Summary
Deze video is een snelle, efficiënte methode om poly (ethyleenglycol) methacrylaat illustreren, waardoor keten polymerisaties en hydrogel synthese. Het zal laten zien hoe je methacrylamide functionaliteiten dezelfde wijze te introduceren in peptiden, detail gemeenschappelijke analytische methoden om functionalisering efficiëntie te beoordelen, suggesties voor het oplossen van problemen en geavanceerde aanpassingen, en tonen typische hydrogel karakterisering technieken.
Abstract
Een van de belangrijkste voordelen voor het gebruik van poly (ethyleenglycol) (PEG) macromeren in hydrogelvorming synthetisch veelzijdigheid. De mogelijkheid om putten uit een grote verscheidenheid aan PEG molecuulgewichten en configuraties (arm getal, armlengte en vertakking) levert onderzoekers strakke controle resulterende hydrogel structuren en eigenschappen, zoals elasticiteitsmodulus en maaswijdte. Deze video zal een snelle, efficiënte, oplosmiddelvrije, microgolven methode om PEG voorlopers methacrylaat in poly (ethyleenglycol) dimethacrylaat (PEGDM) illustreren. Deze synthetische methode biedt de broodnodige grondstoffen voor toepassingen in drug delivery en regeneratieve geneeskunde. De aangetoonde methode is superieur aan traditionele methacrylation methoden is aanzienlijk sneller en eenvoudiger, evenals economischer en milieuvriendelijker, met kleinere hoeveelheden reagentia en oplosmiddelen. We zullen ook een aanpassing van deze techniek tonen voor on-hars methacrylamide functionalisering van peptiden. Deze on-hars methode kan de N-terminus van peptiden worden gefunctionaliseerd met methacrylamide groepen voor ontscherming en afsplitsing van hars. Dit maakt selectieve toevoeging methacrylamide groepen de N-termini van de peptiden terwijl aminozuren met reactieve zijgroepen (bijv. primair amine van lysine, primaire alcohol van serine, threonine of secundaire alcoholen en fenol tyrosine) beschermd blijven, waardoor functionalisering op meerdere plaatsen. Dit artikel zal detail gemeenschappelijke analysemethoden (proton Nucleaire Magnetische Resonantie spectroscopie (, H-NMR) en Matrix laserdesorptie ionisatie Time of Flight massaspectrometrie (MALDI-TOF)) om de efficiëntie van de funtionaliseringen beoordelen. Valkuilen en stelde probleemoplossingsmethoden worden aangepakt als modificaties van de techniek die kan worden gebruikt om verder afstemmen macromeer en functionaliteit resulterende hydrogel fysische en chemischeeigenschappen. Gebruik van gesynthetiseerde producten voor de vorming van hydrogels voor drug delivery en cel-materiaal interactie studies moeten worden aangetoond, met bijzondere aandacht besteed aan het wijzigen hydrogelsamenstelling te maaswijdte beïnvloeden, controleren hydrogel stijfheid en afgifte van geneesmiddelen.
Introduction
Poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogelen vaak biomaterialen gebruikt in regeneratieve geneeskunde en drug delivery toepassingen 1-3. Deze hydrogels bieden aanzienlijke voordelen ten opzichte van andere biomaterialen. PEG hydrogelen kunststof, met een hoge mate van controle over technische eigenschappen zoals modulus en afbraaksnelheid vergelijking met hun natuurlijke tegenhangers biomateriaal 1. Als ze synthetisch zijn afgeleid PEG is aanzienlijk minder batch-to-batch variabiliteit versus natuurlijke afgeleide materialen 4. Door de chemische samenstelling van PEG hydrogelen die sterk hydrofiel, bestand tegen eiwitadsorptie en biocompatibele 3. Deze weerstand eiwit adsorptie kan PEG hydrogels om als blanco lei ", waardoor onderzoekers ondervragen en studie specifieke biologische of chemische factoren (drugs, biomoleculen, celadhesie peptiden enz.) en de specifieke rollen deze factors spelen in het controleren van cel-en / of weefsel gedrag.
Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 1: Voorbeelden van poly (ethyleenglycol) (PEG) architecturen A) lineaire PEG B) 4-arm PEG met een pentaerythritol kern C) 8-arm PEG met een hexaglycerol kern D) 8-arm PEG met een.... tripentaerythritol kern. n is het aantal PEG herhalingen aan elke arm. Elke herhaling een molecuulgewicht van 44 g / mol, derhalve n kan worden berekend uit het totale molecuulgewicht en de structuur / arm #.
PEG voorlopers zijn beschikbaar met verschillende architecturen en molecuulgewichten (Figuur 1 ). Het variëren van de architectuur (arm #) en ethyleenglycol herhalingen (n) van PEG kan worden gebruikt om eigenschappen van de hydrogel netwerken gevormd uit deze macromeren regelen. Ongemodificeerde PEG bevat eindstandige hydroxylgroepen die moet worden vervangen door een alternatieve functionaliteit om covalente verknoping via polymerisaties, de meest gebruikte verknopende strategie voor PEG hydrogelen, vóór de vorming van hydrogel netwerken. Er zijn verschillende chemische groepen die in PEG-macromeren kunnen worden opgenomen om polymerisatie en verknoping netwerk (acrylaat, methacrylaat, vinylether, norborneen, enz.) te vergemakkelijken. Ondanks de verscheidenheid aan terminal functionaliteiten om verknoping te vergemakkelijken, zijn er slechts twee mechanismen waardoor polymerisatie kan optreden: stap-en ketengroei (of een mengsel van beide, mixed-mode).
g2.jpg "width =" 600px "/>
Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2:.. Theoretische hydrogel netwerk schema A) Traditionele ketengroei polymerisatie resultaten in heterogene netwerken met dichte poly (methacrylaat) verknopen van regio's en betere netwerk nonidealities zoals lussen, gereageerde voorlopers, en permanente verwikkelingen B) Stap-groei polymerisatie resultaten in aanzienlijk homogeen netwerkstructuren (niet op schaal).
Functionaliteiten die verknopen via ketengroei polymerisatie niet de aanwezigheid van een extra vernettingsmiddel nodig. Echter,-keten gepolymeriseerd hydrogels produceren heterogeen netwerk structuren die dichte verknoping regio's (Figuur 2A) 1. In tegenstelling, stap-groei polymerisatie gesmeerdres het gebruik van een verknopingsmiddel of co-monomeer dat reactief is met de eindstandige functionele groepen van de PEG macromeren. Als de eindstandige functionele groepen op PEG alleen reageren met het verknopingsmiddel en het verknopingsmiddel kan alleen reageren met de eindstandige functionele groepen op PEG, dit resulteert in een grotere homogeniteit netwerkstructuur (figuur 2B) 1. Stap-polymerisaties ook typisch leiden tot hogere omzetting van functionele groepen, het verminderen van de hoeveelheid ongereageerd precursoren en potentieel immune / ontstekingsreacties door oplosbare, niet opgenomen macromeren 1. Gemengde modus polymerisatiewerkwijzen zijn ook ontwikkeld dat zowel stap-en ketengroei polymerisatie gecombineerd door het gebruik van macromeren die zowel zelf-reactie (ketengroei) en reageren met een verknopingsmiddel (stap-groei). Dit levert hydrogels met kenmerken van elke polymerisatie mechanisme en kan worden gebruikt om complexe, afwisselende netwerkstructuren produceren dan beidestief-of keten-groei netwerken alleen 1.
