्य के नीचे रात भर पेप्टाइड सूखी.

4. पेप्टाइड functionalization की विशेषता

  1. पेप्टाइड नमूनों की MALDI-TOF विश्लेषण के लिए विलायक के रूप में Acetonitrile (41.05 छ / mol) + 0.1% TFA: 50:50 एच 2 ओ का प्रयोग करें. एक छोटा सा नमूना जगह - एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में पेप्टाइड (1 2 मिलीग्राम) और MALDI विलायक के 1 मिलीलीटर में नमूना भंग.
  2. मैट्रिक्स समाधान तैयार करें. मैट्रिक्स के रूप में एक सामान्य कार्यरत मैट्रिक्स है α-Cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA, 189.2 छ / mol). एक शेयर मैट्रिक्स समाधान बनाने, MALDI विलायक में 10 मिलीग्राम / एमएल मैट्रिक्स भंग.
    नोट: मैट्रिक्स शेयर समाधान अतिरिक्त विश्लेषण के लिए एक सप्ताह के लिए कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
  3. एक 1:1 अनुपात में पेप्टाइड और मैट्रिक्स समाधान का मिश्रण. 1 μl / स्पॉट जोड़ने, MALDI नमूना थाली पर तीन अलग अलग स्थानों पर इस संयुक्त समाधान स्पॉट.
    1. स्पॉट, हवा सुखाने के द्वारा या एक गर्मी बंदूक का इस्तेमाल या तो सूख. Respot और शुष्क प्रत्येकनमूना.
      नोट: Respotting एक और अधिक समान पेप्टाइड / मैट्रिक्स नमूना पैदा करता है, और एक स्पष्ट संकेत प्राप्त करने में सहायता करता है. एक मानक पेप्टाइड मिश्रण भी एक 1:1 अनुपात में मैट्रिक्स समाधान के साथ जोड़ा जा और MALDI प्लेट पर (केवल एक बार) देखा जाना चाहिए.
  4. MALDI-TOF डेटा लीजिए. कारण पेप्टाइड एन टर्मिनस तक methacrylamide समूह के अलावा, अकेले पेप्टाइड आणविक वजन के ऊपर है कि आणविक वजन में एक 68 जी / मोल वृद्धि होनी चाहिए.
    नोट: PEGDM संश्लेषण के विपरीत, प्रतिक्रियाशील ओर चेन के साथ अमीनो एसिड पर रक्षा समूहों को हटा रहे हैं दरार पर के रूप में पेप्टाइड्स, refunctionalized नहीं किया जा सकता, और एन Termini के चुनिंदा functionalization नहीं रह गया है, यह सुनिश्चित किया जा सकता है.
    1. MALDI विश्लेषण (चित्रा 5) पेप्टाइड सही ढंग से क्रियाशील किया गया था इंगित करता है और सभी की रक्षा समूहों को उचित रूप से cleaved है, पेप्टाइड (पानी के खिलाफ, पानी में) dialyzed और remov के लिए lyophilization द्वारा एकत्र किया जा सकता हैई अवशिष्ट contaminants (दरार कॉकटेल, आकाश, आदि समूहों की रक्षा cleaved). ठोस पेप्टाइड एक छोटे Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरित और -20 डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक पर संग्रहित किया जाना चाहिए.

Representative Results

प्रत्येक स्पेक्ट्रा शिखर के तहत क्षेत्र की अनुमति, नमूने में है कि प्रोटोन के सापेक्ष स्तरों के अनुपात में है के रूप में प्रोटॉन परमाणु चुंबकीय अनुनाद, एक रासायनिक प्रतिक्रिया की दक्षता का आकलन करने के लिए सबसे आम विश्लेषणात्मक तकनीकों में से एक है उत्पाद और अभिकारक के अनुपात के दृढ़ संकल्प नमूने में. टर्मिनल methacrylate प्रोटॉन की सैद्धांतिक अनुपात (ए, बी और सी) (डी) केंद्रीय खूंटी प्रोटॉनों को इस प्रतिक्रिया के लिए, 1 एच एनएमआर विश्लेषण (चित्रा 4) मनाया से% functionalization की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 4 चित्र में दिखाया PEGDM पूर्व functionalization को 2,000 दा था, इसलिए n = 2,000 डीए / (44 डीए / खूंटी दोहराने) = 45.5, = 4 * (n-1) = 178 तो डी, प्रोटॉन बनाने: एनएमआर इकाई अनुपात 178 / = 1.74 102.16. नमूने में पानी की मौजूदगी कृत्रिम रूप से चोटी के तहत क्षेत्र बढ़ जाती है के रूप में इस मामले में, एक% functionalization का आकलन करने में उपयोग नहीं किया जा सकता है चोटी. शिखर ख का प्रयोग,% functionalization 1.00 * 1.74 / 2 * 100% = 87.1% है, usinजी शिखर सी,% functionalization 1.08 * 1.74 / 2 * 100% = 94.1% है. इसलिए, समग्र% functionalization 91% है और इस PEGDM पर्याप्त रूप से हाइड्रोजेल संश्लेषण में प्रयोग के लिए क्रियाशील है. आमतौर पर, लगभग 90% functionalization methacrylation के एक दौर के बाद हासिल की है.

कारण पेप्टाइड्स के 1 एच एनएमआर विश्लेषण में उठता है कि प्रोटॉन चोटियों की भीड़ के लिए, पेप्टाइड functionalization अधिक आसानी से MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग की जांच की है. इस पेप्टाइड GKRGDSG संश्लेषित और functionalization methacrylamide के अधीन था जहां चित्रा 5, में प्रदर्शन किया है. पेप्टाइड का एक छोटा सा अंश मनाया आणविक वजन शिखर पेप्टाइड अनुक्रम के सही संश्लेषण का संकेत 676 छ / mol, पेप्टाइड की उम्मीद आणविक वजन, पर होने वाली दिखाया जो prefunctionalization आणविक भार आकलन (चित्रा 5A), के लिए cleaved किया गया था. पेप्टाइड के शेष methacrylamide कार्यात्मक लियापूर्व दरार को ization. इस पेप्टाइड PBF आर अमीनो एसिड संरक्षित होता है, दरार 4 घंटे के लिए thioanisole युक्त कॉकटेल में प्रदर्शन किया गया था. Methacrylamide functionalization के बाद मनाया आणविक वजन शिखर 744 छ / mol (चित्रा 5 ब) में होता है, methacrylamide क्रियाशील पेप्टाइड (676 +68 छ / mol) और की उम्मीद वजन unfunctionalized पेप्टाइड की उम्मीद आणविक वजन पर, सही संकेत नहीं functionalization.

खूंटी और methacrylamide क्रियाशील पेप्टाइड दोनों की कार्यक्षमता का प्रदर्शन करने के लिए, PEGDM हाइड्रोजेल GKRGDSG (चित्रा 6) क्रियाशील methacrylamide साथ और 0.5 मिमी के बिना उत्पादन किया गया था. Hydrogels 0.05% wt लिथियम फिनाइल-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (एलएपी) photoinitiator रूप से, पीबीएस में 10% wt रेखीय 10 केडीए PEGDM के साथ उत्पादन किया गया था. हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान दो गिलास स्लाइड एक गिलास स्लाइड स्पेसर द्वारा अलग और बांधने की मशीन क्लिप के साथ मिलकर आयोजित बीच इंजेक्ट किया गया था. अग्रदूत समाधान तो 8 मिमी व्यास जैल एक बेलनाकार पंच का उपयोग कर एकत्र किए गए थे, जिसके बाद crosslinking प्रेरित करने के लिए 10 मिनट के लिए 2 मेगावाट / 2 सेमी पर 365 एनएम पराबैंगनी प्रकाश के संपर्क में था. जैल पीबीएस में rinsed और संतुलन सूजन शर्तों 16,20 प्राप्त किया गया सुनिश्चित करने के लिए 2 दिनों के लिए प्रफुल्लित करने के लिए अनुमति दी गई थी. मानव MSCs (बीतने 3) 80% confluency हो गई और 15,000 कोशिकाओं / 2 सेमी में hydrogels पर वरीयता प्राप्त थे. कोशिकाओं का उपयोग कर एक 10x बढ़ाई पर 0.5 μl / एमएल calcein AM और 2 μl / मिलीलीटर ethidium homodimer (Invitrogen से लाइव / मृत व्यवहार्यता किट) युक्त ताजा मीडिया को हस्तांतरित और चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति तहत imaged किया जा रहा से पहले 48 घंटे के लिए पालन करने के लिए अनुमति दी गई Nikon ग्रहण तिवारी 2000. MSCs unfunctionalized खूंटी हाइड्रोजेल (चित्रा 6A) का पालन करने में असमर्थ थे, लेकिन सेल आसंजन पेप्टाइड RGD के शामिल किए जाने पर वे का पालन करना और हाइड्रोजेल सतह (चित्रा 6B) पर प्रसार करने में सक्षम थे. लाइव / मृत छवियाँMSCs मौत पर जेल सतह से अलग कर वरीयता प्राप्त सेल व्यवहार्यता की कृत्रिम मुद्रास्फीति में जिसके परिणामस्वरूप, मीडिया स्थानांतरण प्रक्रिया के दौरान हटा दिया जाएगा कि आसंजन पर निर्भर कोशिकाओं के रूप में, वरीय एमएससी आबादी की व्यवहार्यता का प्रतिनिधित्व नहीं करते प्रस्तुत किया. बल्कि, फ्लोरोसेंट छवियों अकेले चरण विपरीत तहत मुश्किल हो सकता है जो हाइड्रोजेल टोपोलॉजी में पक्षपाती कोशिकाओं और छोटे बदलाव के बीच हदबंदी करने का इरादा कर रहे हैं. दिलचस्प है, nonspread कोशिकाओं कोशिकाओं इमेजिंग के समय में मर रहे थे कि यह दर्शाता है, calcein AM और ethidium homodimer दोनों के लिए सकारात्मक दाग खूंटी केवल जैल पर वरीयता प्राप्त.