Hoewel er een overvloed aan functionele groepen die kunnen worden gebruikt om PEG functionaliseren en hydrogelvorming vergemakkelijken, methacrylaten en norbornenen zijn enkele van de meest voorkomende ketting-en stap-groei polymerisatie groepen, respectievelijk. Beide functionaliteiten bieden uitstekende spatiotemporal controle over het netwerk polymerisatie, en wanneer gebruikt om cellen in te kapselen, deze netwerken ondersteunen hoge totale cel overlevingskansen 5-7. Dimethacrylaat gefunctionaliseerde PEG (PEGDM) crosslink via ketenpolymerisatie en maakt de opname van biomoleculen of andere factoren door copolymerisatie met acrylaat-, methacrylaat-of soortgelijke gefunctionaliseerde biomoleculen 5,6. PEGDM hydrogels hebben belangrijke voordelen ten opzichte van alternatieve ketengroei polymerisatie systemen zoals acrylaat gefunctionaliseerde PEG (PEGDA). Met behulp van traditionele methoden, kan PEGDA sneller worden gesynthetiseerd dan PEGDM; however, met behulp van microgolf-geassisteerde synthese, PEGDM synthese is nog efficiënter. PEGDA vaak gesynthetiseerd nachts 8 of 24-uurs 9 reacties, maar kan ook worden gesynthetiseerd in vier uur bij verhoogde temperaturen 10. PEGDM wordt traditioneel ook gesynthetiseerd door reactie van 's nachts 11 of 24 uur 5, met een aantal methoden de reactie tijd te breiden tot 4 dagen 12. Met behulp van de microgolf-geassisteerde methode hier aangetoond, kan PEGDM worden geproduceerd in een 5 min reactie. Hoewel PEGDM heeft langzamer kinetiek dan PEGDA 13, de verknopingsreactie voor PEGDM nog snel, voorkomen in minuten en bereikt een grotere macromeer conversie dan PEGDA de verhoogde hydrofobiciteit van de methacrylaatgroep verhoogt functionele groep aggregatie in oplossing, waardoor de kans op toenemende radicale overdracht en omzetting van methacrylaat 14. PEGDM hydrogelen zijn ook geassocieerd met verhoogde cellulaire levensvatbaarheid en groeivergeleken PEGDA hydrogelen waarschijnlijk door de verminderingen reactiesnelheid op een bepaald moment, die radicaalconcentratie en ongereageerd macromeren onderhavige 14 vermindert. Thiol-polymerisaties zoals met-norborneen gefunctionaliseerde PEG (PEGN) vorm hydrogels via stap-groei polymerisatie en vereisen het gebruik van PEGN en een verknopingsmiddel dat een gemiddelde van meer dan twee functionele groepen bevatten. Aangezien thiyl radicalen reageren met norborneen koolstof-koolstof dubbele bindingen, multi-thiol bevattende crosslinkers worden vaak gebruikt om PEGN hydrogels verknopen, waardoor gemakkelijke opname van peptiden met cysteïne aminozuren functionaliteiten 7. Hoewel er tal van andere chemicaliën die via stap-groei polymerisatie reactie (Michael-additiereacties zoals thiol-acrylaat 15 en thiol-vinylsulfon 16, "Instructies" reacties zoals azide-alkyn 17 enz.), thiol-norborneen hydrogelen zeer vaak voor, omdat de stam vande norborneenring de reactiesnelheid aanzienlijk verhoogt en verlaagt de kans op de norbomeen dubbele binding ondergaan ketenpolymerisatie 7.
De beslissing tussen methacrylaat, norborneen, of alternatieve functionalisering aan hydrogelvorming vergemakkelijken is grotendeels gebaseerd op de aanpak. Bijvoorbeeld zijn ketengroei gepolymeriseerde PEGDM netwerken blijkt goed geschikt om cel lokalisatie beheersen de ontwikkeling van een tissue engineered periost 18,19. Stap groei gepolymeriseerd PEG netwerken zijn beter geschikt voor de opname van peptidesequenties enzymatisch-responsieve hydrogel degradatie vergemakkelijken, vanwege het gemak van opname van enzymsubstraat sequenties met thiol (cysteine) bevattende peptiden en gefunctionaliseerde norborneen macromeren 20. Indien de vraagstelling beste worden aangepakt door het gebruik van stap-groei hydrogels, Fairbanks et al.. Een gedetailleerde beschrijving van de norbornene functionaliseringsreacties strategie voor PEG 7. Dit document zal in detail hoe PEG en peptide sequenties kunnen worden gefunctionaliseerd (met een methacrylaat voor PEG, en een methacrylamide voor peptiden) voor ketenpolymerisatie reacties.
Traditioneel PEGDM wordt bereid door PEG met methacryloylchloride en triethylamine in dichloormethaan. De reactie wordt vooruitgang bij kamertemperatuur 11 gedurende 24 uur of 5, met een aantal methoden uitstrekkende reactietijd op 4 dagen 12 vóór filtratie, neerslaan in diethylether en collectie. Terwijl vele variaties van deze benadering bestaan allemaal tijdrovend, vereisen een grote reeks van chemische synthese apparatuur en zijn niet milieuvriendelijk daar het om het gebruik van relatief grote hoeveelheden van hoogzuiver reagentia en oplosmiddel. Om deze beperkingen te omzeilen, Lin-Gibson et al.. Een microgolf-geassisteerde, oplosmiddelvrije methode om PEG functionaliseren met te ontwikkelen rminal methacrylaatgroepen (figuur 3A) 12. In deze reactie, de terminale alcoholgroepen van PEG reageren met een van de atomen van de carbonyl methacrylzuuranhydride een carboxyl vormen. Dit genereert het PEGDM product, met methacrylzuur als een bijproduct. Deze synthese heeft veel van de kenmerkende voordelen van microgolf synthese, inclusief verminderde reactietijd en oplosmiddelvrije synthesemethoden 21. De magnetron synthese de voorkeur de eerder beschreven methoden is het beduidend sneller, vergt minder uitgebreid synthese apparatuur (bijv. glaswerk, reactieplaten) en gebruikt minder algemene reagens en oplosmiddel bedragen als oplosmiddelen alleen vereist voor productzuivering / verzamelen en niet synthese, waardoor het zuiniger en milieuvriendelijker.
0px "/>
Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3:. Functionalisering schema A) poly (ethyleenglycol) reageren met 10x molaire overmaat methacrylzuuranhydride aan poly (ethyleenglycol) methacrylaat B) Dezelfde methode kan worden gebruikt om de N-terminus van peptidesequenties functionaliseren produceren, die een. methacrylamide gefunctionaliseerde peptide. Door deze procedure voor het splitsen van het peptide van de hars, kan selectieve functionalisering van de N-terminus worden uitgevoerd zoals aminozuurzijketens groepen beschermd blijven. n: aantal PEG herhalingen in het macromeer (n = 45,5, 227 en 455 respectievelijk de 2, 10 en 20 kDa lineaire PEG gebruikt). R1 RN: aminozuurzijketens. PG1 naar PGN: zijketenbeschermende groepen. TFA: trifluorazijnzuur. TIPS: triisopropylsilaan. Dodt: 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol. H 2 O: water.
De microgolven methacrylation werkwijze is onlangs aangepast door onze groep aan het N-terminus van peptiden functionaliseren met methacrylamide groepen (figuur 3B) om peptide opname in een verscheidenheid van polymeren en polymere netwerken. In deze reactie, de primaire amine van de N-terminus van het peptide reageert met het carbonyl atoom op de methacrylzuuranhydride een amide. Dit genereert het methacrylamide gefunctionaliseerde peptide met methacrylzuur geproduceerd als een bijproduct. Bij deze procedure aan de N-terminus van peptidesequenties functionaliseren, is het belangrijk dat aminozuren met reactieve zijketens (primaire aminen (lysine), alcohol (serine, threonine) en fenolen (tyrosine)) worden beschermd tijdens functionalisering en beschermende groepen worden alleen gesplitst na methacrylamide oprichting.
Dit artikel zal beide microw tonenave-ondersteunde methoden om PEGDM synthetiseren en functionalize on-hars peptide sequenties, aandacht voor valkuilen en suggereren methoden voor probleemoplossing. In dit artikel zullen methoden om analytisch chemische technieken vaak gebruikt om product functionalizering beoordelen voeren gedetailleerd, en suggesties en middelen voor het uitvoeren van meer geavanceerde aanpassingen zal worden gegeven. Typische resultaten zal worden gedemonstreerd, waaronder het gebruik van de gesynthetiseerde PEGDM om hydrogel netwerken te vormen, het benutten van de gevormde hydrogelen tot het vrijkomen van een model drugscontrole, met gebruikmaking van gefunctionaliseerde peptiden naar cel-hydrogel interacties vergemakkelijken. Bijzondere aandacht zal worden besteed aan het karakteriseren hydrogelmaasgrootte en bespreken hoe hydrogel samenstelling kan worden afgestemd op deze onderliggende fysieke eigenschap, die op zijn beurt bulkmateriaal eigenschappen zoals stijfheid en geneesmiddelafgifteprofiel beïnvloeden.
Protocol
1. Microgolf-geassisteerde synthese van PEGDM
- Om besmetting met water te voorkomen, pre-droog al het glaswerk worden gebruikt in een oven (> 60 º C) gedurende 1 uur.