खूंटी हाइड्रोजेल को कई लाभ में से एक उनके उच्च tunable प्रकृति है. खूंटी hydrogel के विशिष्ट श्रृंगार को संशोधित शोधकर्ताओं लोच के मापांक के रूप में संपत्ति पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री देता है. , 7 चित्र में सचित्र खूंटी आणविक भार (चित्रा 7A) और वजन प्रतिशत (दोनों (8 चित्रा) की जांच के द्वारा प्रदर्शन किया गया. सभी हाइड्रोजेल photoinitiator के रूप में 0.05% wt एलएपी के साथ, पीबीएस में 10% wt रैखिक PEGDM के साथ उत्पादन किया गया था. हाइड्रोजेल अग्रदूत समाधान के 40 μl बेलनाकार geometries व्यास में लगभग 5 मिमी और ऊंचाई में 2 मिमी उत्पादन, हाइड्रोजेल फार्म करने के लिए सुझावों काट, और 10 मिनट के लिए 2 मेगावाट / 2 सेमी पर 365 एनएम यूवी प्रकाश के संपर्क के साथ 1 मिलीलीटर सीरिंज में था . जैल यांत्रिक परीक्षण से पहले 2 दिनों के लिए पीबीएस में प्रफुल्लित करने के लिए अनुमति दी गई थी. हाइड्रोजेल मापांक 0.1 मिमी / सेकंड की दर से प्रारंभिक हाइड्रोजेल ऊंचाई के बीच 5 और 10% compressing जबकि एक 5 एन लोड सेल के साथ एक टन क्यूटी / 5 का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. यांत्रिक परीक्षण पूरा कर लिया गया था, जाल आकार हाइड्रोजेल मास को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया थाएस पूर्व (एम एस) और पोस्ट (एम डी) MATLAB में प्रदर्शन किया गणना के साथ चर्चा अनुभाग में विस्तृत रूप फ्लोरी-Rehner समीकरण के माध्यम से lyophilization के 24 घंटे. धारणा के रूप में, हाइड्रोजेल जाल आकार में वृद्धि (चित्रा 8A) और हाइड्रोजेल कठोरता में कमी (चित्रा 8B) के कारण macromer खूंटी के आणविक वजन बढ़ रही है. हाइड्रोजेल जाल आकार और उसके एवज में जेल कठोरता भी वजन प्रतिशत खूंटी में फेरबदल के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. Hydrogels रेखीय 10 केडीए PEGDM के अलग भार% के साथ उत्पादन किया गया था, और पहले से चित्रा (9) के रूप में वर्णित हाइड्रोजेल कठोरता और जाल आकार निर्धारित किया गया है. जैसा कि खूंटी एक महत्वपूर्ण जाल आकार में कमी (चित्रा 9A) और हाइड्रोजेल कठोरता (चित्रा 9B) में वृद्धि का कारण बनता भार% बढ़ रही है, चित्रा 7B में सचित्र था.

समझाया गोजातीय सीरम albumin (BSA) युक्त hydrogels अलग molecula का उपयोग का गठन किया गयाआर वजन खूंटी (2, 10, और 20 केडीए). चित्रा 6 के रूप में वर्णित सभी हाइड्रोजेल, 50 माइक्रोग्राम / एमएल BSA युक्त पीबीएस में 10% wt PEGDM के साथ उत्पादन किया गया था. जैल 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर पीबीएस में incubated, और हर समय बिंदु पर ताजा पीबीएस के लिए स्थानांतरित कर दिया गया. विमोचन बीएसए थर्मो वैज्ञानिक से ब्रैडफोर्ड परख का उपयोग मात्रा था. हाइड्रोजेल जाल आकार 8 चित्रा के लिए वर्णित के रूप में निर्धारित किया गया था. चित्रा 7A में सचित्र, बीएसए रिहाई हाइड्रोजेल भीतर बड़ा जाल आकार (10 चित्रा) का एक परिणाम के रूप में, उच्च आणविक भार PEGDM का उपयोग का गठन हाइड्रोजेल से अधिक तेजी से होता है.

चित्रा 4
चित्रा 4. 2 केडीए रैखिक PEGDM के प्रतिनिधि 1 एच एनएमआर माइक्रोवेव की सहायता पद्धति का उपयोग क्रियाशील. प्रतिशत functionalization CA हो सकता हैपर आधारित lculated मनाया. टर्मिनल methacrylate प्रोटॉन की सैद्धांतिक अनुपात (क, ख और ग) केंद्रीय खूंटी प्रोटॉन (डी) के लिए बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. पेप्टाइड GKRGDSG (क) से पहले और (बी) माइक्रोवेव की सहायता पद्धति का उपयोग functionalization के बाद. Functionalization के बाद मनाया आणविक वजन शिखर 744 छ / mol पर होता है कि नोट methacrylamide क्रियाशील पेप्टाइड की उम्मीद वजन (676 प्रतिनिधि MALDI-TOF 68 जी / मोल) और नहीं संयुक्त राष्ट्र के क्रियाशील पेप्टाइड (676 छ / mol) की उम्मीद आणविक वजन पर. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .


चित्रा 6. प्रतिनिधि चरण विपरीत (बाएं) और (हरा / लाल) मृत / जी अकेले और बी ए) खूंटी जैल पर सुसंस्कृत MSCs के फ्लोरोसेंट छवियों (दाएं)) 0.5 मिमी युक्त खूंटी जैल क्रियाशील GKRGDSG methacrylamide. MSCs का पालन करने में असमर्थ हैं और पर फैल अकेले PEGDA जैल, लेकिन सेल आसंजन पेप्टाइड RGD के समावेश पर, का पालन करना और हाइड्रोजेल सतह पर फैल करने में सक्षम हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 7
चित्रा 7. ए) हाइड्रोजेल नेटवर्क बनाने के लिए इस्तेमाल किया खूंटी आणविक वजन और बी) वजन प्रतिशत खूंटी (_ हाइड्रोजेल जाल आकार को प्रभावित करता है8 ;) और परिणामी हाइड्रोजेल कठोरता और समझाया दवाओं की दर जारी. ए) लगातार वजन प्रतिशत पर सही करने के लिए छोड़ दिया खूंटी आणविक भार () बढ़ते वजन को घटाना) हाइड्रोजेल कठोरता को कम करने और दवा रिहाई की दर. बी बढ़ रही है, हाइड्रोजेल जाल आकार बढ़ता है (बाएं से दाएं) खूंटी का प्रतिशत इसी हाइड्रोजेल कठोरता को कम करने और दवा रिहाई (पैमाने पर नहीं) की दर बढ़ रही है, हाइड्रोजेल जाल आकार बढ़ता हाइड्रोजेल फार्म का उपयोग किया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