Opmerking: Vereist glaswerk omvat: twee 100-ml bekers, een bekerglas van 250 ml, 3 spatels, een 250-ml Büchner kolf, een 7-cm Büchner trechter, een 10-cm horlogeglas. - Pre-chill 100-150 ml watervrij diethylether (74,12 g / mol) voor neerslag vervolgens bij stap 1.6 uitgevoerd door gieten in een beker, die het bekerglas af met een horlogeglas, en het plaatsen van de beker in een herkristallisatie schotel gevuld met ijs. Verplaats magnetron en vortexer in een zuurkast.
Opmerking: Diethyl ether kunnen ook worden voorgekoeld door het bekerglas in een chemisch vriezer. De lagere diethylether bereikte temperatuur door koeling in een vriezer zal de snelheid en efficiëntie van de neerslag te verhogen. - In een kleine wegen boot, 5 g van poly (ethyleenglycol) (PEG) van de moleculairelar gewicht van uw keuze (1,000-100,000 Da).
- Indien aanwezig, verwijder het plastic stuk uit het deksel van de scintillatieflesje. Tarra het flesje, en afzien 10 molaire overmaat van methacrylzuuranhydride in de flacon (MA, 154,16 g / mol) per vergelijking 1 in de kap. Voeg PEG aan de scintillatieflesje.
(1)
waar
de massa van PEG in g 
het molecuulgewicht van PEG in g / mol, 
is het aantal eindstandige OH-groepen op PEG, en 
is de moleculairelar gewicht van MA in g / mol.
- Indien aanwezig, verwijder het plastic stuk uit het deksel van de scintillatieflesje. Tarra het flesje, en afzien 10 molaire overmaat van methacrylzuuranhydride in de flacon (MA, 154,16 g / mol) per vergelijking 1 in de kap. Voeg PEG aan de scintillatieflesje.
- Losjes draai de dop op de scintillatieflesje. Stel de magnetron 5 min op maximaal vermogen. Het dragen van hittebestendige handschoenen, verwijder de flacon uit de magnetron om de 30 sec.
- Volledig draai de dop aan en vortex gedurende 30 sec. Herhaal dit totdat de oplossing is zeer correct voor de volledige 5 minuten. De dop nodig heeft tijdens de procedure die moet worden vervangen als gevolg van het kraken.
- Met de dop los, laat de PEGDM afkoelen tot kamertemperatuur. Los de PEGDM in een kleine hoeveelheid (10-15 ml) dichloormethaan (DCM, 84,93 g / mol).
Opmerking: Het wordt aanbevolen de PEGDM kunnen afkoelen significant (~ 5 minuten) voordat DCM Bovendien, om koken van de DCM (a verdacht carcinogeen) voorkomen door restwarmte. De PEGDM kan worden opgesplitst in kleine stukjes met behulp van een spatel en gewerveld om te helpen bij het oplossen. - Neerslaan de PEGDM in 10x teveel ijskoude diethylether gedurende 20 minuten.
Opmerking: Het kan nodig zijn sc zijnRatch het bekerglas kant met een spatel kristalvorming initiëren lager gewicht PEG molecuulgewicht (2500 Da) neerslaan, maar PEG met een molecuulgewicht van minder dan 1000 Da niet neerslaan ondanks krabben. - Met behulp van een Büchner-trechter en kolf, verzamel de PEGDM door vacuümfiltratie. Filtreer niet volledig in, omdat dit water adsorptie zal promoveren naar de PEGDM.
Opmerking: Zo nodig voor het specifieke vacuümsysteem gebruikt, kan een vacuum val geplaatst tussen de filtratie installatie en de vacuümbron om de vacuümpomp te beschermen tegen schade door oplosmiddeldampen. - Breng de gefilterde PEGDM in een 50 ml conische buis met een grote naald doorboord door de kap voor ventilatie. Sla overnacht in een vacuümkamer te drogen.
- PEGDM opnieuw oplossen in DCM en reprecipitate (zoals in stappen 1.5-1.7) als laatste stap gereageerde MA verwijderen. Droog nogmaals zoals in stap 1.8.
(1) 
de massa van PEG in g 
het molecuulgewicht van PEG in g / mol, 
is de moleculairelar gewicht van MA in g / mol. 2. Karakterisering van PEGDM Functionalisering
- Met gedeutereerd chloroform (120,38 g / mol) als oplosmiddel, bereiden monsters voor 1H-NMR. Breng een klein monster van de PEGDM (≈ 10 mg) in een scintillatieflesje met een kleine hoeveelheid oplosmiddel (≈ 1,0 ml). Het doel concentratie 10 mg / ml.
- Zodra het monster wordt opgelost, overbrengen naar een schone NMR buis. Het monster dient de onderste 4-5 cm van de NMR-buis vullen.
- Verzamel de proton-NMR-spectra. De gegevens worden verzameld met behulp van een 400 MHz spectrometer. Run monsters bij kamertemperatuur gedurende ten minste 64 scans om voldoende gegevens resolutie te verkrijgen.
- Als NMR analyse (figuur 4) geeft PEGDM functionalisering minder dan 90%, moet de methacrylation worden herhaald. Stel de massa van MA gebruikt om rekening te houden met de verminderde hoeveelheid ongefunctionaliseerde PEG.
Opmerking: Het percentage van de PEG gefunctionaliseerde in PEGDM kan worden berekend uit de waargenomen: theoretische verhouding van terminal methacrylate protonen (a, b en c) de centrale PEG protonen (d) (figuur 4). Voor lineaire PEG, wordt het theoretische aantal centrale PEG protonen berekend door vergelijking 2:
(2)
waar 
het molecuulgewicht van de PEG g / mol en 
het molecuulgewicht van een PEG herhaling (44 g / mol). Voor lineaire PEG moet deze vergelijking worden aangepast aan de specifieke boomstructuur (figuur 1) reflecteren. Het percentage functionalisering kan dan worden berekend volgens vergelijking 3: 
(3)
waar is het waargenomen gebied onder de methacrylaat proton pieken (a, δ = 1,94 ppm, b en c, δ = 5,57 en 6,12 ppm), en
is het theoretisch aantal protonen methacrylaat (a = 3 * 
, B = 1 * en c = 1 * - 6, 2 en 2 respectievelijk lineaire PEG). Het percentage functionalisering berekening dient te worden uitgevoerd met pieken a, b en c afzonderlijk en averaged tot een algehele procent functionalizering verkrijgen.
Opmerking: Voldoende gefunctionaliseerde PEGDM kan vervolgens worden gedialyseerd (in water, tegen water) en verzameld door vriesdrogen om resterende methacrylzuuranhydride en methacrylzuur verwijderen. Het uiteindelijke product moet worden gemengd met een kleine hoeveelheid (0,01 gew%) remmer zoals citroenzuur of vitamine C en met droogmiddel bewaard bij -20 ° C tot gebruik. Het uiteindelijke PEGDM product kan worden gebruikt om hydrogels produceren, zoals beschreven in het artikel van Jupiter Khetan en Burdick 22.
3. Microgolven Functionalisering van On-hars Peptiden
Opmerking: De peptiden worden gesynthetiseerd met behulp van Fmoc-Gly-Wang-hars, met een geautomatiseerde peptide synthesizer met UV bewaking en 0,2 M aminozuur oplossingen in N-methylpyrrolidon (NMP, 99,1 g / mol). 5% piperazine (86,1 g / mol) in dimethylformamide (DMF, 73,1 g / mol) wordt gebruikt voor deprotectie, 0,5 M O-benzotriazol-N, N, N ', N'-tetramethyl-uronium-hexafluoro-fosfaat (HBTU, 379,3 g / mol) in DMF wordt gebruikt als activator en 2 M diisopropylethylamine (DIEA, 129.3 g / mol) in NMP wordt gebruikt als activator basis. Peptiden kunnen ook worden verkregen van een commerciële leverancier peptide. Bij het gebruik van commerciële bronnen is het essentieel dat peptiden worden verkregen on-hars met de aminozuur zijketen-beschermende groepen intact plaats volledig gesplitste, zoals gebruikelijk.
Opmerking: Het is belangrijk dat alle aminozuren met reactieve zijketens beschermd zodat methacrylamide functionalisering alleen optreedt bij het primaire amine van het N-uiteinde van de sequentie. Zie tabel 1 voor aminozuren met reactieve zijgroepen, en typische beschermende groepen. Aminozuren met beschermende groepen worden opgenomen in de sequentie tijdens peptidesynthese op dezelfde wijze als niet-beveiligde aminozuren, en zijn vaak verkrijgbaar bij dezelfde leveranciers aminozuur.
| Amino Acid | Reactieve groep | Beschermende groep |
| Lysine | Primaire Amine | tert-butyloxycarbonyl (Boc) |
| Serine | Primaire alcohol | tert-butyl (tBu) |
| Threonine | Secundaire Alcohol | tBu |
| Tyrosine | Fenol | tBu |
Tabel 1: Reactieve aminozuren en typische beschermende groepen.