8 चित्रा
चित्रा 8. ए) मेष का आकार बढ़ता है और बी) हाइड्रोजेल कठोरता खूंटी macromer की आणविक वजन बढ़ाने के साथ घट जाती है. N = 10, त्रुटि सलाखों = SEM, *** पी एंड# 60; 0.001 द्वारा एक तरह से Tukey के एचएसडी के बाद अस्थायी परीक्षण के साथ एनोवा. सभी सांख्यिकीय विश्लेषण चश्मे 5 का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

9 चित्रा
चित्रा 9. ए) में वृद्धि% wt खूंटी के साथ) हाइड्रोजेल कठोरता बढ़ जाती है आकार कम हो जाती है और बी जाल. एन = 9-10, त्रुटि सलाखों = SEM, ** पी <0.01, *** पी <0.001 Tukey के एचएसडी के साथ एक तरह से एनोवा द्वारा बाद हॉक परीक्षण. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 10
चित्रा 10. ENCA की रिलीज2 केडीए, 10 केडीए, 20 केडीए आणविक भार खूंटी का उपयोग का गठन हाइड्रोजेल से psulated मॉडल दवा गोजातीय सीरम albumin (BSA). बीएसए रिहाई हाइड्रोजेल भीतर बड़ा जाल आकार का एक परिणाम के रूप में, उच्च आणविक भार PEGDM का उपयोग का गठन हाइड्रोजेल से अधिक तेजी से होता है . एन = 6, त्रुटि सलाखों = सेम. जारी किया% बीएसए Bonferroni साथ दो तरह दोहराने उपायों एनोवा द्वारा 2 और 10 केडीए जैल से रिहाई के बराबर हैं जब टी = 1 और 2.5 घंटा, को छोड़कर हर समय बिंदु पर सभी तीन समूहों के बीच (पी <0.0001) काफी अलग है बाद अस्थायी परीक्षण. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

पहले से सचित्र तरीकों PEGDM के संश्लेषण और पेप्टाइड्स या अन्य amine युक्त यौगिकों के methacrylamide functionalization के लिए अमूल्य हैं. इन सामग्रियों तो पुनर्योजी चिकित्सा और दवा वितरण अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. कारण खूंटी के हाइड्रोफिलिक प्रकृति को, खूंटी macromers से गठित हाइड्रोजेल शरीर 2 में कई ऊतकों के समान एक उच्च पानी सामग्री है. इस गुणवत्ता खूंटी प्रोटीन सोखना के लिए प्रतिरोधी और शरीर 3 में इसलिए निष्क्रिय बना देता है. हालांकि, खूंटी की हीड्रोस्कोपिक प्रकृति functionalization दौरान परेशानी साबित हो सकता है. पानी methacrylation प्रक्रिया के दौरान खूंटी के नमूने में मौजूद है, तो methacrylic एनहाइड्राइड methacrylic एसिड का उत्पादन करने के लिए पानी के साथ रियायत के तौर पर प्रतिक्रिया होगी, और खूंटी के गरीब functionalization परिणाम होगा.

इसलिए, खूंटी या पेप्टाइड का सफल methacrylation सुनिश्चित करने के लिए लिया जा सकता है कि सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक anhyd बनाए रखने के लिए हैRous स्थितियों की प्रतिक्रिया. उपयोग करने से पहले सभी कांच के बने पदार्थ सुखाने की सिफारिश कदम पानी के प्रदूषण को रोकने का इरादा है. नमूने में पानी की मौजूदगी 1.7 पीपीएम पर एक व्यापक चोटी (चित्रा 4) के रूप में, एनएमआर विश्लेषण में देखा जा सकता है. गरीब methacrylation भी सभी कांच के बने पदार्थ सुखाने के बाद मनाया जाता है, रसायन सोडियम सल्फेट या उपयोग करने से पहले अन्य सुखाने एजेंट (आणविक sieves आदि) पर सूखे की जा सकती है. आसवन भी पहले का उपयोग करने के लिए पानी निकालने और methacrylic एनहाइड्राइड को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और azeotropic आसवन खूंटी 23 सुखाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चरम मामलों में, संश्लेषण आगे पर्याप्त रूप से निर्जल स्थितियां सुनिश्चित करने के लिए एक glovebox में किया जा सकता है. उसी प्रक्रिया का पालन methacrylation के दूसरे दौर, भी functionalization बढ़ाने के लिए किया जा सकता है. Functionalization की अतिरिक्त फेरे लिए आवश्यक हो जाएगा कि वहाँ हमेशा एक मौका है, क्योंकि देखभाल जल्दी वैक्यूम निस्पंदन द्वारा PEGDM एकत्र करने के लिए कदम 1.7 और 1.9 में लिया जाना चाहिए. से अधिक समय के लिए वैक्यूम निस्पंदन पानी सोखना के लिए अवसर बढ़ रही है, हवा को खूंटी के बिल्कुल आवश्यक बढ़ जाती है जोखिम है.

हाइड्रॉक्सिल कार्य समूहों को methacrylic एनहाइड्राइड का प्रतिशत अतिरिक्त खूंटी अग्रदूत पर खूंटी functionalization (जैसे बांह #) में वृद्धि, अपरिवर्तित बनी हुई है हालांकि आम तौर पर हासिल प्रतिशत functionalization में कम हो जाती है (अप्रकाशित परिणाम, बेनोइट प्रयोगशाला) के साथ जुड़ा हुआ है. विशेष कठिनाइयों पर्याप्त उच्च functionalization प्राप्त करने आई हैं, तो preemptively functionalization दक्षता में इस कमी का पता, या, माइक्रोवेव प्रतिक्रिया की अवधि को बढ़ाया जा सकता, माइक्रोवेव अंतराल 30 सेकंड पर बनाए रखा है कि प्रदान की है. 10 दाढ़ अतिरिक्त आमतौर पर पर्याप्त है, प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया methacrylic एनहाइड्राइड की राशि भी 12 हासिल प्रतिशत functionalization बढ़ाने के लिए बढ़ाया जा सकता है.

यह महत्वपूर्ण है किअतिरिक्त वर्षा कदम (1.9) अच्छा एनएमआर संकेतों को प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया. यह reprecipitating अतिरिक्त methacrylic एनहाइड्राइड और methacrylic एसिड को हटाने की सहायता करने के लिए पाया गया है पहले रात भर नमूना सुखाने, संश्लेषण के रूप में एक ही दिन दूसरी वर्षा प्रदर्शन करने के लिए आकर्षक है. नमूना तैयार भी साफ एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, और इसलिए नमूनों की सिफारिश की शर्तों का उपयोग कर तैयार. 4 सही ढंग से क्रियाशील PEGDM के लिए प्रतिनिधि 1 एच एनएमआर परिणाम दर्शाता आंकड़ा होना चाहिए. केंद्रीय खूंटी प्रोटॉनों को टर्मिनल methacrylate प्रोटॉनों के अनुपात का विश्लेषण करके, PEGDM पर्याप्त रूप से क्रियाशील होने के लिए निर्धारित किया गया था. MALDI नमूना तैयार करने के लिए एक स्पष्ट पढ़ने को प्राप्त करने के लिए इसी तरह महत्वपूर्ण है. MALDI लवण और उच्च नमूना सांद्रता की उपस्थिति के लिए विशेष रूप से संवेदनशील है. (एक उच्च संकेत के साथ 50 मनमाना इकाइयों (एयू ऊपर एक तीव्रता): शोर अनुपात) को पढ़ने के लिए एक स्पष्ट MALDI तो प्राप्त नहीं किया जा सकता है, नमूना हैolution मैट्रिक्स समाधान के साथ संयुक्त और reanalyzed किए जाने से पहले MALDI विलायक में 1:100 पतला होना चाहिए. 5 सही पेप्टाइड functionalization, दरार, और नमूना तैयार करने के बाद प्रतिनिधि MALDI-TOF परिणाम दर्शाता है चित्रा. पूर्व functionalization (चित्रा 5A) के लिए राल का एक छोटा सा नमूना के विखंडन चित्रा 5B में दिखाया पेप्टाइड का सही methacrylamide functionalization साथ, पेप्टाइड GKRGDSG के सही संश्लेषण से पता चलता है.

पर राल पेप्टाइड्स के functionalization एक अपेक्षाकृत मजबूत प्रक्रिया है, प्रत्येक दृश्य के लिए आवश्यक दरार की स्थिति अक्सर सुधार आवश्यक है. कई अमीनो एसिड पक्ष श्रृंखला (लंबी> 30 अमीनो एसिड, या समूहों की रक्षा करने के साथ> 15 अमीनो एसिड) की रक्षा की है, जहां लंबे दृश्यों के लिए, दरार की अवधि एक घंटे की वृद्धि की जानी चाहिए. दरार समय बहुत ज्यादा बढ़ा दिया है हालांकि, अगर पेप्टाइड बंधन दरार के कारण लंबे समय तक अम्लीय प्रदर्शन करने के लिए हो सकता है. MALDI एना सेल पेप्टाइड संश्लेषण या दरार में हुई है, जो किसी भी त्रुटि खुलासा करने में बहुत सहायक हो सकता है. उम्मीद की आणविक भार के नीचे एक मनाया कमी है कि अमीनो एसिड (ओं) जोड़ी ठीक से नहीं किया संकेत कर सकते हैं, या कि पेप्टाइड fractionation (आणविक वजन में सामान्यतः मनाया परिवर्तन के स्रोतों के लिए 2 टेबल देखें) हुआ. मनाया आणविक वजन इस्तेमाल किया एक रक्षा समूह के वजन से अधिक की उम्मीद अधिक है, तो यह दरार और deprotection अपर्याप्त था और पेप्टाइड अतिरिक्त समय के लिए recleaved किया जाना चाहिए कि संभावना है.

एक्स "> मेगावाट परिवर्तन (छ / mol) <टीडी शैली = "चौड़ाई: 64px;"> 24 डीटीएच: 64px; "> -113 03px; "> प्रो 103px; "> Tyr:, चौड़ाई 20px: ऊंचाई 20" = शैली "
एमिनो एसिड विलोपन मेगावाट परिवर्तन (छ / mol) Uncleaved रक्षा समूह आमतौर पर मौजूद आयनों मेगावाट परिवर्तन (छ / mol)
पक्षक -71 Acetyl 42 CL - 35
Arg -158 एलिल 40 + K 39
ASN -114 Alloc 85 2 मिलीग्राम +
पहाड़ी पीपल -115 बीओसी 100 + NA 23
CYS -103 Fmoc 223
Gln -128 OtBu 56
ग्लू -129 PBF 252
Gly -57 TBU 56
उसके -137 ठ्ठ 242
इले -113
लेउ
लिस -128
मुलाकात -131
Phe -147
-97
सेवा -87
Thr -101
टीआरपी -186
-147
वैल -99

तालिका 2. आम पेप्टाइड आणविक वजन में परिवर्तन मनाया.