- Synthetiseren peptiden onder toepassing van standaard vaste fase peptidesynthese en opslaan op hars bij 4 ° C in DMF tot aan gebruik.
- Met behulp van een 7 cm Büchner trechter met filtreerpapier en 250 ml fles, het verzamelen van de peptide hars van de DMF via filtratie.
- Indien aanwezig verwijder het plastic stuk uit het deksel van de scintillatieflesje. Breng het hars de scintillatieflesje. Met behulp van een disposable pipet, voeg net genoeg MA aan de hars in de scintillatieflesje dekken.
- Losjes plaatst de dop op de scintillatieflesje. Stel de magnetron 3 minuten op maximaal vermogen. Het dragen van hittebestendige handschoenen, verwijder de flacon uit de magnetron om de 15-20 sec.
- Volledig draai de dop aan en vortex gedurende 15 sec. Herhaal dit totdat de oplossing is zeer correct voor de full 3 min.
- Met de dop los, laat de peptide oplossing afkoelen tot kamertemperatuur. Met een kleine hoeveelheid DMF en een Büchner trechter met filtreerpapier en fles, verzamel de peptidehars van de flacon.
- Breng het peptide hars om een frisse scintillatieflesje en klieven en bescherming te ontdoen van de peptide.
- Per 0,25 mmol hars, gebruiken we een 2 uur bij kamertemperatuur reactie met rotatie, met een splitsing cocktail van 18,5 ml trifluorazijnzuur (TFA, 114,02 g / mol) met elk van triisopropylsilaan 0,5 ml (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) en gedeïoniseerd water (18.02 g / mol).
Opmerking: Deze cocktail is voldoende voor de meeste peptiden, maar niet ontschermen 2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf)-beschermde aminozuren (vaak gebruikt om arginine zijketens beschermen). Indien de sequentie bevat die Pbf-beschermde groepen dient 0,5 ml TFA vervangen door 0,5 ml thioanisool (124.20 g / mol) en splitsing tijd verhoogd tot 4 uur.
Opmerking: Als een bewolkte, kristallijne substantie vormen in de splitsing cocktail, wordt het peptide waarschijnlijk crashen uit de oplossing en het volume van de splitsing cocktail moet worden verdubbeld.
- Per 0,25 mmol hars, gebruiken we een 2 uur bij kamertemperatuur reactie met rotatie, met een splitsing cocktail van 18,5 ml trifluorazijnzuur (TFA, 114,02 g / mol) met elk van triisopropylsilaan 0,5 ml (TIPS, 158,36 g / mol), 3,6-dioxa-1 ,8-octanedithiol (Dodt, 182,30 g / mol) en gedeïoniseerd water (18.02 g / mol).
- Chill 400 ml watervrij diethylether op ijs in een beker bedekt met horlogeglas.
- Neerslaan van de peptide in 10x teveel diethylether, en verdeel de oplossing gelijkmatig onder vier 50 ml conische buizen. Centrifugeer bij 3200 xg gedurende 10 min aan het peptide verzamelen.
- Giet uit de ether, en resuspendeer de peptide in verse diethylether verdeeld over twee 50 m conisch 100 ml. Centrifugeer nogmaals proces opnieuw suspenderen in 50 ml verse ether tweemaal voor een totaal van 4 ether wasbeurten.
Opmerking: Dit verwijdert de chemische stoffen die bij de splitsing cocktail en gesplitst beschermende groepen van de vaste peptide.
- Giet uit de ether, en resuspendeer de peptide in verse diethylether verdeeld over twee 50 m conisch 100 ml. Centrifugeer nogmaals proces opnieuw suspenderen in 50 ml verse ether tweemaal voor een totaal van 4 ether wasbeurten.
- Na de laatste centrifugatiestap, decanteren het afval ethaar en droog het peptide nacht onder vacuüm.
4. Karakterisering van Peptide functionalisering
- Gebruik 50:50 H2O: acetonitril (41.05 g / mol) + 0,1% TFA als oplosmiddel voor MALDI-TOF analyse van peptide monsters. Plaats een klein monster (1-2 mg) van het peptide in een 1,5 ml eppendorfbuisje en los het monster in 1 ml MALDI oplosmiddel.
- Bereid de matrix oplossing. Een algemeen gebruikte matrix α-cyaan-4-hydroxykaneelzuur (CHCA, 189.2 g / mol) als de matrix. Los 10 mg / ml matrix MALDI oplosmiddel, waarbij een matrix stock oplossing.
Opmerking: De matrix voorraadoplossing worden opgeslagen bij kamertemperatuur gedurende maximaal een week aanvullende analyses. - Combineer het peptide en matrix oplossing in een 1:1 verhouding. Spot deze gecombineerde oplossing op drie afzonderlijke locaties op de MALDI monster plaat, het toevoegen van 1 pl / spot.
- Droog de plekken, hetzij door de lucht drogen of met behulp van een warmte kanon. Respot en droog elkemonster.
Opmerking: Respotting produceert een gelijkmatiger peptide / matrix monster, en helpt bij het verkrijgen van een duidelijk signaal. Een standaard peptide mix moet worden gecombineerd met de matrix oplossing in een 1:1 verhouding en gevlekte (eenmalig) op de MALDI plaat.
- Droog de plekken, hetzij door de lucht drogen of met behulp van een warmte kanon. Respot en droog elkemonster.
- Verzamel de MALDI-TOF-gegevens. Door de toevoeging van de methacrylamide-groep aan het N-uiteinde van het peptide, moet er een 68 g / mol toename van het molecuulgewicht boven dat van het peptide molecuulgewicht alleen.
Opmerking: In tegenstelling tot de PEGDM synthese kunnen peptiden niet refunctionalized, zoals na splitsing van de beschermende groepen van aminozuren met reactieve zijketens worden verwijderd, en de selectieve functionalisering van de N-uiteinden niet meer worden gegarandeerd.- Als de MALDI-analyse (figuur 5) geeft het peptide werd goed gefunctionaliseerd en alle beschermende groepen geschikt gesplitst, kan de peptide worden gedialyseerd (in water, tegen water) en verzameld door lyofilisatie remove residuele contaminanten (splitsing cocktail, ether, gesplitst beschermende groepen enz.). Het vaste peptide worden overgebracht naar een kleine Eppendorf buisje en opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik.
Representative Results
Proton nucleaire magnetische resonantie is een van de meest voorkomende analytische technieken om de efficiëntie van een chemische reactie te beoordelen, zoals het oppervlak onder elke piek spectra evenredig aan de relatieve niveaus van deze proton in het monster, waardoor de bepaling van de verhouding van product en reagens in het monster. Voor deze reactie kan 1H-NMR-analyse (figuur 4) worden gebruikt om het% functionalisatie van de waargenomen berekenen: theoretische verhouding van terminale methacrylaat protonen (a, b en c) de centrale PEG protonen (d). De in Figuur 4 PEGDM was 2.000 Da voor functionalisering, dus n = 2000 Da / (44 Da / PEG herhaling) = 45,5, zodat d = 4 * (n-1) = 178, waardoor de proton: NMR reductor 178 / 102,16 = 1,74. In dit geval kan een piek niet wordt dan beoordeeld% functionalisering, de aanwezigheid van water in het monster kunstmatig verhoogt het oppervlak van de piek. Met behulp van piek b, het% functionalisering is 1,00 * 1,74 / 2 * 100% = 87,1%; using piek c, het% functionalisering is 1,08 * 1,74 / 2 * 100% = 94,1%. Bijgevolg zal het% functionalisering is 91% en dit PEGDM adequaat gefunctionaliseerd voor gebruik in hydrogel synthese. Typisch, wordt ongeveer 90% functionaliseringsreacties bereikt na een enkele ronde van methacrylation.
Door de veelheid van proton pieken die zich in 1H-NMR-analyse van peptiden, peptide wordt functionalisering gemakkelijker onderzocht middels MALDI-TOF massaspectrometrie. Dit wordt aangetoond in figuur 5, waarbij het peptide GKRGDSG werd gesynthetiseerd en aan functionalisering methacrylamide. Een klein deel van het peptide werd gesplitst voor prefunctionalization molecuulgewicht beoordeling (figuur 5A), waaruit bleek het waargenomen molecuulgewicht piek optreedt bij 676 g / mol, het verwachte molecuulgewicht van het peptide, die de juiste synthese van de peptidesequentie. De rest van het peptide onderging methacrylamide functionelenisatie voorafgaand aan decollete. Omdat dit peptide Pbf beschermde R aminozuren, werd splitsing uitgevoerd in een cocktail met thioanisool 4 uur. Na methacrylamide functionalisering, het waargenomen molecuulgewicht piek treedt op bij 744 g / mol (figuur 5B), het verwachte gewicht van het methacrylamide gefunctionaliseerde peptide (676 68 g / mol) en niet op het verwachte molecuulgewicht van het gefunctionaliseerde peptide, die de juiste functionalisering.
Om de werking van zowel de PEG en methacrylamide gefunctionaliseerde peptide tonen, werden PEGDM hydrogels geproduceerd met en zonder 0,5 mM methacrylamide gefunctionaliseerd GKRGDSG (figuur 6). Hydrogelen werden gemaakt met 10 gew% lineair 10 kDa PEGDM in PBS met 0,05 gew% lithium fenyl-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) als fotoinitiator. De hydrogel voorloper oplossing werd geïnjecteerd tussen twee glasplaatjes gescheiden door een glasplaatje spacer en bij elkaar gehouden met bindmiddel clips. Precursor oplossing werd vervolgens blootgesteld aan 365 nm UV licht bij 2 mW / cm 2 gedurende 10 minuten verknoping induceren, waarna gels 8 mm werden verzameld met behulp van een cilindrische punch. Gels werden gespoeld in PBS en zwellen gedurende 2 dagen om te zorgen evenwichtzwelling voorwaarden werden bereikt 16,20. Menselijke MSCs (doorgang 3) werden gekweekt tot 80% confluentie en gezaaid op hydrogelen bij 15.000 cellen / cm 2. De cellen werden toegestaan te hechten gedurende 48 uur alvorens te worden overgebracht naar vers medium bevattende 0,5 ul / ml calceïne AM en 2 pl / ml ethidium homodimeer (Live / dead Levensvatbaarheid kit van Invitrogen) en afgebeeld onder fase contrast en fluorescentie bij 10x vergroting met een Nikon Eclipse Ti 2000. MSC's waren niet in staat zich te houden aan de ongefunctionaliseerd PEG hydrogelen (figuur 6A), maar na de opneming van de cel adhesie peptide RGD ze in staat waren om zich te houden aan en te verspreiden over de hydrogel oppervlak (figuur 6B). De live / DEAD beeldengepresenteerde de levensvatbaarheid van de gezaaide MSC populatie vormen zoals MSC's zijn adhesie-afhankelijke cellen die los van het gel oppervlak na de dood en tijdens media overdracht worden verwijderd, waardoor opblazen gezaaid cellevensvatbaarheid. In plaats daarvan zijn de fluorescerende beelden ter bakenen tussen hechtende cellen en kleine variaties in de hydrogel topologie, die alleen moeilijk onder fasecontrast. Interessant is dat de nonspread cellen gezaaid op enige PEG-gelen vlek positief voor zowel calceïne AM en ethidiumhomodimeer, wat aangeeft dat de cellen stierven bij de beeldvorming.
Een van de vele voordelen PEG hydrogelen is hun zeer afstembare aard. De specifieke samenstelling van de PEG hydrogel wijzigen onderzoekers biedt een hoge mate van controle over eigenschappen zoals modulus. Zoals getoond in fig. 7, zowel PEG molecuulgewicht (figuur 7A) en gewichtspercentage (
Hydrogels met ingekapselde runderserumalbumine (BSA) werden gevormd onder toepassing variërende molecular gewicht PEG (2, 10 en 20 kDa). Alle hydrogelen werden gemaakt met 10 gew% PEGDM in PBS dat 50 ug / ml BSA, zoals beschreven bij figuur 6. Gels werden geïncubeerd in 1 ml PBS bij 37 ° C en overgebracht naar vers PBS op elk tijdstip. Uitgebracht BSA werd gekwantificeerd met behulp van de Bradford assay van Thermo Scientific. Hydrogelmaasgrootte werd bepaald zoals beschreven voor Figuur 8. Zoals getoond in figuur 7A, BSA afgifte treedt sneller uit hydrogelen gevormd met hoger molecuulgewicht PEGDM als gevolg van de grotere maaswijdte in de hydrogel (figuur 10).
Figuur 4. Representatieve 1H-NMR van 2 kDa lineaire PEGDM gefunctionaliseerd met de microgolven methode. Procent functionalisering kan worden calculated op basis van de waargenomen:. theoretische verhouding van terminal methacrylaat protonen (a, b en c) naar het centrum van PEG protonen (d) Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 5. Representatieve MALDI-ToF peptide GKRGDSG (A) vóór en (B) na functionalisering met de microgolven methode. Merk op dat het waargenomen molecuulgewicht piek na functionalisering vindt plaats bij 744 g / mol, het verwachte gewicht van het methacrylamide gefunctionaliseerde peptide (676 68 g / mol) en niet op de verwachte molecuulgewicht van de niet-gefunctionaliseerde peptide (676 g / mol). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 6. Vertegenwoordiger fase contrast (links) en Live / DEAD (groen / rood) fluorescerende beelden (rechts) van MSC's gekweekt op A) PEG-gelen alleen en B) PEG-gelen die 0,5 mM methacrylamide gefunctionaliseerde GKRGDSG. MSC's zijn niet in staat zich te houden aan en verspreid over de PEGDA gels alleen, maar bij de oprichting van de cel adhesie peptide RGD, in staat zijn zich te houden aan en te verspreiden over de hydrogel oppervlak. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 7. A) PEG molecuulgewicht en B) gewichtspercentage PEG gebruikt om hydrogel netwerken vormen beïnvloedt hydrogelmaasgrootte (_8 ;) en de resulterende hydrogel stijfheid en afgiftesnelheid van ingekapselde geneesmiddelen. A) Toenemende PEG molecuulgewicht (links naar rechts) en constant gewichtspercentage vergroot hydrogelmaasgrootte, aflopend hydrogel stijfheid en verhogen van de snelheid van geneesmiddelafgifte. B) verlagen het gewicht percentage van PEG (links naar rechts) gebruikt om hydrogels vormen verhoogt hydrogelmaasgrootte, evenzo afnemende hydrogel stijfheid en het verhogen van de snelheid van afgifte van het geneesmiddel (niet op schaal). Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 8. A) Mesh schaalvergroting en B) hydrogel stijfheid neemt af met toenemend molecuulgewicht van de PEG-macromeer. N = 10, foutbalken = SEM, *** p &# 60; 0.001 door one-way ANOVA met Tukey HSD post-hoc test. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp Prism 5. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 9. A) Maaswijdte afneemt en B) hydrogel stijfheid toeneemt met toenemende gew% PEG. N = 9-10, foutbalken = SEM, ** p <0,01, *** p <0,001 door eenzijdige ANOVA met Tukey HSD post- hoc test. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 10. Vrijgave van encapsulated modelgeneesmiddel runderserumalbumine (BSA) uit hydrogels gevormd met 2 kDa, 10 kDa, 20 kDa molecuulgewicht PEG. BSA afgifte komt sneller uit hydrogelen gevormd met hoger molecuulgewicht PEGDM als gevolg van de grotere maaswijdte in de hydrogel . n = 6, error bars = SEM. Het% BSA model is significant verschillend (p <0,0001) tussen de drie groepen op elk tijdstip behalve t = 1 en 2,5 uur bij de afgifte uit de 2 en 10 kDa gels gelijkwaardig, twee-weg herhaalde metingen ANOVA met Bonferroni post-hoc test. Klik hier voor grotere afbeelding .
Discussion
De methoden eerder toegelicht zijn van onschatbare waarde voor de synthese van PEGDM en methacrylamide functionalisering van peptiden of andere amine bevattende verbindingen. Deze materialen kunnen vervolgens worden gebruikt voor regeneratieve geneeskunde en drug delivery toepassingen. Door de hydrofiele aard van PEG hydrogelen gevormd uit PEG-macromeren een hoog watergehalte vergelijkbaar met veel weefsels van het lichaam 2. Deze eigenschap maakt PEG zeer resistent tegen eiwitadsorptie en derhalve inert in het lichaam 3. Echter, de hygroscopische aard van PEG lastig te bewijzen tijdens functionalisering. Als er water aanwezig is in de PEG monster tijdens de methacrylation procedure, zal de methacrylzuuranhydride bij voorkeur met water reageren tot methacrylzuur produceren, en een slechte functionalisering van PEG zal leiden.