माइक्रोवेव की सहायता methacrylation तरीकों का उपयोग कर उत्पादन Macromers पुनर्योजी दवा या दवा वितरण आवेदनों की संख्या में इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ संश्लेषित क्रियाशील पेप्टाइड्स और PEGDM भी Nitroxide की मध्यस्थता polymerization (एन एम पी), परमाणु हस्तांतरण कट्टरपंथी polymerization (ATRP) या प्रतिवर्ती आदि का उपयोग पॉलिमर में शामिल किया जा सकता हैtion के विखंडन स्थानांतरण (बेड़ा) विधियों 24. पहले खेतान और Burdick 22 से जौव लेख में प्रदर्शन के रूप hydrogel नेटवर्क भी, कोशिकाओं की उपस्थिति में उत्पादित किया जा सकता है. अकेले खूंटी कुछ प्रकार की कोशिकाओं 25 के अस्तित्व और समारोह के लिए महत्वपूर्ण सेल सामग्री बातचीत प्रदान नहीं करता है के रूप में यह अक्सर ऐसे RGD या बाह्य मैट्रिक्स अणुओं के रूप में सेल आसंजन पेप्टाइड्स के समावेश की आवश्यकता है. पेप्टाइड्स, उदाहरण के लिए, पारंपरिक ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण का उपयोग कर संश्लेषित और हाइड्रोजेल नेटवर्क में शामिल करने के लिए अनुमति देने के लिए यहाँ वर्णित के रूप में क्रियाशील किया जा सकता है. चित्रा 6, हाइड्रोजेल (0.5 मिमी) संलग्न की संख्या और प्रसार कोशिकाओं (चित्रा 6B बढ़ती, खूंटी hydrogel सतहों के लिए मानव mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) के आसंजन की सुविधा में methacrylamide-क्रियाशील सेल आसंजन पेप्टाइड जी.के. RGDS जी के शामिल किए जाने के रूप में देखा ), खूंटी की तुलना में (सेल आसंजन पेप्टाइड बिना hydrogels 26 के साथ integrin की मध्यस्थता बातचीत के माध्यम से, पेप्टाइड को सोखना कि अविशिष्ट प्रोटीन के माध्यम से खूंटी हाइड्रोजेल के साथ बातचीत कर सकते हैं. इस खूंटी स्पेसर शामिल करने और अविशिष्ट बातचीत से बचने के लिए, पेप्टाइड्स बगुला और Hubbell 26 द्वारा वर्णित के रूप में, एन hydroxysuccinimidyl सक्रिय एस्टर के माध्यम से खूंटी monofunctionalized संयुग्मित किया जा सकता है.

हाइड्रोजेल नेटवर्क के आवेदन सामग्री के गुणों पर कड़ा नियंत्रण की आवश्यकता होती है. खूंटी हाइड्रोजेल के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इन संपत्तियों पर नियंत्रण के एक उच्च डिग्री है. उदाहरण के लिए, आणविक वजन, संख्या हाथ, और खूंटी के भार% हाइड्रोजेल नेटवर्क के गठन में इस्तेमाल किया-TUN ठीक करने के लिए बदला जा सकता हैविशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए ई गुण. यह हाइड्रोजेल जाल आकार पर कड़ा नियंत्रण हाइड्रोजेल सूजन अनुपात (क्यू) और कठोरता (लोच के मापांक, ई) जो नियंत्रण (ξ), की अनुमति देता है. यह आंकड़ा 7A में सचित्र और चित्रा 8 में मात्रा निर्धारित है जहां हाइड्रोजेल जाल आकार में वृद्धि (चित्रा 8A) और हाइड्रोजेल कठोरता (चित्रा 8B) में कमी में खूंटी macromer आणविक भार परिणाम बढ़ रही है.

इन हाइड्रोजेल नेटवर्क में थोक व्यवहार को नियंत्रित करता है कि अंतर्निहित शारीरिक लक्षण, जाल आकार, फ्लोरी-Rehner समीकरण 16 उपयोग कर की गणना की जाती है. इस गणना को करने के लिए बड़ा सूजन अनुपात (क्यू) पहले समीकरण 4 से गणना की है:
समीकरण 4 (4)

ρ पानी के घनत्व (1 जी / एमएल) है जहां, ρ पी खूंटी के घनत्व (है1.12 मिलीग्राम / छ), एम एस हाइड्रोजेल और एम डी की सूजन द्रव्यमान (अक्सर) ठंड और hydrogels के lyophilization के बाद मापा हाइड्रोजेल की सूखी जन है. crosslinks (एम सी, में छ / mol) के बीच आणविक वजन तो समीकरण 5 से गणना की है:
5 समीकरण (5)