Daarom is een van de belangrijkste stappen die worden genomen om succesvolle methacrylation van de PEG of peptide ervoor te watervrij handhavenrous reactieomstandigheden. De aanbevolen stap van het drogen van al het glaswerk voor gebruik is bedoeld om watervervuiling te voorkomen. De aanwezigheid van water in het monster kan worden gezien in de NMR-analyse, als een brede piek bij 1,7 ppm (Figuur 4). Als slechte methacrylation wordt waargenomen, zelfs na drogen glaswerk, kan chemicaliën worden gedroogd over natriumsulfaat of andere droogmiddelen (moleculaire zeven, enz.) vóór gebruik. Destillatie kan ook worden gebruikt om water te verwijderen en te zuiveren methacrylzuuranhydride voor gebruik en azeotrope destillatie kan worden gebruikt drogen PEG 23. In extreme gevallen, synthese kan worden uitgevoerd in een dashboardkastje uitgevoerd om verder te zorgen voor adequaat watervrije omstandigheden. Een tweede ronde van methacrylation, volgens dezelfde procedure kan ook worden uitgevoerd om functionalisering verhogen. Omdat er altijd een kans dat bijkomende ronden van functionalisering is vereist, moet erop worden gelet bij stap 1.7 en 1.9 snel verzamelen PEGDM vacuümfiltratie. Vacuüm filtratie langer dan absoluut noodzakelijk verhogingen PEG blootstelling aan lucht, waardoor de mogelijkheid voor wateradsorptie.
Hoewel het percentage overmaat methacrylzuuranhydride hydroxyl functionele groepen blijft ongewijzigd en maakt de PEG functionalisering (bijv. arm #) de PEG precursor wordt algemeen geassocieerd met een daling in procenten functionaliseren bereikte (niet gepubliceerde resultaten, Benoit lab). Om preventief pakken deze vermindering van functionalisering efficiëntie, of als bepaalde moeilijkheden ondervonden bereiken voldoende hoog functionalisering, de duur van de microgolf reactie kan worden verhoogd, indien de microgolf interval wordt gehandhaafd op 30 sec. Terwijl 10 molaire overmaat is meestal voldoende, kan de hoeveelheid methacrylzuuranhydride in de reactie worden verhoogd tot het percentage functionalisering bereikte 12 verhogen.
Het is belangrijk dat deAanvullende precipitatiestap (1.9) worden uitgevoerd om goede NMR-signalen bereiken. Hoewel het verleidelijk om de tweede precipitatie dezelfde dag uitgevoerd als synthese, het drogen van het monster nacht voordat opnieuw neerslaan werd gevonden dat het verwijderen van overtollig methacrylzuuranhydride en methacrylzuur steun. Monstervoorbereiding is ook belangrijk voor het bereiken schone NMR spectra, en derhalve monster wordt bereid met de aanbevolen omstandigheden. Figuur 4 toont representatieve 1H NMR-resultaten kunnen gefunctionaliseerde PEGDM. Door het analyseren van de verhouding van de terminal methacrylaat protonen naar het centrum van PEG protonen, werd de PEGDM bepaald adequaat worden gefunctionaliseerde. MALDI monstervoorbereiding is eveneens belangrijk voor een duidelijke lezing bereiken. MALDI is bijzonder gevoelig voor de aanwezigheid van zouten en hoge monsterconcentraties. Indien een duidelijke MALDI lezen (een intensiteit boven de 50 willekeurige eenheden (au) met een hoge signaal: ruisverhouding) niet kan worden verkregen, het monster solution moeten 1:100 in MALDI oplosmiddel worden verdund en vervolgens worden gecombineerd met de matrix-oplossing en opnieuw geanalyseerd. Figuur 5 toont representatieve MALDI-TOF resultaten na correcte peptide functionalisering, decollete, en monstervoorbereiding. Splitsing van een klein monster hars voorafgaand aan functionalisering (figuur 5A) toont correcte synthese van het peptide GKRGDSG, correcte methacrylamide functionalisering van de in figuur 5B peptide.
Terwijl functionalisering van on-hars peptiden is een relatief deugdelijke procedure, de splitsing voorwaarden voor elke sequentie vereist vaak tuning. Voor lange sequenties waar veel aminozuren zijketens (> 30 aminozuren lang, of> 15 aminozuren met beschermende groepen) zijn beschermd, moet de duur van splitsing worden verhoogd met een uur. Indien splitsing tijd te veel wordt verlengd, kan peptidebinding splitsing ontstaan als gevolg van langdurige blootstelling aan zuur. MALDI ana lysis kan zeer nuttig zijn in het openbaren van eventuele fouten die zich in peptide synthese of decollete. Een waargenomen daling beneden wordt molecuulgewichten kunnen aangeven dat aminozuur (aminozuren) niet goed stel of peptide dat fractionering plaatsvond (zie Tabel 2 voor bronnen vaak waargenomen veranderingen in molecuulgewicht). Als het waargenomen molecuulgewicht hoger dan verwacht door het gewicht van een beschermende groep, is het waarschijnlijk dat splitsing en deprotectie was onvoldoende en het peptide worden recleaved extra tijd.
| Aminozuurdeletie | MW verandering (g / mol) | Ongesplitste Protecting Groups | x; "> MW verandering (g / mol)Gewoonlijk aanwezig Ionen | MW verandering (g / mol) | |
| Ala | -71 | Acetyl | +42 | Cl - | +35 |
| Arg | -158 | Allyl | 40 | K + | 39 |
| Asn | -114 | Alloc | 85 | Mg 2 + | <td style = "width: 64px;"> 24|
| Adder | -115 | Boc | 100 | Na + | +23 |
| Cys | -103 | Fmoc | +223 | ||
| Gin | -128 | OtBu | +56 | ||
| Glu | -129 | Pbf | 252 | ||
| Gly | -57 | tBu | +56 | ||
| Zijn | -137 | Trt | +242 | ||
| Ile | -113 | ||||
| Leu | DTH: 64px; "> -113|||||
| Lys | -128 | ||||
| Voldaan | -131 | ||||
| Phe | -147 | ||||
| -97 | |||||
| Ser | -87 | ||||
| Thr | -101 | ||||
| Trp | -186 | ||||
| -147 | |||||
| Val | -99 |
Tabel 2. Vaak waargenomen veranderingen peptide molecuulgewicht.
Macromeren geproduceerd met behulp van microgolven methacrylation werkwijzen kunnen worden gebruikt in een aantal van regeneratieve medicijnen of geneesmiddelafgifte toepassingen. De gefunctionaliseerde peptiden en PEGDM hier gesynthetiseerd kunnen in polymeren met nitroxide gemedieerde polymerisatie (NMP), atoomoverdrachtsradicaalpolymerisatie (ATRP) of Omkeerbare Addi worden opgenomentie-Fragmentatie Transfer (VLOT) methoden 24. Hydrogel netwerken kunnen ook worden geproduceerd in de aanwezigheid van cellen, zoals eerder in de Jupiter artikel aangetoond door Khetan en Burdick 22. Dit vereist vaak het opnemen van celadhesie zoals RGD peptiden of extracellulaire matrix moleculen PEG alleen biedt geen celmateriaal interacties essentieel voor overleving en functie van bepaalde celtypes 25. Peptiden, bijvoorbeeld, kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van traditionele vaste-fase peptidesynthese en gefunctionaliseerd zoals hier beschreven, zodat voor opname in hydrogel netwerken. Zoals gezien in figuur 6, opname van het met methacrylamide gefunctionaliseerde cel adhesie peptide GK RGDS G in hydrogelen (0,5 mM) bevordert adhesie van menselijke mesenchymale stamcellen (MSCs) PEG hydrogel oppervlakken, waardoor het aantal aangesloten en verspreiding cellen (Figuur 6B ), vergeleken met PEG hydrogelen zonder de cel adhesie peptide (
Toepassingen van hydrogel netwerken vereisen strakke controle over de eigenschappen van het materiaal. Een belangrijk voordeel van PEG hydrogelen is een hoge mate van controle over deze eigenschappen. Bijvoorbeeld, het molecuulgewicht, arm nummer, en de gewichts% PEG gebruikt bij de vorming van hydrogel netwerken worden gewijzigd fine-tune eigenschappen voor specifieke toepassingen. Dit maakt strakke controle hydrogelmaasgrootte (ξ), die hydrogel zwelverhouding (Q) en stijfheid (elasticiteitsmodulus E) regelt. Dit wordt geïllustreerd in figuur 7A en gekwantificeerd in figuur 8, waar toenemende PEG macromeer molecuulgewicht resulteert in een toename hydrogelmaasgrootte (Figuur 8A) en een afname van stijfheid hydrogel (figuur 8B).
De onderliggende fysieke eigenschap dat bulk gedrag besturingselementen in deze hydrogel netwerken, maaswijdte, wordt berekend volgens de Flory-Rehner vergelijking 16. Om deze berekening uit te voeren, wordt de volumetrische zwelverhouding (Q) eerst berekend uit vergelijking 4: 
(4)
waar ρ s dichtheid van water (1 g / ml), ρ p dichtheid van PEG (1,12 g / ml), M s is gezwollen massa van de hydrogel en M D wordt drooggewicht van het hydrogel (vaak gemeten na invriezen en vriesdrogen van hydrogels). Het molecuulgewicht tussen verknopingen (M c in g / mol) wordt dan berekend uit vergelijking 5: 
(5)
waarbij M N het aantal-gemiddelde MW PEG (in g / mol), 
is het volume van het polymeer 
, V1 is de molaire hoeveelheid water (18 ml / mol), V2 is het evenwicht polymeer volumefractie van de hydrogel
( 
) En X1 16. Het aantal bindingen tussen crosslinks (n) wordt dan berekend uit vergelijking 6: 
(6)
waarbij N b het aantal bindingen in de PEG herhaling (3) en M r de MW van de PEG repeat (44 g / mol) 27. Hierdoor kan de wortel van het gemiddelde kwadraat end-to-end afstand van de polymeerketen 
(In nm) te worden berekend uit vergelijking 7: 
(7)
waarbij L de gemiddelde lengte binding (0.146 nm, berekend op basis van CC en CO bindingslengten) en C n de karakteristieke verhouding van het polymeer (4.0 voor PEG) 28. FiNally, maaswijdte van de hydrogel kan worden berekend uit vergelijking 8: 
(8)
Hydrogel eigenschappen kunnen op soortgelijke wijze worden afgesteld door de hoeveelheid PEG gebruikt bij de vorming van hydrogels. Afnemende het gewichtspercentage PEG macromeer resulteert in een toename hydrogelmaasgrootte, die vervolgens vermindert hydrogel stijfheid. Figuur 7B illustreert en figuur 9 kwantificeert hoe het gewichtspercentage PEG in hydrogelvorming kan worden om maaswijdte (fig. 9A) en resulterende hydrogel stijfheid (figuur 9B). Als substraat stijfheid is aangetoond dat ze cel gedrag zoals stamcel differentiatie 29, de mogelijkheid streng te controleren stijfheid is een belangrijke eigenschap in hydrogel fabricage.
Hydrogels kunnen ook worden gebruikt om control drug delivery. Zoals getoond in figuur 7A en aangetoond in figuur 10, waardoor het molecuulgewicht van PEG macromeren vergroot maaswijdte van de hydrogel netwerk vervolgens verhogen van de afgifte van ingekapselde modelgeneesmiddel, runderserumalbumine (BSA). Terwijl hydrogel monsters in deze studie werden vernietigd op t = 195 uur om voor het meten van hydrogel natte en droge massa voor maaswijdte berekeningen, het is onze ervaring dat bleef BSA hoeveelheden zouden vrijkomen had de monsters werden gedurende langere perioden. De onvolledige afgifte van BSA waargenomen in figuur 10 is niet onverwacht, aangezien andere groepen ook gemeld dat BSA is tegen diffusie in PEG hydrogel netwerken 30. Onvolledige afgifte van ingekapselde eiwit kan optreden door waterstofbinding tussen eiwitten en PEG macromeren of covalente binding tussen de methacrylaatgroep op het PEG en primaire aminegroepen op lysineresten in BSA 31 (Figuur 2A), is het ook mogelijk dat een deel van de ingekapselde BSA in gebieden van de hydrogel die aanzienlijk kleinere mazen hebben formaat dan het algemene gemiddelde in de gel, waardoor de release. Terwijl onvolledig nonFickian afgifte (gegevens niet getoond) van ingekapseld BSA werd waargenomen in dit geval Fickian gereguleerde afgifte van talrijke andere model geneesmiddelen, zoals insuline en ovalbumine, is aangetoond met soortgelijk PEGDM hydrogels 30. Bovendien Watkins en Anseth hebben confocale laser scanning microscopie gebruikt om het vrijkomen van fluorescerende moleculen bij soortgelijke hydrogels aangetoond is acceptabel gemodelleerd met Fickian diffusie mijthods 32.
Terwijl de hydrogels gevormde studie afbreekbare, netwerk afbraak andere parameter die kan worden opgenomen in en afgestemd binnen deze netwerken. Zorgen voor een gereguleerde hydrogel afbraak kan leiden tot veranderingen in celgedrag 33, bevorderen van weefselgroei of gastheerweefsel ingroei of eliminatie van de noodzaak van explantatie 34. Afbreekbare PEG hydrogelen worden gewoonlijk gesynthetiseerd door ring-opening hydrolytisch afbreekbare d, l-lactide, glycolide of ε-caprolacton groepen op hydroxylgroepen in PEG vóór methacrylation 35. Deze drie groepen afgebroken door hydrolyse van de ester functionaliteit, waarbij de glycolide esters met de grootste gevoeligheid voor afbraak, gevolgd door lactide en caprolacton ester, vanwege hun verschillende hydrofobiciteit. Na verwerking van hydrolytisch afbreekbare groepen, kan PEG verder worden gefunctionaliseerd met de methacrylation procedure detailed in dit artikel, waardoor de vorming van hydrogel netwerken door middel van latere radicaal-geïnitieerde ketenpolymerisatie 36,37. De afbraaksnelheid van hydrogel netwerken kan worden geregeld door variatie van de identiteit van de hydrolytisch afbreekbare groep (glycolide, lactide, enz.) en door het variëren van het aantal herhalingen afbreekbare opgenomen in de structuur 35,38.
Theoretisch zou de methoden die hier getoond worden voor acrylering van PEG en peptiden door vervanging van de methacrylzuuranhydride met acryl anhydride in stappen 1.3 en 3.3, respectievelijk. Echter, acrylzuuranhydride meer dan 20 keer de kosten van methacrylzuuranhydride 39,40, waardoor microgolven acrylering aanzienlijk minder aantrekkelijk dan microgolven methacrylation.