एम एन (छ / mol) में खूंटी की संख्या औसत मेगावाट है जहां, समीकरण 5.05 बहुलक की विशिष्ट मात्रा है समीकरण 5.1 , वी 1 पानी की दाढ़ मात्रा (18 मिलीलीटर / मोल) है, वी 2 हाइड्रोजेल का संतुलन बहुलक मात्रा अंश है
( समीकरण 5.2 ), और एक्स 1 16 है. crosslinks (एन) के बीच बांड की संख्या तो समीकरण 6 से गणना की है:
समीकरण 6 (6)

एन बी खूंटी दोहराने में बांड की संख्या है (3) और एम आर खूंटी दोहराने (44 जी / मोल) की 27 मेगावाट की है. यह अनुमति देता है बहुलक श्रृंखला की जड़ मतलब वर्ग अंत करने के लिए अंत दूरी समीकरण 6.1 (एनएम) में समीकरण 7 से गणना करने के लिए:
समीकरण 7 (7)

एल (सीसी और सीओ बंधन लंबाई के आधार पर गणना की 0.146 एनएम,) औसत बंधन लंबाई और सी एन बहुलक (खूंटी के लिए 4.0) 28 की विशेषता अनुपात है. फाईnally, हाइड्रोजेल का जाल आकार समीकरण 8 से गणना की जा सकती है:
समीकरण 8 (8)

हाइड्रोजेल गुण इसी hydrogels के गठन में प्रयोग किया जाता खूंटी की राशि का समायोजन करके देखते जा सकता है. बाद में हाइड्रोजेल कठोरता कम कर देता है जो हाइड्रोजेल जाल आकार में वृद्धि में खूंटी macromer परिणामों का वजन प्रतिशत, घटाना. चित्रा 7B दिखाता है और आंकड़ा 9 खूंटी का वजन प्रतिशत जाल आकार को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हाइड्रोजेल गठन में इस्तेमाल कैसे quantifies (चित्रा 9A) और परिणामी हाइड्रोजेल कठोरता (चित्रा 9B). सब्सट्रेट कठोरता ऐसे स्टेम सेल भेदभाव के रूप में 29 सेल व्यवहार को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है, कसकर कठोरता नियंत्रित करने की क्षमता हाइड्रोजेल निर्माण में एक महत्वपूर्ण विशेषता है.

Hydrogels भी contr के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैराजभाषा दवा वितरण. चित्रा 7A में सचित्र और बाद में समझाया मॉडल दवा, गोजातीय सीरम albumin (BSA) की रिहाई की बढ़ती, हाइड्रोजेल नेटवर्क का जाल आकार बढ़ता खूंटी macromers की आणविक वजन में वृद्धि, चित्रा 10 में प्रदर्शन किया. इस अध्ययन में हाइड्रोजेल नमूने जाल आकार की गणना के लिए हाइड्रोजेल गीला और सूखा जनता की माप के लिए अनुमति देने के लिए टी = 195 घंटे में नष्ट कर दिया गया है, यह नमूने अब समय अवधि के लिए incubated किया गया था बीएसए रिलीज घटित होता जारी रखा है कि हमारे अनुभव है. अन्य समूहों को भी बीएसए खूंटी hydrogel नेटवर्क 30 के भीतर प्रसार के लिए प्रतिरोधी है सूचित किया है कि के रूप में 10 चित्र में मनाया बीएसए का अधूरा रिहाई, अप्रत्याशित नहीं है. समझाया प्रोटीन का अधूरा रिहाई की वजह से प्रोटीन और खूंटी macromers, या खूंटी और बीएसए 31 में लाइसिन अवशेषों पर प्राथमिक amine समूहों पर methacrylate समूह के बीच बंधन सहसंयोजक के बीच हाइड्रोजन संबंधों के कारण हो सकता है (2A चित्रा) नेटवर्क nonidealities और विषम हाइड्रोजेल जाल आकार से ग्रस्त हैं के रूप में, यह समझाया बीएसए का एक अंश काफी छोटे जाल है जो हाइड्रोजेल के क्षेत्रों में शामिल है जो भी संभव है इसकी रिलीज रोकने जेल के भीतर समग्र औसत की तुलना में आकार. समझाया बीएसए का अधूरा, nonFickian रिलीज (नहीं दिखाया डेटा) इस मामले में मनाया गया, वहीं इंसुलिन और ovalbumin सहित कई अन्य मॉडल दवाओं, नियंत्रित Fickian रिहाई, समान PEGDM 30 hydrogels का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. इसके अतिरिक्त, वाटकिंस और Anseth समान हाइड्रोजेल से फ्लोरोसेंट अणु की कि रिहाई का प्रदर्शन करने के लिए लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का इस्तेमाल किया है Fickian प्रसार के साथ स्वीकार्य मॉडलिंग की है मुझे32 thods.