Wij hebben een eenvoudige, snelle methode om functionaliseren PEG en peptiden, hoe de efficiëntie van deze werkwijze te evalueren aangetoond en gegeven middelen voor uzingen de gesynthetiseerde materialen om hydrogel netwerken te vormen. Deze synthetische tools zijn zeer veelzijdig in hun toepassingen, en moet een nietje in een aantal drug delivery en materialen onderzoekslaboratoria bewijzen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd deels gefinancierd door een Howard Hughes Med-in-Grad gemeenschap (AVH), van start-up fondsen van de Universiteit van Rochester en de Orthopedische Research and Education Foundation / Spier-Transplantatie Stichting (open-ended vastgoedfondsen verstrekt aan dr. Danielle Benoit / MTF). De auteurs willen graag Dr James L. McGrath bedanken voor het gebruik van zijn apparatuur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | D2649 | CAS 14970-87-7 |
| Acetonitrile | J.T. Baker | UN1648 | CAS 75-05-8 |
| Amino Acids | AAPPTech | Glycine: AFG101 | CAS 29022-11-5 |
| Arginine: AFR105 | CAS 154445-77-9 | ||
| Asparagine: AFD105 | CAS 71989-14-5 | ||
| Serine: AFS105 | CAS 71989-33-8 | ||
| Anhydrous diethyl ether | Fisher Scientific | UN1155 | CAS 60-29-7 |
| Citric acid | Sigma Aldrich | C1857 | CAS 77-92-9 |
| Deuterated chloroform | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-7-100 | CAS 865-49-6 |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | UN1593 | CAS 75-09-2 |
| Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A1181 | CAS 7087-68-5 |
| Dimethylformamide | Fisher Scientific | D119-4 | CAS 68-12-2 |
| Fmoc-Gly-Wang resin | Peptides International | RGF-1301-PI | 100-200 mesh size |
| Methacrylic anhydride | Alfa Aesar | L14357 | CAS 760-93-0 |
| N-Methylpyrrolidone | VWR | BDH1141-4LG | CAS 872-80-4 |
| On-resin peptides | Synthesized in-house | On-resin peptides can also be purchased from Peptides International, GenScript, AAPPTec, etc. | |
| O-Benzotriazole-N,N,N’,N’-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate | AnaSpec Inc | 510/791-9560 | CAS 94790-37-1 |
| Peptide Calibration Standard | Care | 206195 | |
| Piperazine | Alfa Aesar | A15019 | CAS 11-85-0 |
| Poly(ethylene glycol) 2 kDa linear | Alfa Aesar | B22181 | CAS 25322-68-3 |
| Poly(ethylene glycol) 10 kDa linear | Alfa Aesar | B21955 | |
| Poly(ethylene glycol) 20 kDa linear | Sigma Aldrich | 81300 | JenKem Technologies USA is an alternate supplier of linear and multi-arm PEG |
| Thioanisole | Alfa Aesar | L5464 | CAS 100-68-5 |
| Trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | CAS 76-05-1 |
| Triisopropylsilane | Alfa Aesar | L09585 | CAS 6485-79-6 |
| α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid | Tokyo Chemical Industry Co, LTD | C1768 | CAS 28166-41-8 |
References
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG Hydrogels for the Controlled Release of Biomolecules in Regenerative Medicine. Pharm. Res. 26, 631-643 (2009).
- Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Review: Photopolymerizable and degradable biomaterials for tissue engineering applications. Tissue Eng. 13, 2369-2385 (2007).
- Peppas, N. A., Hilt, J. Z., Khademhosseini, A., Langer, R. Hydrogels in biology and medicine: From molecular principles to bionanotechnology. Adv. Mater. 18, 1345-1360 (2006).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat. Biotechnol. 23, 47-55 (2005).
- Benoit, D. S., Durney, A. R., Anseth, K. S. The effect of heparin-functionalized PEG hydrogels on three-dimensional human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Biomaterials. 28, 66-77 (2007).
- Benoit, D. S., Collins, S. D., Anseth, K. S. Multifunctional hydrogels that promote osteogenic human mesenchymal stem cell differentiation through stimulation and sequestering of bone morphogenic protein 2. Adv. Funct. Mater. 17, 2085-2093 (2007).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of Poly(Ethylene Glycol) Diacrylate Hydrogels with Biomolecules to Regulate and Guide Endothelial Morphogenesis. Tissue Eng. A. 15, 579-585 (2009).
- Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23, 4315-4323 (2002).
- Yanez-Soto, B., Liliensiek, S. J., Murphy, C. J., Nealey, P. F. Biochemically and topographically engineered poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomimetic characteristics as substrates for human corneal epithelial cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 101A, 1184-1194 (2013).
- Benoit, D. S. W., Anseth, K. S. Heparin functionalized PEG gels that modulate protein adsorption for hMSC adhesion and differentiation. Acta Biomater. 1, 461-470 (2005).
- Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5, 1280-1287 (2004).
- Anseth, K. S., Wang, C. M., Bowman, C. N. Reaction Behavior and Kinetic Constants for Photopolymerizations of Multi(Meth)Acrylate Monomers. Polymer. 35 (94), 3243-3250 (1994).
- Bencherif, S. A., et al. End-group effects on the properties of PEG-co-PGA hydrogels. Acta Biomater. 5, 1872-1883 (1016).
- Rydholm, A. E., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Degradable thiol-acrylate photopolymers: polymerization and degradation behavior of an in situ forming biomaterial. Biomaterials. 26, 4495-4506 (2005).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically Degradable Poly(Ethylene Glycol) Hydrogel Scaffolds with Tunable Degradation and Mechanical Properties. Biomacromolecules. 11, 1348-1357 (2010).
- Malkoch, M., et al. Synthesis of well-defined hydrogel networks using Click chemistry. Chem. Commun. , 2774-2776 (2006).
- Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Emerging Ideas: Engineering the Periosteum: Revitalizing Allografts by Mimicking Autograft. , (2012).
- Hoffman, M. D., Xie, C., Zhang, X., Benoit, D. S. The effect of mesenchymal stem cells delivered via hydrogel-based tissue engineered periosteum on bone allograft healing. Biomaterials. , (2013).
- Hubbell, J. A., Lutolf, M. P., Raeber, G. P., Zisch, A. H., Tirelli, N. Cell-responsive synthetic hydrogels. Adv. Mater. 15, 888-892 (2003).
- Lidstrom, P., Tierney, J., Wathey, B., Westman, J. Microwave assisted organic synthesis - a review. Tetrahedron. 57, 9225-9283 (2001).
- Khetan, S., Burdick, J. Cellular encapsulation in 3D hydrogels for tissue engineering. J. Vis. Exp. (32), e1590 (2009).
- Antonios, M., Kurtis, K., Lucas, K. Drying poly(ethylene glycol). Nat. Protoc. Exchange. , (2012).
- Nicolas, J., Mantovani, G., Haddleton, D. M. Living radical polymerization as a tool for the synthesis of polymer-protein/peptide bioconjugates. Macromol. Rapid Comm. 28, 1083-1111 (2007).
- Nuttelman, C. R., Benoit, D. S. W., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. The effect of ethylene glycol methacrylate phosphate in PEG hydrogels on mineralization and viability of encapsulated hMSCs. Biomaterials. 27, 1377-1386 (2006).
- Hern, D. L., Hubbell, J. A. Incorporation of adhesion peptides into nonadhesive hydrogels useful for tissue resurfacing. J. Biomed. Mater. Res. 39, 266-276 (1998).
- Andreopoulos, F. M., Beckman, E. J., Russell, A. J. Light-induced tailoring of PEG-hydrogel properties. Biomaterials. 19, 1343-1352 (1998).
- Merrill, E. W., Dennison, K. A., Sung, C. Partitioning and Diffusion of Solutes in Hydrogels of Poly(Ethylene Oxide). Biomaterials. 14, 1117-1126 (1993).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. J. Biomed. Mater. Res. A. 90A, 720-729 (2009).
- Mellott, M. B., Searcy, K., Pishko, M. V. Release of protein from highly cross-linked hydrogels of poly(ethylene glycol) diacrylate fabricated by UV polymerization. Biomaterials. 22, 929-941 (2001).
- Watkins, A. W., Anseth, K. S. Investigation of molecular transport and distributions in poly(ethylene glycol) hydrogels with confocal laser scanning microscopy. Macromolecules. 38, 1326-1334 (2005).
- Anseth, K. S., Benoit, D. S. W., Durney, A. R. Manipulations in hydrogel degradation behavior enhance osteoblast function and mineralized tissue formation. Tissue Eng. 12, 1663-1673 (2006).
- Hillwest, J. L., et al. Prevention of Postoperative Adhesions in the Rat by in-Situ Photopolymerization of Bioresorbable Hydrogel Barriers. Obstet. Gynecol. 83, 59-64 (1994).
- Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Hubbell, J. A. Bioerodible Hydrogels Based on Photopolymerized Poly(Ethylene Glycol)-Co-Poly(Alpha-Hydroxy Acid) Diacrylate Macromers. Macromolecules. 26, 581-587 (1993).
- Skaalure, S. C., Milligan, I. L., Bryant, S. J. Age impacts extracellular matrix metabolism in chondrocytes encapsulated in degradable hydrogels. Biomed. Mater. 7, 024111-0210 (2012).
- Hoffman, M. D., Benoit, D. S. Agonism of Wnt-beta-catenin signalling promotes mesenchymal stem cell (MSC) expansion. J. Tissue. Eng. Regen. Med. , (2013).
- Sawhney, A. S., Pathak, C. P., Vanrensburg, J. J., Dunn, R. C., Hubbell, J. A. Optimization of Photopolymerized Bioerodible Hydrogel Properties for Adhesion Prevention. J. Biomed. Mater. Res. 28, 831-838 (1994).
- Methacrylic Anhydride [Internet]. , Available from: https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=AAAL14357-18 (2013).
- Acrylic Anhydride [Internet]. , Available from: http://www.polysciences.com/Catalog/Department/Product/98/productid--40/ (2013).