इस अध्ययन में गठित हाइड्रोजेल nondegradable हैं, नेटवर्क गिरावट में शामिल किया और इन नेटवर्कों के भीतर देखते जा सकता है कि एक और पैरामीटर है. नियंत्रित हाइड्रोजेल गिरावट के लिए उपलब्ध कराना सेल व्यवहार 33, ऊतक वृद्धि या मेजबान ऊतक कुदी तसवीर की छाप को बढ़ावा देने, या explantation 34 के लिए जरूरत के उन्मूलन में परिवर्तन हो सकता है. सड़ सकने खूंटी हाइड्रोजेल सामान्यतः 35 methacrylation करने से पहले खूंटी के भीतर हाइड्रॉक्सिल समूहों पर रिंग उद्घाटन hydrolytically सड़ सकने डी, एल Lactide, glycolide, या ε-caprolactone समूहों द्वारा संश्लेषित कर रहे हैं. इन तीन समूहों glycolide एस्टर की वजह से उनके अलग hydrophobicity के लिए, सबसे बड़ा Lactide द्वारा पीछा गिरावट के लिए संवेदनशीलता, और caprolactone एस्टर होने के साथ, एस्टर functionalities के हाइड्रोलिसिस से नीचा. Hydrolytically सड़ सकने समूहों का समावेश करने के बाद, खूंटी आगे methacrylation प्रक्रिया detaile का उपयोग क्रियाशील किया जा सकता हैबाद में कट्टरपंथी द्वारा आरंभ श्रृंखला polymerization 36,37 के माध्यम से हाइड्रोजेल नेटवर्क के गठन को सक्षम करने के लिए इस लेख में डी. हाइड्रोजेल नेटवर्क की गिरावट की दर hydrolytically सड़ सकने समूह (glycolide, Lactide, आदि) की पहचान अलग से और संरचना 35,38 में शामिल सड़ सकने दोहराता की संख्या अलग से नियंत्रित किया जा सकता है.

सैद्धांतिक रूप से, यहां प्रदर्शन किया तरीकों क्रमशः, कदम 1.3 और 3.3 में ऐक्रेलिक एनहाइड्राइड साथ methacrylic एनहाइड्राइड की जगह से खूंटी और पेप्टाइड्स के acrylation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, एक्रिलिक एनहाइड्राइड काफी कम आकर्षक माइक्रोवेव की सहायता methacrylation से माइक्रोवेव की सहायता acrylation बनाने, methacrylic एनहाइड्राइड 39,40 के 20 से अधिक बार लागत है.

हम इस प्रक्रिया की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए कैसे, खूंटी और पेप्टाइड्स functionalize करने के लिए एक सरल, तेजी से विधि का प्रदर्शन किया, और यू के लिए संसाधनों को दे दिया हैहाइड्रोजेल नेटवर्क फार्म को संश्लेषित सामग्री गाते हैं. ये कृत्रिम उपकरण अपने आवेदन पत्र में अत्यधिक बहुमुखी हैं, और दवा वितरण और सामग्री अनुसंधान प्रयोगशालाओं के किसी भी संख्या में एक प्रधान को साबित करना चाहिए.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस कार्य / रोचेस्टर विश्वविद्यालय और हड्डी रोग अनुसंधान और शिक्षा फाउंडेशन / Musculoskeletal प्रत्यारोपण फाउंडेशन (oref से डा. डेनिएल बेनोइट के लिए प्रदान शुरू हुआ धन से, एक हॉवर्ड ह्यूजेस मेड में-ग्रैड फैलोशिप (AVH) के हिस्से में वित्त पोषित किया गया MTF). लेखकों को अपने उपकरणों के उपयोग के लिए डॉ. जेम्स एल मैक्ग्रा को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol Tokyo Chemical Industry Co, LTD D2649 CAS 14970-87-7
Acetonitrile J.T. Baker UN1648 CAS 75-05-8
Amino Acids AAPPTech Glycine: AFG101 CAS 29022-11-5
Arginine: AFR105 CAS 154445-77-9
Asparagine: AFD105 CAS 71989-14-5
Serine: AFS105 CAS 71989-33-8
Anhydrous diethyl ether Fisher Scientific UN1155 CAS 60-29-7
Citric acid Sigma Aldrich C1857 CAS 77-92-9
Deuterated chloroform Cambridge Isotope Laboratories Inc. DLM-7-100 CAS 865-49-6
Dichloromethane Fisher Scientific UN1593 CAS 75-09-2
Diisopropylethylamine Alfa Aesar A1181 CAS 7087-68-5
Dimethylformamide Fisher Scientific D119-4 CAS 68-12-2
Fmoc-Gly-Wang resin Peptides International RGF-1301-PI 100-200 mesh size
Methacrylic anhydride Alfa Aesar L14357 CAS 760-93-0
N-Methylpyrrolidone VWR BDH1141-4LG CAS 872-80-4
On-resin peptides Synthesized in-house On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc.
O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate AnaSpec Inc 510/791-9560 CAS 94790-37-1
Peptide Calibration Standard Care 206195
Piperazine Alfa Aesar A15019 CAS 11-85-0
Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear Alfa Aesar B22181 CAS 25322-68-3
Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear Alfa Aesar B21955
Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear Sigma Aldrich 81300 JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG
Thioanisole Alfa Aesar L5464 CAS 100-68-5
Trifluoroacetic acid Alfa Aesar A12198 CAS 76-05-1
Triisopropylsilane Alfa Aesar L09585 CAS 6485-79-6
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Tokyo Chemical Industry Co, LTD C1768 CAS 28166-41-8

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रसायन विज्ञान अंक 80 पाली (इथाइलीन ग्लाइकॉल) पेप्टाइड्स polymerization पॉलिमर methacrylation पेप्टाइड functionalization, MALDI-TOF हाइड्रोजेल macromer संश्लेषण
माइक्रोवेव की सहायता पाली के functionalization (इथाइलीन ग्लाइकॉल) और चैन Polymerizations और hydrogel संरचना में प्रयोग के लिए राल पेप्टाइड्स
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Van Hove, A. H., Wilson, B. D., Benoit, D. S. W. Microwave-assisted Functionalization of Poly(ethylene glycol) and On-resin Peptides for Use in Chain Polymerizations and Hydrogel Formation. J. Vis. Exp. (80), e50890, doi:10.3791/50890 (2013).

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